Bài giảng Kỹ thuật bảo quản tế bào - Phan Lữ Chính Nhân

KỸ THUẬT 
BẢO QUẢN TẾ BÀO
ThS. Phan Lữ Chính Nhân
PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc
• Bảo quản ở nhiệt độ trên -130oC 
• Bảo quản ở nhiệt độ dưới -130oC
• Đông khô
ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO
• Trữ ở nhiệt độ dưới -130oC
• Tế bào ở dạng huyền phù
• Tế bào dừng phân chia và các hoạt 
động trao đổi chất
MỤC ĐÍCH
• Giảm chi phí nuôi cấy và duy trì tế bào đồng thời bảo 
quản nguồn tế bào dự phòng
– Tiết kiệm thời gian và hóa chất
– Là cách thức thay thế cho việc nuôi cấy nhiều nguy cơ gây 
chết tế bào 
• Giảm sự thay đổi hay mất các đặc tính của tế bào
– Giảm nguy cơ biến đổi di truyền
– Ngăn sự già yếu tế bào
– Ngăn quá trình biến đổi tế bào
DỤNG CỤ - THIẾT BỊ ĐÔNG LẠNH
Nitơ lỏng
– Không màu, không mùi, không dễ cháy, không độc
– Nhiệt độ -196oC (thể lỏng) và -156oC (thể hơi)
Thiết bị trữ lạnh
– Tủ lạnh (4oC), tủ âm (-20oC, -80oC)
– Thiết bị trữ lạnh bằng Nitơ lỏng (-196oC)
Không kiểm soát nhiệt độ
Có kiểm soát nhiệt độ (Nicool)
DỤNG CỤ - THIẾT BỊ ĐÔNG LẠNH
Bể ổn nhiệt
Nhiệt độ trong bình trữ nitơ lỏng
• Cryotube (cryovial, ampoule)
NGUỒN TẾ BÀO
• Loại/khả năng sống, tăng trưởng/sinh lí/số 
lượng/phương pháp tế bào được nuôi
• Giai đoạn tốt nhất (log phase)
• Chỉ đông lạnh những tế bào tăng sinh tốt và 
không nhiễm
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN 
ỨNG CỦA TẾ BÀO ĐỐI VỚI MÔI TRƯỜNG 
ĐÔNG LẠNH
1. Thể tích (V) và diện tích bề mặt tế bào (A)
2. Tính thấm nước của tế bào (Lp)
3. Loại và nồng độ chất bảo quản lạnh
4. Tốc độ làm lạnh (B)
CÁC BƯỚC BẢO QUẢN LẠNH
• Tế bào và mô tiếp xúc với chất bảo quản (bước 
cân bằng)
• Làm lạnh mẫu xuống nhiệt độ âm
• Trữ ở nhiệt độ dưới -130oC
• Làm ấm và giải đông
• Pha loãng và loại bỏ các chất bảo quản lạnh trước 
khi tái nuôi cấy
CÁC BIẾN ĐỔI TRONG QUÁ TRÌNH 
ĐÔNG LẠNH
• Sự hình thành tinh thể nước đá 
• Độ thẩm thấu của môi trường đông lạnh 
• Tốc độ khử nước 
• Sự giảm thể tích của tế bào 
• Sự giảm hoạt động của enzyme
• Độ pH của dung dịch
• Sự hình thành bọt khí
SỰ HÌNH THÀNH TINH THỂ NƯỚC ĐÁ
• Nhiệt độ ở thời 
điểm biến đổi giai 
đoạn
• Tốc độ làm lạnh
• Thành phần các 
chất hoà tan trong 
dung dịch.
• Nồng độ dung dịch
4 yếu tố quyết định kiểu hình tinh thể nước đá
ĐỘ THẨM THẤU CỦA MÔI TRƯỜNG 
ĐÔNG LẠNH
Sự hình thành đá 
Nồng độ chất hòa tan tăng
Áp suất thẩm thấu tăng
TỐC ĐỘ KHỬ NƯỚC
- Tính thấm nước của màng 
tế bào
- Năng lượng hoạt hóa của 
tính thấm nước
- Tỉ lệ diện tích bề mặt / thể 
tích của tế bào
SỰ GIẢM THỂ TÍCH CỦA TẾ BÀO
- Tính thấm nước của màng tế bào và năng lượng hoạt hóa của tính thấm
- Tốc độ làm lạnh
- Thực tế và tính toán?
HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME
- Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc vào năng 
lượng hoạt hóa của các phân tử phản ứng.
- Giảm 
- Tác hại đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt động 
của các protein – Vai trò của chất bảo vệ. 
ĐỘ pH DUNG DỊCH
• Giảm theo nhiệt độ
• Cân bằng acid-baz
+ Chất bảo vệ lạnh
Glycerol: tính baz yếu
DMSO: tính baz mạnh
Propanediol, methanol
+ Nồng độ chất bảo vệ lạnh
• Sự phù hợp về nhiệt độ và pH
SỰ HÌNH THÀNH BỌT KHÍ
• Khi nhiệt độ hạ, tinh thể đá tạo các lỗ rò rỉ
• Khi giải đông, hình thành bọt khí.
• Kích thước bọt khí: 25-100 micron, tỉ lệ nghịch 
với tốc độ làm lạnh
• Số lượng bọt khí tỉ lệ thuận với tốc độ làm lạnh
• Ảnh hưởng của hệ đệm bicarbonate
MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH
• Hepes
• Huyết thanh
• Kháng sinh
• Muối
• Đường
• Chất bảo quản lạnh
CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH
• Khái niệm 
• Đặc tính 
• Phân loại
+ Chất bảo quản ngoại bào: BSA, FBS, saccharide, disaccharide 
(trehalose, lac, suc), trisaccharide (raffinose), polymer (PVP, 
polyethylenglycol)
+ Chất bảo quản nội bào: methanol, ethanol, ethylen glycol, 1,2-
isopropandiol, glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO)
• Tác dụng
CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH
Hoạt động: khử nước và bù nước
Nồng độ thích hợp?
A. Quá trình đông lạnh
B. Quá trình tan đông
C. Quá trình bù nước
D. Quá trình tái nuôi cấy
Khối lượng tế bào của phôi tương ứng 
trong quá trình đông lạnh
CHẤT PHỤ TRỢ ĐÔNG LẠNH
- Không thấm vào tế bào
- Bảo vệ tế bào trong quá trình bù nước
- Thường là mono-,di- hoặc tri-saccharide
A. Quá trình đông lạnh
B. Quá trình tan đông
C. Quá trình bù nước khi 
có đường Sucrose
D. Tái nuôi cấy
Khối lượng tế bào phôi tương ứng trong quá 
trình đông lạnh có sucrose
MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH VÀ KIỂU 
TẾ BÀO
TẾ BÀO BÁM DÍNH TẾ BÀO Ở DẠNG HUYỀN 
PHÙ
90% môi trường mới
10% chất bảo quản lạnh 
(DMSO)
45% môi trường mới
45% môi trường cũ
10% chất bảo quản lạnh 
(DMSO)
PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH
• Đông lạnh chậm
• Đông lạnh nhanh
• Phối hợp đông lạnh nhanh và chậm
• Đông lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa)
ĐÔNG LẠNH CHẬM
(Làm lạnh cân bằng)
• Sử dụng chất bảo quản với nồng độ thấp (1-2M)
• Tốc độ làm lạnh chậm (0,1 – 1,0oC/phút)
• Hạ nhiệt tự động
• Sự khử nước diễn ra suốt quá trình làm lạnh
• Cân bằng giữa tốc độ nước rời khỏi tế bào và 
nước chuyển sang dạng đá
• Chi phí cao, tổn thương tế bào do tác động của 
nồng độ chất tan.
ĐÔNG LẠNH NHANH
• Nồng độ chất bảo quản thấp
• Tốc độ làm lạnh nhanh
• Hạ nhiệt: ba bước
• Khử nước không hoàn toàn, hình thành đá 
nội bào
ĐÔNG LẠNH PHỐI HỢP NHANH 
VÀ CHẬM
• Giai đoạn 1: làm lạnh chậm đến -20oC
• Giai đoạn 2: làm lạnh nhanh đến -196oC
ĐÔNG LẠNH CỰC NHANH
(THỦY TINH HÓA)
• Nồng độ chất bảo quản cao (>5M)
• Tốc độ làm lạnh cực nhanh (2000-25000oC/phút)
• Tế bào bị khử nước nhờ tiếp xúc với nồng độ chất 
bảo quản cao, nước ở dạng băng vô định hình
• Có thể ảnh hưởng đến tế bào do nồng độ chất bảo 
quản cao
• Quy trình thực hiện dễ dàng, nhanh chóng, chi phí 
thấp
BIẾN ĐỔI CỦA TẾ BÀO 
QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH KHÔNG CHẤT BẢO QUẢN
QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH KHÔNG CHẤT BẢO QUẢN
QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH CÓ CHẤT BẢO QUẢN
QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH CÓ CHẤT BẢO QUẢN
ĐÔNG LẠNH TỐI ƯU 
• Tỉ lệ tế bào sống cao nhất
• Phương pháp 
– Làm lạnh chậm để rút nước ra khỏi tế bào
– Ngăn sự hình thành tinh thể
– Sử dụng chất bảo quản lạnh 
– Nhiệt độ bảo quản dưới -130oC
– Giải đông nhanh để giảm thiểu sự hình thành của 
tinh thể
QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO
1. Kiểm tra tình trạng tế bào
2. Bảo dưỡng và thu nhận tế bào
3. Sử dụng chất bảo vệ lạnh phù hợp
4. Sử dụng dụng cụ trữ phù hợp với điều kiện đông lạnh
5. Đánh dấu
6. Điều chỉnh tốc độ làm lạnh
7. Trữ tế bào ở nhiệt độ dưới -130oC
8. Thường xuyên kiểm tra mức nitơ lỏng
9. Ghi nhận định kì
KIỂM TRA TÌNH TRẠNG TẾ BÀO 
– Tình trạng tốt nhất (log phase, mật độ 90%)
– Quan sát bên ngoài
– Kiểm tra nhiễm
+ Nuôi trong MT không kháng sinh vài lần trước kiểm tra
+ Quan sát trực tiếp dưới KHV
– Thay môi trường nuôi 24 tiếng trước khi đông lạnh
Loại môi trường cũ
Huyền phù vào môi trường đông lạnh
Tách tế bào
Li tâm thu cặn tế bào Đếm mật độ tế bào
Bổ sung vào dụng cụ đông lạnh
Đưa vào nhiệt độ đông lạnh phù hợp
Giải đông ở 37 C
Loại môi trường bảo quản
Tái nuôi cấy trong môi trường mới
ẢNH HƯỞNG CỦA QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH 
ĐẾN TẾ BÀO
Hiện tượng Phản ứng của tế bào
Giảm nhiệt độ Biến đổi lipid màng
Giải trùng hợp bộ xương tế bào
Tăng nồng độ chất hòa tan Co thẩm thấu
Tăng nồng độ ion Tác động trực tiếp lên màng tế bào, làm hòa 
tan protein màng
Khử nước Mất ổn định lớp đôi lipid
Kết tủa muối Không rõ
Sự hình thành bọt khí Tổn thương cơ học đối màng và bộ xương 
tế bào
Dung dịch trở nên quá nhớt Hạn chế quá trình khuếch tán, thẩm thấu
Thay đổi pH Biến tính protein
Tế bào bị đặc lại Tổn thương màng
GIẢI ĐÔNG
• Rã đông nhanh 
- 37oC trong bể ổn nhiệt
- Giảm thiểu sự hình thành tinh thể 
• Pha loãng từ từ để ngăn sốc áp suất thẩm thấu
• Quá trình bù nước của tế bào 
• Loại chất bảo quản lạnh:
+ Thay, ủ trong môi trường mới
+ Li tâm nhẹ
QUY TRÌNH GIẢI ĐÔNG
• Lấy các ống đông lạnh tế bào ra khỏi bình nitơ lỏng.
• Kiểm tra cẩn thận các nhãn và nắp.
• Giữ ống đông lạnh ngoài không khí khoảng 30 giây.
• Đặt toàn bộ ống đông lạnh nhúng vào bình ổn nhiệt 370C và lắc 
nhẹ cho đến khi tan hết.
• Rửa tế bào bằng li tâm dịch tế bào đã giải đông trong môi trường 
nuôi mới.
• Tái huyền phù tế bào trong môi trường mới.
• Trải các tế bào vào đĩa nuôi cấy với môi trường bình thường. 
Nồng độ tế bào ban đầu phải cao từ 2-3x10.000 tế bào/cm2.
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TẾ BÀO 
SAU GIẢI ĐÔNG
• Nhuộm xác định số lượng tế bào sống, 
chết
• Nuôi cấy sau giải đông
• Sức sống tế bào sau giải đông: tăng sinh
CÁC VẤN ĐỀ KHI ĐÔNG LẠNH 
TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
1. Trong quá trình thu nhận và thao tác tế bào
+ Sự tiếp xúc giữa tế bào và chất bảo quản lạnh
+ Sự duy trì lượng lớn tế bào ở nhiệt độ phòng và pH 
2. Trong quá trình làm lạnh
+ Làm lạnh quá nhanh, quá chậm hay bị gián đoạn
+ Sử dụng chất bảo quản lạnh không phù hợp hay sử dụng nồng độ không 
thích hợp
3. Trong quá trình trữ lạnh
+ Quá trình chuyển tế bào vào bình trữ lạnh
+ Nhiệt độ đông lạnh không được duy trì ổn định
4. Trong quá trình giải đông 
+ Giải đông chậm
+ Phương pháp loại chất bảo quản lạnh không phù hợp