Bài giảng Các kỹ thuật PCR và ứng dụng

1CÁC KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG2Giáo viên hướng dẫn:PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI	Sinh viên thực hiện:	LÊ THỊ THÚY DUNG3NỘI DUNGI. ĐẶT VẤN ĐỀII. TỔNG QUANIII. KẾT LUẬNIV. TÀI LIỆU THAM KHẢO4I. ĐẶT VẤN ĐỀPCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA trong ống nghiệm mơ phỏng bộ máy sinh tổng hợp DNA của tế bào sống. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau.Chính nhờ PCR mà ngày nay, sinh học phân tử đã làm được những bước tiến nhảy vọt trong mọi lãnh vực. 5II. TỔNG QUANA. Phương pháp PCR 1. Định nghĩaPhương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà khơng qua tạo dịng. Kỹ thuật PCR cĩ thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đốn, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phơi, giải mã di truyền62. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuơn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuơn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này.7Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau : Nguyên tắc phản ứng PCR (nguồn Andy Vierstraete, 1999)83. Các thành phần trong test tubeTaq polymerasedNTPPrimer ( mồi )DNA mẫuBuffer 94.Ứng dụngPhát hiện Clostridium perfringens ở bị bằng PCRC. perfingens sản xuất nhiều loại độc tố: alpha, beta, epsilon, và iota được nhĩm vào năm loại A, B, C, D, E. và độc tố Alpha được sản xuất bởi tất cả các chủng và tham gia vào sinh bệnh. Người ta sử dụng PCR bằng cách sử dụng bộ mồi để phát hiện sự hiện diện của gen mã hĩa chất độc alpha.10Vật liệu và phương phápChuẩn bị mẫu (1 đến 5 khuẩn lạc C. perfringens lấy từ BHI blood agar cultures)Ly trích DNAPhản ứng PCRĐiện diPhân tích và chụp ảnh dưới tia UVMồi oligonucleotide Alpha toxin gen5’ GCT AAT GTT ACT GCC GTT GACC 3’ và 3’ TCT GAT ACA TCG TGT AAG 5’11 Kết quảTổng cộng cĩ 89 chủng C. perfringens được định type sử dụng PCR. Gen mã hĩa alpha-toxin (cpa) đã được phát hiện (loại A ATCC 3624) và trong tất cả các chủng được phân lập12Các ứng dụng khác nhưNhân bản vơ tính với PCR.Phát hiện các khiếm khuyết geneĐịnh type các mơPhát hiện các vi sinh vật gây bệnhRecombinant PCR.Kỹ thuật footprinting DnaseI.HLA DNA (các kháng nguyên bạch cầu người)13B. Phương pháp RT-PCR 1. Phương phápRT- PCR là một phương pháp dùng để khuyếch đại cDNA được tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã ngược. RT- PCR thường được sử dụng để tạo ra thư viện cDNA (complementary DNA) lớn từ một lượng rất nhỏ mRNA, sử dụng trong việc nhận biết các đột biến và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc định lượng mức độ phân tử của gene.Ngồi ra, RT- PCR cịn cĩ một ứng dụng quan trọng nữa đĩ là chúng được sử dụng trong việc chẩn đốn các bệnh do virus RNA.14Target RNA SequencecDNA2. Nguyên tắcPCR Step 1 - 	Biến tínhPCR Step 2 - 	Bắt cặp giữa Primer và mạch đơn của cDNAPCR Step 3 - 	rTth DNA Polymerase xúc tác kéo dài chuỗi Cuối chu kỳ 1- 	Hình thành 2 đoạn cDNA (Amplicon) 	tương ứng với chuỗi mẫu ban đầu.cDNA PrimercDNA PrimerrTth DNA PolymerasecDNA Amplicon132415 3. Ứng dụngChẩn đốn bệnh lở mồm long mĩng ở gia súc	Lở mồm long mĩng là một bệnh virus cấp tính lây lan rất nhanh ở động vật. Mới đây, Viện Thú y quốc gia (Bộ NN&PTNT) kết hợp cùng Viện Cơng nghệ sinh học (Trung tâm Khoa học tự nhiên & cơng nghệ quốc gia) đã nghiên cứu thành cơng phương pháp chẩn đốn bệnh mới bằng kỹ thuật sinh học phân tử giúp người chăn nuơi sớm phát hiện và phịng trừ bệnh kịp thời cho vật nuơi.16Nguyên liệu và phương pháp Phương pháp tạo RT- PCR gồm 5 bước khác nhau:	- Tách chiết ARN từ bệnh phẩm biểu mơ 	- Tạo ADN bằng phản ứng sao chép ngược	- Gây phản ứng bằng PCR với các cặp mồi	- Kiểm tra sản phẩm	- Tách dịng và giải trình trình tự sản phẩm.17Kỹ thuật RT- PCR cho phép phát hiện bệnh ngay trong giai đoạn đầu tiên.Phương pháp RT- PCR cho biết type gây bệnh thuộc loại gì và phân biệt được sự khác biệt biến chủng cĩ trong bệnh phẩm đã xác định cĩ cùng một type huyết thanh.RT- PCR nhận biết được bệnh nhanh như vậy vì nhờ việc kết hợp PCR với cặp mồi 1F/1R khả năng xác định các type O, A, C và ASIA- 1 gây bệnh của virus lở mồm long mĩng.18Ngồi ra cịn cĩ các ứng dụng như:Chẩn đốn các loai virus ARN như virus dịch tả heo (Hog Cholera – Classical Swine Fever), Chẩn đốn virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp (PSSR)Phát hiện virus cúm H5N1 bằng RT-PCR (Theo WHO – 2007) 19C. Phương pháp Real time PCR1. Định nghĩa	Kỹ thuật Real time PCR là một phương pháp khuếch đại gene và đọc kết quả được thực hiện đồng thời trong cùng một ống hay một giếng mẫu. 202. Nguyên tắc Hệ thống Real time PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính.→ Real-Time PCR cho biết kết quả lượng DNA hình thành ở từng thời điểm trong suốt tiến trình phản ứngReal time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành.21FluorImagerMolecular Dynamics7700Applied BiosystemsFluorTrackerStratagenereal-timereal-time PCRhardware223. Ưu điểm của Real-time PCRNhanhCho phép theo dõi tiến trình phản ứng và biết được lượng DNA đã tạo thành ở từng thời điểm.Khơng cần điện di >>> tiến hành được nhiều mẫu (gần 200 mẫu/ngày).Hạn chế tạp nhiễm.Độ nhạy cao (3pg DNA).Lượng mẫu biến động (10-1010 copies).Độ lặp lại cao (CV < 2,0%).4. Vấn đề đối với Real-time PCRKhơng phân biệt được tác nhân gây bệnh cịn sống hay chếtĐịi hỏi kỹ năng Thiết bị235. Ứng dụngKỹ thuật Real time PCR chẩn đĩan sớm HIV trên trẻ em Phương pháp: 	Kỹ thuật real time RT PCR thực hiện trên gene LTR (theo ANRS protocol)Mẫu bệnh phẩm:	Huyết thanh của nhĩm trẻ được chẩn đốn HIV (+) và nhĩm trẻ HIV(-) ở Campuchia (n=226) và Việt Nam (n=38) 	145 trẻ em gái và 119 trẻ trai	Độ tuổi từ 1-28 tháng, độ tuổi trung bình 7,2 tháng)242526 Độ đặc hiệu và độ nhạy tốt so vơí kỹ thuật kinh điển: kỹ thuật nested DNA PCR, RT PCR và kỹ thuật bDNA)Nguỡng phát hiện : 400 cp/mL*, kỹ thuật thực hiện trên 200 μl huyết thanh.Khơng cần giai đoạn sau khuếch đạiĐộ lặp lại cao Đơn giảnNhanhGiá thành rẻ27D. Multiplex PCR1.  Giới thiệuPhản ứng multiplex PCR là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thơng thường, ở đĩ hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng. 282. Nguyên tắc292. Ứng dụng2.1. Multiplex-PCR phát hiện và định type HSV	Herpes sinh dục là một bệnh do virus Herpes Simplex HSV1 và HSV2 gây nên nhưng chủ yếu là HSV2. Là bệnh cấp tính lây truyền qua đường tình duc. Các xét nghiệm như Tzanck smear cĩ thể thấy Tế bào đa nhân khổng lồ. HSV-Multiplex-PCR: Sử dụng hỗn hợp 3 primers, cho kết quả dương tính và cĩ thể phân biệt được type1 hay type 2 qua độ dài sản phẩm PCR: HSV-1 cĩ độ dài 503bp và HSV-2 cĩ độ dài 435bp. Hoặc HSV - PCR riêng biệt cho mỗi type HSV-1 cho sản phẩm 395bp và HSV-2 cho sản phẩm 302bp.  302.2. Chẩn đốn bệnh rối loạn tiêu hĩa ở dêSự phát hiện bằng kháng thể kết hợp kháng nguyên bệnh rối loạn tiêu hĩa.HLA typing sử dụng multiplex PCR và phát hiện với biosensors.31E. Nested PCR1. Định nghĩa:Nested PCR là một dạng thay đổi của PCR thường, trong đĩ hai cặp mồi PCR được dùng để khuếch đại đoạn DNA.Phản ứng nested PCR phải được thực hiện hai lần. Lần đầu, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi thứ 1,sau đĩ cặp mồi thứ 2 sẽ bắt cặp phía trong của sản phẩm PCR lần 1 và khuếch đại đoạn gen cần xác định.322. Nguyên tắc333. Ưu điểm Tăng tính đặc hiệu Tăng độ nhạy Nested PCR áp dụng trong trường hợp cĩ rất ít mẫu gốc4. Nhược điểm lớn nhất của nPCR là gia tăng mức độ tạp nhiễm trong quá trình chuyển mẫu giữa hai lần chạy PCR. Tuy nhiên cĩ thể khắc phục bằng cách cải tiến chạy nPCR trong một ống.345. Ứng dụng Sử dụng nested PCR để phát hiện virus lở mồm long mĩng trên amidan của trâu bị bị giết mổ với biểu hiện lâm sàng bình thường xuất hiên ở Iran35Vật liệu và phương phápMẫuAmidan được lấy từ 2 bị bản xứ ( giống Bos taurus và giống Bos indicus), Phân tách RNA RT-PCR Phân tích thống kê Kết quả nested PCR 5’-GGC CTC ACC AGA GAA AATCA-3’ 3’- TAG AGC CAT GAC AGA CAG TG-5’ 5’-CGC TCT TCC ACA TCT CTG GT-3’3’-CCA CAA GCT GAA GGA CCC T-5’ 36Kết quả Fig. 1. Nested-PCR for detection of FMD viral genome in tonsil tissue samples. M: DNA molecular marker (Ladder 100).Lane 1-5: Amplification of a 222 bp DNA fragment in positive tonsil tissue samples.Lane 6: Negative control.37III. KẾT LUẬNDo các ứng dụng cực kỳ to lớn và kỳ diệu trong mọi lĩnh vực, PCR đã thật sự làm được một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử trong thời điểm hiện nay. 38IV. TÀI LIỆU THAM KHẢONguyễn Ngọc Hải, 2007, Cơng Nghệ Sinh Học Trong Thú Y, NXB Nơng NghiệpSinhhocvietnam.com ĩa luận tốt nghiệp, HỒNG TUẤN DŨNG niên khĩa 2003 – 2007, ẢNH HƯỞNG CỦA NẤM GLOMUS sp. VÀ BỐN MỨC PHÂN LÂN ĐẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN BẮP C919 VÀ XÁC ĐỊNH NẤM CỘNG SINH MYCORRHIZA BẰNG KỸ THUẬT PCR.ÁM ƠN SỰ THEO DÕI CỦA THẦY VÀ CÁC BẠN