Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương - Chương II, Bài 3: Các phương pháp lai phân tử - Ninh Thị Thảo
Tóm tắt Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương - Chương II, Bài 3: Các phương pháp lai phân tử - Ninh Thị Thảo: ... lai có mang các DNA mạch đơn Bổ sung chất “khóa” màng lai Phần màng lai không mang DNA được phủ bằng chất “khóa” màng lai Mẫu dò được phủ trên toàn bộ màng lai nhưng chỉ liên kết với các DNA bổ sung Bổ sung mẫu dò Màng lai sau khi rửa Mẫu dò chỉ còn có mặt ở tr...ằng phóng xạ tự ghi Vị trí không lai Bước1: chuẩn bị RNA mẫu. Bước 2: Chuyển RNA lên màng lai - Chạy điện di - Chuyển RNA lên màng lai Bước 3: Lai RNA với mẫu dò Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai. Các bước tiến hành 8/26/2014 18 LAI WESTERN • Lịch sử − Phương p...háng thể và phát hiện Gel Bọt biển Giấy thấm Màng Giấy thấm Bọt biển Cực âm Cực dương 8/26/2014 25 Cố định màng 1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện Sau khi sử dụng hệ thống chuyển ...
CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen Các phương pháp lai phân tử Phương pháp PCR, ứng dụng Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 8/26/2014 1 BM CNSH TV – Khoa CNSH Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế bổ sung (Complementarity) Các dạng phức hợp lai bổ sung: – DNA - DNA – DNA - RNA – Protein – Protein (thường ở dạng phức hợp kháng nguyên – kháng thể) CƠ SỞ KHOA HỌC Lai giữa các nucleic acid 8/26/2014 2 Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai mạch đơn DNA hoặc DNA- RNA. Cơ sở của việc lai phân tử là các mối liên kết hydro giữa các base trên hai mạch. Giữa một base A và một base T (hoặc U) hình thành hai liên kết hydro còn giữa G và C hình thành ba liên kết. LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID (DNA – DNA hoặc DNA – RNA) Lai giữa các nucleic acid T A C G U A 8/26/2014 3 LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID (DNA – DNA hoặc DNA – RNA) 8/26/2014 4 • LAI SOUTHERN (DNA – DNA) • LAI NORTHERN (DNA – RNA) • LAI WESTERN (PROTEIN – PROTEIN) MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI PHÂN TỬ 8/26/2014 5 So sánh sự phân tích gene X sử dụng các kỹ thuật lai Southern, Northern và Western 8/26/2014 6 • Lịch sử – Do Edwin Southern đề xuất năm 1975 và sau đó được tiếp tục hoàn thiện. – Với sự phát triển của kỹ thuật này, Southern đã nhận được giải thưởng Lancaster trong lĩnh vực Y học vào năm 2005. LAI SOUTHERN Edwin Southern 8/26/2014 7 LAI SOUTHERN • Nguyên lý – Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa 2 phân tử DNA mạch đơn (DNA-DNA) – Cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự nucleotide trên một đoạn DNA nào đó trong một hỗn hợp các đoạn DNA khác nhau dựa trên sự bắt cặp của mẫu dò đã được đánh dấu với đoạn DNA chứa trình tự bổ sung với mẫu dò đó. • Kỹ thuật lai Southern cho biết – Sự có mặt của đoạn DNA (gen) – Số lượng đoạn DNA có mặt (tương ứng với số gen) – Độ lớn của đoạn DNA – Trình tự tương tự giữa đoạn DNA mục tiêu và mẫu dò 8/26/2014 8 Các bước tiến hành Bước1: Chuẩn bị DNA mẫu. Bước 2: Chuyển ssDNA lên màng lai (giai đoạn này gồm nhiều bước) Bước 3: Lai ssDNA với mẫu dò Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai. 8/26/2014 9 1 2 3 Mẫu nghiên cứu 3 Marker 1 Đối chứng 2 Bước 1: Chuẩn bị DNA mẫu 8/26/2014 10 Membrane DNA Gel Buffer Gel Membrane Giấy thấm Bước 2: Chuyển DNA mạch đơn lên màng lai 8/26/2014 11 Màng lai có mang các DNA mạch đơn Bổ sung chất “khóa” màng lai Phần màng lai không mang DNA được phủ bằng chất “khóa” màng lai Mẫu dò được phủ trên toàn bộ màng lai nhưng chỉ liên kết với các DNA bổ sung Bổ sung mẫu dò Màng lai sau khi rửa Mẫu dò chỉ còn có mặt ở trạng thái liên kết bổ sung với DNA Bước 3: Lai phân tử 8/26/2014 12 Các đoạn bổ sung với mẫu dò xuất hiện như các vạch băng Màng mang phân tử lai giữa mẫu dò và DNA Phim X-quang được đặt trên màng lai cho đến khi sự phát xạ từ mẫu dò được ghi lên phim Bước 4: Thu kết quả 8/26/2014 13 Kết quả lai hiện lên phim nhờ phóng xạ tự ghi Bước 4: Thu kết quả 8/26/2014 14 8/26/2014 15 LAI NORTHERN • Lịch sử − Được phát triển vào năm 1977 bởi James Alwine và George Stark tại Stanford University. − Phát triển từ kỹ thuật lai Southern và được ứng dụng cho phân tích RNA 8/26/2014 16 LAI NORTHERN • Nguyên lý – Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa DNA và RNA – Phương pháp lai Northern Blot là phương pháp lai RNA của tế bào với mẫu dò DNA. Các bước tiến hành cũng tương tự như phương pháp Southern blot. • Phương pháp này cho biết – Sự có mặt của mRNA trong mô – Mức độ thể hiện của gen – Độ lớn của mRNA – Trình tự tương đồng giữa đoạn mục tiêu và mẫu dò 8/26/2014 17 (E) Vị trí xảy ra lai RNA-DNA Phân tách RNA theo kích thước nhờ chạy điện di Mẫu RNA Khay chứa dung dịch đệm Giá đỡ Tập giấy thấm Khoảng trống Màng lai Vật nặng Giấy thấm Đặt màng lai lên trên gel, đặt giấy thấm, vật nặng lên trên. RNA di chuyển lên màng lai nhờ mao dẫn Bổ sung mẫu dò phóng xạ mạch đơn Túi lai Ghi nhận kết quả bằng phóng xạ tự ghi Vị trí không lai Bước1: chuẩn bị RNA mẫu. Bước 2: Chuyển RNA lên màng lai - Chạy điện di - Chuyển RNA lên màng lai Bước 3: Lai RNA với mẫu dò Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai. Các bước tiến hành 8/26/2014 18 LAI WESTERN • Lịch sử − Phương pháp này được thực hiện đầu tiên ở phòng thí nghiệm của George Stark ở Stanford. Kỹ thuật này đã được W. Neal Burnette đặt tên là Western blot (1981), nối tiếp theo tên Southern blot. 8/26/2014 19 LAI WESTERN • Nguyên lý – Lai Western Blot được thực hiện giữa các protein với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể • Phương pháp này cho biết – Sự thể hiện của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô – Mức độ thể hiện của gen – Độ lớn của protein 8/26/2014 20 1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện Các bước tiến hành 8/26/2014 21 Chuẩn bị mẫu 1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện 8/26/2014 22 Chuẩn bị mẫu Tách chiết protein Hòa tan và biến tính protein Protein ở dạng cấu trúc 2' and 3' thường không tích điện âm xử lý với SDS (sodium dodecyl sulfate) để bọc protein với điện tích âm 8/26/2014 23 Chạy điện di SDS-PAGE 1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện Cực âm Cực dương 8/26/2014 24 Chuyển protein lên màng 1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện Gel Bọt biển Giấy thấm Màng Giấy thấm Bọt biển Cực âm Cực dương 8/26/2014 25 Cố định màng 1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện Sau khi sử dụng hệ thống chuyển protein lên màng, màng sẽ chứa các protein ở vị trí giống như vị trí của chúng ở trên gel. Màng được ủ với các protein “khóa” (thường sử dụng BSA hoặc sữa bột) để “khóa” những khoảng trống trên màng tránh kháng thể bám vào khoảng trống của màng. 8/26/2014 26 Ủ với kháng thể và phát hiện 1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện 8/26/2014 27 Ủ với kháng thể 1: trong 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm ở 4oC. Kháng thể 1 gắn với kháng nguyên đặc hiệu. Các kháng thể không liên kết với kháng nguyên thì được rửa đi. Màng được ủ với kháng thể thứ 2, kháng thể này nhận biết và chỉ bám vào kháng thể 1. Kháng thể này liên kết với một phân tử cho phép chúng ta phát hiện được vị trí liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên – kháng thể trên màng. Ủ với kháng thể và phát hiện Ủ với kháng thể 2: trong 1-3 giờ ở nhiệt độ phòng. 8/26/2014 28 Một số phương pháp phát hiện khác • Phát hiện nhờ tạo màu • Phát hiện nhờ quang hóa học • Phát hiện nhờ phóng xạ • Phát hiện nhờ phát huỳnh quang 8/26/2014 29 HRP Cơ chất VD: Hydrogen peroxide + luminol 3-aminophtalate (nhạy với ánh sáng) Kháng nguyên nằm trên màng Kháng thể 1 Kháng thể 2 Ủ với kháng thể và phát hiện Sự phát hiện nhờ phát quang hóa học 8/26/2014 30 Tóm tắt quy trình thực hiện Western blot Chuẩn bị mẫu protein Chạy điện di SDS-PAGE phân tách các phân tử protein theo kích thước Chuyển protein lên màng lai Màng lai mang các phân tử protein có vị trí giống như trên bản gel Xử lý BSA hoặc sữa bột để “khóa” chỗ trống trên màng lai Màng lai được xử lý với kháng thể 1, kháng thể này bám đặc hiệu vào kháng nguyên (protein) mục tiêu Màng lai được xử lý với kháng thể thứ 2 mang phân tử giúp nhận biết sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Kháng thể này liên kết với kháng thể 1. Bổ sung cơ chất (hoặc không cần), phát hiện vị trí lai giữa kháng nguyên – kháng thể 8/26/2014 31 So sánh 3 phương pháp lai Kỹ thuật Gel Phân tử Phát hiện Southern agarose DNA nucleic acid Northern agarose RNA nucleic acid Western polyacrylamide Protein Kháng thể 8/26/2014 32
File đính kèm:
- bai_giang_cong_nghe_sinh_hoc_dai_cuong_chuong_ii_bai_3_cac_p.pdf