Bài giảng Sinh học phần tử - Chương 8: Các kỹ thuật phân tích trong sinh học phân tử - Nguyễn Hữu Trí

 các nucleic acid di chuyển trong ống
và đến vị trí có tỉ trọng bằng với tỉ trọng
của chính nó sẽ ngừng lại và hình thành
một lớp cố định trong ống. Lớp này được
thu nhận lại sau ly tâm.
Tách chiết DNA
4RNA tổng số
•Messenger RNA (mRNA): 1-5%
Là mạch khuôn cho quá trình sinh tổng hợp protein
• Ribosomal RNA (rRNA): >80%
Thành phần cấu trúc nên ribosom
• Transfer RNA (tRNA): 10-15%
Vận chuyển acid amino tương ứng với codon trên
mRNA
Tách chiết RNA
524/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí9
Phương pháp sắc ký
• Sắc ký ái lực: trên poly U-Sepharose hay oligodT-
cellulose, dùng để tinh sạch mRNA.
• Sắc ký lọc gel dùng trong phân tách các nucleic
acid và nucleotic tự do sau quá trình tạo mẫu dò
(probe) đánh dấu.
• Sắc ký trao đổi ion trên vi cột để thu hồi những
lượng rất nhỏ DNA.
• Sắc ký lỏng hiệu suất cao: có độ phân giải rất
cao, được dùng trong tinh sạch các
oligonucleotide tổng hợp, plasmid, phân tách các
đoạn DNA.
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí10
Các phương pháp định tính và định 
lượng thô nucleic acid
• Điện di gel
– Agarose
– Polyacrylamide
• Quang phổ kế: đo mật độ quang (OD – Optical density)
624/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí11
Phương pháp điện di
• Mục tiêu:
• Định tính: sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích thước
• Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng
• Chuẩn bị: thu hồi đoạn DNA (dùng tạo dòng, )
• Nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic
acid: tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt của một
điện trường nên sẽ di chuyển về cực dương của điện
trường.
• Tính linh động của phân tử khi di chuyển trong
điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử và
nồng độ các chất cấu thành gel.
• Kiểu điện di: Agarose, điện di trong trường xung
(PFGE - Pulse Field Gel Electrophoresis).
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí12
Điện di - Electrophoresis
• Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide),
bồn điện di, buffer, dung dịch điện di
• Nạp mẫu
• Chạy điện di
• Nhuộm gel.
724/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí13
Điện di trên gel
• Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide),
bồn điện di, buffer, dung dịch điện di
• Nạp mẫu
• Chạy điện di
• Nhuộm gel.
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí14
Chất nhộm gel - Stain
824/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí15
Điện di trên gel agarose
• Gel agarose là loại gel thông
dụng nhất, thường dùng để
phân tách những đoạn có kích
thước 0,5-20 kb.
• Điện di theo phương nằm
ngang
• Độ phân giải thay đổi khi nồng
độ agarose hay loại agarose
thay đổi.
• Phát hiện bằng phóng xạ tự
ghi, nhuộm ethidium bromide.
Chất này có khả năng gắn xen
vào giữa các base của nucleic
acid và sẽ phát huỳnh quang
dưới tia tử ngoại.
• Ứng dụng: phát hiện 1 trình tự
DNA, phân tích hỗn hợp các
trình tự DNA (Southern blot),
chuẩn bị nguyên liệu
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí16
Điện di trên gel polyacrylamide
• Được dùng để tách các đoạn có kích thước nhỏ,
dưới 1000 cặp base.
• Điện di theo phương thẳng đứng
• Độ phân giải cao, phân biệt được những trình tự
chỉ cách nhau 1 nucleotide.
• Phương pháp phát hiện: DNA – phóng xạ tự ghi,
xanh methylene, ethidium bromide, protein – xanh
Coomassie, nhuộm nitrate bạc.
• Ứng dụng: tinh sạch các oligonucleotic tổng hợp,
giải trình tự DNA, tách các trình tự DNA có kích
thước gần bằng nhau, SDS-PAGE (phân tích
protein)
9Điện di 2 chiều
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí17
Điện di 2 chiều
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí18
10
Điện di 2 chiều
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí19
Điện di 2 chiều
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí20
11
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí21
Phương pháp định lượng bằng 
quang phổ kế
• Cho phép định lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong
mẫu.
• Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước
sóng 260 nm của các base.
• Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho
phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào mối tương
quan:
• Một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ:
• 50μg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi
• 40 μg/ml cho một dung dịch DNA hay RNA sợi đơn
• Định tính: độ sạch dựa trên tỉ số OD260/OD280, tính chất của
nucleic acid (mạch đôi/đơn) (280 nm là bước sóng ở đó các
protein có mức độ hấp thụ cao nhất.
•
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí22
Các phương pháp lai phân tử
12
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí23
Cơ sở của sự lai phân tử
 Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt
quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự
phá vỡ các liên kết H giữa hai mạch.
 Sau khi hai mạch tách rời, nếu nhiệt độ phản ứng được làm giảm
từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở
lại. Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử.
 Đặc điểm của sự lai phân tử:
 Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự
hoàn toàn bổ sung với nhau.
 Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình
thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai
DNA-RNA
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí24
Các kiểu lai phân tử
• Lai trên pha lỏng
• Lai trên pha rắn
• Lai tại chỗ
13
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí25
Lai trong pha lỏng: Các trình tự cần lai nằm trong pha lỏng, là
một dung dịch đệm. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này
gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp
hơn Tm. Phương pháp này được sử dụng để phát hiện các trình
tự tương đồng (giữa các loài hay trong một cá thể).
Các kiểu lai phân tử
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí26
Lai trong pha rắn: Một trong hai trình tự
cần lai được cố định trên giá thể rắn (màng
lai). Phát hiện phân tử lai thông qua mẫu dò
(probe) có đánh dấu đồng vị phóng xạ.
Ba kĩ thuật lai trên pha rắn thông dụng là
Southern blot, Northern blot, Dot blot.
Các kiểu lai phân tử
14
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí27
Lai tại chỗ: Trình tự nucleic
acid cần tìm không được tách
chiết ra khỏi mô hay tế bào.
Quá trình lai với mẫu dò đã
được đánh dấu và phát hiện các
phân tử lai được thực hiện ngay
trên nhiễm sắc thể, tế bào hay
lát cắt mô.
Các kiểu lai phân tử
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí28
Southern blot
• Nguyên tắc của Southern blot là màng lai nitrocellulose
có khả năng tiếp nhận DNA đã được biết từ lâu và đã
được sử dụng trong các nghiên cứu lai axit nucleic khác
nhau vào những thập niên 1950 và 1960.
• Đầu thập niên 1970, sự ra đời của phương pháp điện di
trên gel đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme
hạn chế có thể được phân tách dựa trên cơ sở kích thước
của chúng.
• Từ đó bước phát triển tiếp theo của phương pháp là
chuyển các đoạn DNA phân tách từ gel lên màng lai
nitrocellulose.
• Phương pháp này được E. M. Southern mô tả tại Ðại học
Edingburgh vào năm 1975.
15
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí29
Southern blot bao gồm các bước cơ bản sau:
1. Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp.
2. Ðiện di sản phẩm cắt trên gel agarose.
3. Làm biến tính DNA ngay trên gel, DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi
đơn. Chỉ DNA sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai.
4. Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai (màng nitrocellulose hay màng nylon).
Việc chuyển DNA thường được tiến hành bằng hoạt tính mao dẫn trong
khoảng vài tiếng hoặc có thể dùng một thiết bị thấm chân không. Trong quá
trình chuyển, vị trí các đoạn DNA vẫn được giữ nguyên không thay đổi.
5. Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu.
Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa DNA trên màng lai với mẫu
dò. Ðể đánh dấu người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin hoặc một
mẫu dò phát quang sinh học.
6. Ðịnh vị các phân tử lai DNA-mẫu dò. Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ
thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, nếu sử
dụng biotin/streptavidin thì dùng phương pháp so màu hoặc nếu sử dụng mẫu
dò phát quang sinh học thì phát hiện bằng sự phát quang.
Southern blot
Southern blot
16
31
Northern Blot: RNA-DNA*(RNA*)
• Sau khi E. M. Southern mô tả phương pháp Southern blot vào
năm 1975, Alwine đã dùng một phương pháp tương tự để xác
định các đoạn RNA đặc biệt gọi là Northern blot vào năm
1977.
• Không cần phải cắt RNA bằng restriction enzyme.
• Dùng formaldehyde để phá cầu nối Hydrogen và biến tính
RNA vì mạch đơn RNA sẽ tạo cấu trúc thứ cấp và gấp cuộn.
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí32
Northern blot 
• Northern blot bao gồm các bước cơ bản sau:
1. Tách RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) và xử lý với formaldehyde
2. RNA được phân tách bằng điện di trên gel agarose biến tính (có
formaldehyde).
3. RNA sau khi đã phân tách được chuyển lên màng lai (các phân tử RNA
giữ nguyên vị trí như ở trên gel), thông thường màng nitrocellulose được
dùng, tuy nhiên có thể dùng màng nylon được tích điện dương.
4. RNA cố định trên màng được lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA)
có đánh dấu phóng xạ hoặc được gắn với một enzyme (alkalin
phosphatase hoặc horseradish peroxidase) tạo thành phân tử lai RNA-
DNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép.
5. Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nếu nó
được đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu dò được gắn với
enzyme thì đem ủ với một cơ chất không màu. Enzyme liên kết với nó sẽ
biến đổi thành một sản phẩm màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng
mà sẽ được phát hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp.
17
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí33
Northern blot 
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí34
Phương pháp PCR
• PCR (polymerase chain reaction-phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymease) là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi
nhất trong lĩnh vực Sinh học phân tử. Phương pháp này do Kary Mullis
phát minh vào năm 1985; được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần
thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận được giải
thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993.
• Nguyên tắc của phương pháp PCR: dựa vào đặc tính hoạt động của
DNA polymerase: cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt để hoạt
động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Như vậy, nếu ta
cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình
tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi.
• Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn
DNA riêng biệt. Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho
việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính
xác cao.
18
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí35
Ba giai đoạn trong một chu kỳ của phản ứng PCR
Giai đoạn biến tính
(denaturation)
Trong giai đoạn này phân tử
DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt
độ cao (thường là từ 94-950C,
lớn hơn nhiệt độ nóng chảy
của phân tử) trong vòng 30
giây đến 1 phút, tất cả các liên
kết hydro giữa hai mạch của
phân tử bị bẻ gãy và tạo thành
các DNA sợi đơn.
Giai đoạn kéo dài (elongation)
Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất.
Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn
để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã được đánh dấu
bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, thường kéo
dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Giai đoạn lai (hybridization)
Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-700C, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được sử dụng
khoảng từ 3-50C) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần
được khuyếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút.
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí36
Các thành phần của phản ứng PCR
1. Primer (mồi):
 Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây
chuyền tổng hợp DNA. Chúng bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra
vị trí bắt đầu tái bản. Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi
(forward primer) và một mồi ngược (reverse primer).
 Mồi là một chỉ tiêu quan trọng của phản ứng PCR để quyết định tính đặc trưng và
hiệu quả của phản ứng. Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc
nhất định: dài khoảng 18-24 base; Tm của 2 mồi gần nhau; thành phần nucleotic của
các mồi cần bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần; mồi phải đặc trưng cho
trình tự DNA cần khuyếch đại; không hình thành primer dimer, không phải là trình
tự lặp lại.
2. DNA bản mẫu (DNA template): hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch –
không chứa các chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố,
heparin, ). PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay
những mẫu DNA không được bảo quản tốt.
3. Nồng độ MgCl2: cần cho hoạt động của Taq polymerase, hàm lượng quá cao sẽ tạo
nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme. Nồng
độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm.
19
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí37
4. dNTP: thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng, sự mất cần bằng làm tăng các lỗi sao
chép của polymerase; hàm lượng thường không đổi nhưng có thể thay đổi tùy điều
kiện thực tế.
5. Enzyme polymerase chịu nhiệt
Tag-polymerase là DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần
đầu tiên được bán trên thị trường. Tag-polymerase được nhà Vi sinh vật học Thomas
Brock phát hiện ở Thermus aquaticus một loài vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ
cao. Enzyme chịu nhiệt này giúp giải quyết vấn đề của enzyme biến tính sau mỗi chu
kỳ.
Từ đó đến nay, một số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã được khám phá và người
ta đã tách chiết thêm được các DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng
PCR như Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis), Pfu DNA
polymerase (Pyrococcus furiosus), Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus),
UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima)...
6. Số lượng chu kỳ phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu, thông thường số
lượng chu kỳ nhỏ hơn 40 cho một phản ứng PCR. Thời gian của từng chu kỳ phụ
thuộc thiết bị và kích thước sản phẩm.
7. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR: cần đáp ứng được nhu cầu thay đổi nhiệt độ
thật nhanh và chính xác. Những cải tiến máy luân nhiệt quan tâm đến microtiler plate
96 giếng, các block nhiệt riêng biệt trong 1 máy, block dùng cho lam kính để tiến
hành in situ PCR.
Các thành phần của phản ứng PCR
5
DNA bộ gene
Gene mục tiêu
3
3 5
Phương pháp PCR
20
Chu kỳ 1
thu 2
phân tử
Biến tính
Bắt cặp
Kéo dài
Primer
nucleo-
tide 
mới
3 5
3
2
5 31
Chu kỳ 2
thu 4
phân tử
Chu kỳ n
thu 2n
phân tử
Phương pháp PCR
Chu kỳ 3
thu 8
phân tử
21
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí41
Các ứng dụng của phương pháp PCR
Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học
phân tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nông
nghiệp, 
Một số ứng dụng có tính tổng quát:
 Sản xuất mẫu dò: PCR giúp sản xuất nhanh một lượng lớn mẫu dò
đánh dấu khi thực hiện các phản ứng với cặp mồi chuyên biệt và các
nucleotide đánh dấu.
 Khuyếch đại số lượng các RNA: sử dụng kĩ thuật phối hợp RT-PCR
(kết hợp enzyme phiên mã ngược và Taq polymerase; hoặc sử dụng
Tth polymerase). RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA thông tin
tồn tại với hàm lượng rất thấp, không thể phát hiện bằng phương
pháp cổ điển như Northern blot, 
Kĩ thuật in situ RT-PCR cho phép khuyếch đại các RNA ngay trên mô
và tế bào.
 Định lượng bằng phương pháp PCR: dùng để nghiên cứu các trình tự
RNA hay DNA có số lượng bản sao rất thấp. Trình tự đích được
khuyếch đại đồng thời với một trình tự chứng có nồng độ đã biết, sau
phản ứng so sánh hàm lượng sản phẩm, và suy ra số lượng bản mẫu
ban đầu.
Phương pháp giải trình tự
(DNA sequencing)
• Phương pháp xác định vị trí sắp xếp
các nucleotid trong phân tử DNA
– Phương pháp Maxam và Gilbert
– Phương pháp Sanger
– Pyrosequencing
– Array sequencing
22
Phương pháp Maxam và Gilbert
• Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học. Lần đầu tiên công bố vào
năm 1977.
• Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên phản ứng hóa học thủy giải
đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp
nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau.
• Trước hết, phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở đầu
5’ của mạch đơn, tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hình
phóng xạ.
• Xử lí hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotide của
mạch DNA đã đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có
chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng điện di. Kết
qủa các phản ứng hóa học xử lí mạch DNA được phát hiện bằng điện
di trên gel polyacriamid có thể xác định được trình tự mạch đơn.
DMS
G
G
G
G
FA
G
A
G
G
A
G
A
A
H
C
T
T
C
T
C
C
T
H+S
C
C
C
C
Phương pháp Maxam và Gilbert
Mạch đơn đã đánh dấu phóng
xạ có thể xử lí theo 4 nhóm
phản ứng
- Nhóm phản ứng thứ nhất xử lí
mạch đơn DNA bằng dimethyl
sulphat làm đứt mạch tại G.
- Nhóm phản ứng thứ hai xử lí
mạch đơn DNA bằng axit
(pH=2) gây đứt mạch đơn tại A
hoặc G.
- Nhóm phản ứng thứ ba xử lí
mạch đơn DNA bằng hydrazin
gây đứt mạch đơn tại T và C.
- Nhóm phản ứng thứ 4 xử lí
mạch đơn DNA bằng hydrazin
với nồng độ muối cao làm đứt
mạch đơn tại C.
23
Trình tự được đọc theo thứ tự từ dưới lên (5′ - 3′).
G G+A T+C C
3′
A
A
G
C
A
A
C
G
T
G
C
A
G
5′
Mảnh dài nhất
Mảnh ngắn nhất
G
A
Phương pháp Maxam và Gilbert
Phương pháp Sanger
Nguyên lý: Sanger, Smith và Coulson công bố vào năm
1977, dựa theo cơ chế tổng hợp DNA.
Đã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen thực khuẩn thể X
174
Trong quá trình tổng hợp mạch đơn DNA bỏ sung một
hàm lương nhỏ dideoxinucleotid (ddNTP). Do ddNTP
mất cả 2 nhóm OH (carbon số 2 và 3) ngẫu nhiên làm
cho phản ứng tổng hợp DNA ngừng lại.
Dideoxynucleotide dùng trong DNA sequencing
24
Phương pháp Sanger
ddATP + ddA
four dNTPs dAdGdCdTdGdCdCdCdG 
ddCTP + dAdGddC
four dNTPs dAdGdCdTdGddC
dAdGdCdTdGdCddC
dAdGdCdTdGdCdCddC
ddGTP + dAddG
four dNTPs dAdGdCdTddG
dAdGdCdTdGdCdCdCddG
ddTTP + dAdGdCddT
four dNTPs dAdGdCdTdGdCdCdCdG
A
C
G
T
Sự kéo dài kết thúc do sự hiện
diện của dideoxynucleotide
Phương pháp Sanger
48
Trình tự được đọc theo thứ tự từ dưới lên (5′ - 3′).
G A T C
3′
G
G
T
A
A
A
T
C
A
T
G
5′
Mảnh dài nhất
Mảnh ngắn nhất
ddG
ddG
25
Giải trình tự bằng máy tự động
(Sequencer)
• Theo nguyên tắc sử dụng
ddNTP do Sanger và cộng
sự phát minh
• Trong quá trình tổng hợp
DNA sử dụng mồi và
dNTP đánh dấu huỳnh
quang, mỗi loại dNTP có
màu khác nhau
• Máy tổng hợp mạch đơn
trên cả 2 mạch khuôn,
dùng phần mềm để xử lý
kết quả.
ABI 3100
Chromatogram
5-50
Giải trình tự bằng máy tự động (Sequencer)
26
Microarray
Nguyên tắc: dựa vào kỹ thuật lai
1.Cố định các mẫu dò
(oligonucleotide hay sản
phẩm PCR) có trình tự
xác định trên giá thể rắn
thích hợp theo thứ tự.
2.DNA mục tiêu
được đánh dấu, sau
đó lai với mẫu dò
trên giá thể.
3.Dựa vào cường độ
phát tín hiệu của phân tử
đánh dấu để xác định sự
có mặt DNA mục tiêu có
trong mẫu ban đầu.
27
Mẫu dò (Probe)
• cDNA: sản phẩm PCR các cDNA trong thư viện cDNA hay từ bộ sưu tập dòng
– Được in lên giá thể
• Oligonuclotide: dài 20-25 mer
– Tổng hợp in situ trực tiếp lên giá thể
– Các oligonucleotide được tổng hợp sẵn và in lên giá thể
– Gần đây các oligonucleotide dài hơn (50-100 mer) đã được phát triển để tăng độ
nhạy và tính đặc hiệu.
• Phương pháp microarray có thể đồng thời phân tích sự biểu hiện của hơn 30.000
gen
• Ứng dụng phát hiện các mẫu có mật độ thấp vì microarray chỉ cần một lượng
nhỏ mẫu.
DNA mục tiêu
• Được đánh dấu và sử dụng các chất chỉ thị
phát hiện:
– Chất phát huỳnh quang (Cy3/ Cy5, streptavidin/
phycoerythrin)
– Chất phóng xạ ( 32P, 33P , 35P)
– Chất phát huỳnh quang hoá học (digoxigenein,
biotin, Ag, Au)
28
Image analysis of cDNA 
array
Microarray
cDNA microarray Oligonucleotide microarray
Microarray
29
The process
MASSIVE PCR PCR PURIFICATION 
and PREPARATION
PREPARING SLIDES PRINTING
Chuẩn bị RNA
Nuôi và thu tế bào
Tách RNA tổng số
Tổng hợp cDNA
Lai Array
Đánh dấu cDNA
Microarray
Microarray
30
24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí59
Chân thành cảm ơn