Bài giảng PCR trong chuẩn đoán phân biệt các Aubtype AIV Type A - Phạm Thái Thành

LOGO
PCR TRONG CHUẨN ĐOÁN PHÂN 
BIỆT CÁC SUBTYPE AIV TYPE A
Phạm Thành Thái
Nội dung
1. Giới thiệu về AIV type A
2. Phương pháp chuẩn đoán
LOGO
Giới thiệu về 
Avian Influenza Virus Type A
 AIV thuộc họ Orthomyxoviridae. Có đường kính vỏ
0,08-0,12 μm; nhân là chuỗi RNA đơn. Họ
Orthomyxoviridae gồm có 4 nhóm virus là:
 Nhóm virus type A: gây bệnh cho mọi loài chim, 1
số động vật có vú và cả con người.
 Nhóm virus cúm type B: chỉ gây bệnh cho người.
 Nhóm virus cúm type C: gây bệnh cho người, lợn.
 Nhóm Thogotovirus.
Tên gọi
Cấu tạo AIV
Các kháng nguyên bên trong (proreins M1 và NP) là các proteins đặc hiệu nhóm
được dùng để xác định xem virus thuộc type A, B hay C.
Các kháng nguyên bên ngoài (HA và NA) đa dạng hơn và là các kháng nguyên
có tính đặc hiệu subtype.
Jorge Duitama et al, 2009
Phân loại AIV
 Cúm gia cầm độc lực thấp (LPAI) xảy ra tự nhiên ở các loài
chim. Bệnh không biểu hiện triệu chứng hoặc rất nhỏ. Những
dòng virus này ít gây nguy hiểm cho sức khỏe con người.
Dòng LPAI H5 và H7 có khả năng biến chủng thành HPAI.
 Cúm gia cầm độc lực cao (HPAI): sau 10 ngày tiêm nhiễm
cho gà, AIV phải làm chết 75-100% phôi gà thực nghiệm.
Sau khi phân lập từ gà bệnh, AIV phát triển tốt và gây bệnh
tích tế bào trong môi trường nuôi cấy không có trypsin. Đối
với chủng H5 và H7 nếu mọc tốt trên môi trường không có
trypsin, trình tự acidamine trùng với trình tự acidamine của
chủng độc lực cao thì được xác định là chủng độc lực cao.
Tái tổ hợp gene ở AIV
Y. Guan, 2002
Nếu 2 chủng virus cúm đồng thời xâm
nhiễm cùng 1 tế bào thì có thể xảy ra
hiện tượng tái tổ hợp gene (genetic
recombination); khi đó sẽ tạo ra các
virus mới có các kháng nguyên kết hợp
Sự thay đổi genotype của H5N1 từ khi phát
hiện vào năm 1997 đến năm 2001. Tám đoạn
gene của AIV được xếp theo thứ tự từ trên
xuống PB2, PB1, PA, HA, NP, M, và NS.
Các chủng virus: H9N2; H6N1; H5N1;
H9N2/ Y280; và H5N11/97. (?) là genotype
AIV chưa từng được phân lập từ gia cầm ở
Hong Kong.
Subtype AIV type A
 H1N1
 H5N1
 H2N2
 H3N2
 H7N2
 H7N3
 H7N7
 H9N2
LOGO
Phương pháp chuẩn đoán
subtype AIV type A
Dennis A. Senne
LOGO
RT-PCR
• Cơ quan hoặc mô (não, khí quản, phổi,)
• Các loại dịch (phổi, họng, mũi,)
• Huyết thanh
Thu mẫu bệnh
phẩm
• Sử dụng các Kit như: NucleoSpin RNA II, 
Rneasy MiniKit,Tách chiết RNA
• PCR buffer, MgCl2, dNTP, Primer, Rtase,
Chuẩn bị mẫu
chạy RT-PCR
• Tùy theo primer sử dụng mà có chu trình
nhiệt khác nhauChạy RT-PCR
• Trên gel agrose, hoặc real time,Đọc kết quả
Chuẩn đoán H5N1
WHO, 2007
rRT-PCR
Đây là phương pháp rất nhanh, 28 mẩu bệnh phẩm đã được kiểm tra trong
khoảng 3h.
Giới hạn phát hiện của cặp M primer là 103 gene copies. Cả hai cặp primer H5 
và H7 đều có giới hạn phát hiện là 103 đến 104 gene copies
Erica Spackman et al, 2002
Một nghiên cứu nhằm xác định subtype H5 và H7, tác giả đã sử dụng các
cặp primer và probe sau
rRT-PCR
Một nghiên cứu khác trên subtype H5, H7 và H9
G. Cattoli, I. Monne. 2008
rRT-PCR
G. Cattoli, I. Monne. 2008
mRT-PCR
 Trong nghiên cứu này, Pitirat Boonsuk và cs (2008) đã phát triển
kỹ thuật Multiplex RT-PCR trong việc phát hiện các subtype H1,
H3 va ̀ H5 của AIV type A.
mRT-PCR
 A.Kết quả điện di trên gel agarose với mẫu H1, H3 và H5; Mix
và chứng âm (N)
 B.Kết quả kiểm tra độ nhạy phương pháp.
mRT-PCR
 Kết quả kiểm tra độ chuyên biệt.
Multiplex RT – nested PCR
 Phương pháp này được nghiên cứu để phát hiện AIV type
A subtype H1N1 và subtype H3N2 và AIV type B.
Multiplex RT – nested PCR
 Độ nhạy của phương pháp: đối với H1N1 thì giới hạn phát hiện là
200pfu/ml, H3N2 là 14 pfu/ml và AIV type B là 4,5 pfu/ml. Trong
khi đó độ nhạy của phương pháp one-step PCR là 1,1-2,1x103.
LOGO
Tài liệu tham khảo
 Erica Spakman et al, 2002. Development of a Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assay for A Influenza Virus
and the Avian H5 and H7 Hemagglutinin Subtupes. Journal of Clinical Microbiology, Vol. 40 (9): 3256-3260.
 Giovanni Cattoli, Isabella Monne, 2009. Ilaria Capua, Dennis J. Alexander(Ed). In: Avian Influenza and
Newcastle Disease – A Field and Laboratory Manual. Milan, Italy. 87-112
 Jorge Duitama et al, 2009. PrimerHunter: a primer design tool for PCR-based virus subtype indentification.
Nucleic Acids Research, Vol. 37 (8): 2483-2492.
 Pitirat Boonsuk et al., 2008. Detection of Influenza Virus Types A and B and Type A subtypes (H1, H3, and H5)
by Multiplex Polymerase Chainzreaction. Tohoku J.Exp. Med., 215, 247-255.
 Patrick J Gavin, Richard B Thomson, Jr. 2003. Review of Rapid Diagnostic Tests for Influenza. Clinical and
Applied Immunology Reviews, 4 (2003), 151 – 172.
 Song, Man Ki, Jun Chang, Yeongjin Hong, Sunghoi Hong, and Suhng Wook Kim. 2009. Direct Multiplex Reverse
Transcription-Nested PCR Detection of Influenza Viruses Without RNA Purification. J. Microbiol. Biotechnol.
 G. Cattoli, I. Monne, 2008. Real time RT-PCR (rRT-PCR) Detection of Avian Influenza subtype H5, H7, H9.
Validation Dossier.
 WHO. 2007. Recommendations and laboratory procedures for detection of avian influenza A (H5N1) virus in
specimens from suspected human cases.
 Y. Guan et al, 2002. Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR.
PNAS. Vol 99 (3): 8950-8955.
LOGO