Bài giảng Sinh vật thực phẩm - Chương 2: Các phương pháp định lượng vi sinh thực phẩm

CHƯƠNG 2CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH THỰC PHẨMI. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP - Dùng để xác định các loại vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn: nấm men, tảo đơn bào, bào tử mốc- Quy trình cho phép xác định nhanh chóng số lượng vi sinh vậtKhông phân biệt được tế bào sống và chếtKhông phân biệt được các tế bào vi sinh vật và hạt vật thểHạn chế đối với huyền phù có mật độ thấpBuồng đếm vi sinh vậtĐếm trực tiếp bằng buồng đếm Goriep	Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào Cách đếm tế bào trong buồng đếmQuy trình:	- Pha loãng mẫu (5-10 tế bào/ô nhỏ)	- Nạp mẫu vào buồng đếm	- Đếm số lượng tế bào hiện diện trong 5 ô lớnTính mật độ:	Mật độ tế bào: N/ml = 0,25a x 106 tế bào/ml	a: trung bình cộng số lượng tế bào trong 5 ô lớn	Qui trình xác định số lượng tế bào vsv trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầuII. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC - Dùng để xác định các loại vi sinh vật sống trong mẫu- Độ nhạy cao, định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp- Có thể định lượng các vi sinh vật kích thước nhỏ, di độngChuẩn bị dịch pha loãng mẫuKhông sử dụng nước cất và nước muối sinh lý để pha loãng mẫu thực phẩmCác dung dịch pha loãng mẫuBuffered peptone water (BPW)Saline peptone water (SPW)NaCl8,5gPeptone1,0gNước cất vừa đủ1 lítNaCl5gPeptone10gNước cất vừa đủ1 lítChuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫupha loãng mẫu lỏng theo dãy thập phân Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng:10g mẫu + 90ml dung dịch pha loãng => độ pha loãng 101Các bước tiếp theo tương tự như pha loãng mẫu lỏng Quy trình:- Pha loãng mẫu (25-250 khuẩn lạc/đĩa)- Tạo hộp đổ- Nuôi ủ, đếm số lượng	Cấy mẫu vào môi trường Phương pháp cấy bề mặt Phương pháp đổ đĩaPhương pháp đổ đĩaChuẩn bị đĩa petri vô trùngMôi trường được chuẩn bị - hấp khử trùng và được bảo quản mát ở 45oC trong bể điều nhiệtHút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ thích hợp)Đổ vào đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường, lắc đềuĐể nguội môi trường (thạch đông đặc)Đem ủ ở nhiệt độ thích hợpPhương pháp đổ đĩaƯu điểm	- Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml)	- Xác định được các VSV cần dinh dưỡng tiếp xúc từ nhiều phía	- Cho phép đếm được mật độ VSV cao, khoảng 150-300 khuẩn lạcNhược điểm	- Không định lượng được những VSV quá nhạy nhiệt	- Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất định	- Khó làm thuần một dòng VSVPhương pháp cấy bề mặtMôi trường phải được chuẩn bị trên đĩa trước 1-2 ngày để khô mặtPhương pháp	- Cấy 0.1 – 0,3ml vào đĩa môi trường	- Trải đều trên mặt bằng que trang tam giác	- Để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô mặtFilmPhương pháp cấy bề mặtƯu điểm	- Định lượng được các VSV nhạy nhiệt	- Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn lạc đặc trưng	- Dễ dàng làm thuần chủng VSV mục tiêuNhược điểm	- Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ	- Chỉ cho phép đếm được số lượng khuẩn lạc thấpBút đếm khuẩn lạcCác thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạcCác thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạcMáy đếm khuẩn lạcMáy đếm khuẩn lạc tự độngPHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC Tính kết quả:	Với : 	N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu	C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri đã chọn 	ni : Số hộp petri cấy mẫu tại độ pha loãng thứ i	di: nồng độ pha loãng thứ i 	v: Thể tích mẫu cấy vào trong mỗi đĩaĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH HIẾU KHÍ TRONG MẪU THỰC 10 g mẫu + 90 g Salin Pepton Watter Đồng nhất bằng stomacher / 30 giâyDung dịch 10 -1Pha lõang 10-2, 10-3, 10-4,..Cấy 1ml/petri – 3 độ pha loãng liên tiếp – 2 petri/độ pha lõangCho 15-20 ml PCA/petri. Lắc đềuTổng VSV hiếu khí/g (TPC)	 	 N	TPC = 	 n1V1F1 + .+ niViFiN: Tổng KL; n: số đĩa cho mỗi nồng độV: Thể tích cấy (=1) ; F: độ pha lõangĐể đông đặc Lật ngược đĩa, ủ ấm 30±1oC/ 72±6hKhuẩn lạcChọn đĩa có 25 – 250 khuẩn lạc  đếmIII. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC- Định lượng vi sinh vật có mật độ thấp- Định lượng thông qua số lượng khuẩn lạc hoặc theo phương pháp MPN- Kích thước lỗ lọc: 0,45 m hoặc 0,2 m- Thường dùng màng lọc kỵ nước, in các ô vuông ngăn cản sự mọc lan của khuẩn lạcBộ lọc và màng lọc vô trùngPhương pháp màng lọcKích thước lỗ lọc 0,47µm hay 0,22µmĐường kính và hình dạng màng lọc phụ thực vào đường kính phễu lọcĐường kính màng thường là 45mmThiết bị lọc nhiều phễuPhương pháp lọc VSVPhễu lọc, giá đỡ màng lọc phải được vô trùng sau mỗi lần lọcMật độ VSV trong dịch lọc thích hợp: 	<150 khuẩn lạc/màngThể tích dịch lọc trong 1 lần: 50 -100mlNếu thể tích dịch lọc nhỏ hơn thì phải pha loãng bằng dd pha loãng hay nước cất vô trùngPhương pháp màng lọcƯu điểmXác định được mật độ VSV cụ thể trong một thể tích mẫu lớn: 10ml, 100ml Nhược điểmKhông thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắnKhuẩn lạc vsv mọc trên màng lọc1A1B1C1D. 2A2B2C2CE. coli trên môi trường ID Coli agarColiforms trên môi trường ID Coli agarQUI TRÌNH XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VSV BẰNG PP MÀNG LỌCQuy trình: 	- Khử trùng dụng cụ lọc	- Lọc chân không	- Nuôi cấy màng lọc trên môi trường dinh dưỡng	- Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa petriTính mật độ:	A (cfu/ml)= N*d/VTrong đó: V: thể tích mẫu thể tích mẫu thử (50 or 100ml) N: tổng số khuẩn lạc trên màng lọc d: độ pha loãng mẫu Vi khuẩn phát triển trên màng lọcIV. PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM- Kỹ thuật dùng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, coliform, coliform phân, nấm mốc, nấm men- Kỹ thuật dễ thao tác- Tiết kiệm không gian ủ, bảo quản, thời hạn sử dụng lâu- Không cần hấp khử trùng môi trườngV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER)- Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu- Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau- Kết quả định tính: sinh hơi, đổi màu, hoá đục của môi trường nuôi cấy  dương tính- Độ chính xác phụ thuộc vào số ống nghiệm lặp lại ở mỗi độ pha loãng (3 hoặc 5 lần)- Phương pháp dùng định lượng mọi nhóm vi sinh vật nuôi trên môi trường chọn lọc, cho kết quả biểu kiến. Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu.Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lập lại nhiều lần (3 – 10 lần)Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính.Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê  giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu.Nguyên tắc Hai hệ thống MPN	- Hệ thống 9 ống	- Hệ thống 15 ống Đặc điểm- Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như	Sự tạo hơi: Coliforms 	Sự đổi màu: S. aureus- Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớnHệ thống 9 ống10ml mỗi trườngHệ thống 15 ốngĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN1.11.21.31.41.52.12.22.32.42.53.13.23.33.43.51 - Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượng1.11.21.31.41.52.12.22.32.42.53.13.23.33.43.510-11ml10-21ml10-31ml2 - Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp1.11.21.31.41.52.12.22.32.42.53.13.23.33.43.53 – Đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợp1.11.21.31.41.52.12.22.32.42.53.13.23.33.43.54 – Quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển của vsv cần kiểm địnhSựđổi màu của môi trường1.11.21.31.41.52.12.22.32.42.53.13.23.33.43.55 – Ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng521++++++++5 – Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSV521Tra bảngSố vsv: 70 MPN/gKết quảĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN1.11.21.31.41.52.12.22.32.42.53.13.23.33.43.510-110-210-31ml1ml1ml521Tra BảngSố vsv: 70 MPN/mlIV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER)Phương pháp MPN (loạt 5 ống)Bảng tra MPN (loạt 3 ống)Số lượng ống dương tínhSố MPN/100mlSố ml mẫu sử dụng1010,1000-0013002600393302403314603321100333-Bảng tra MPN (loạt 5 ống)Quy trình: 	- Pha loãng mẫu bậc 10,chọn 3 nồng độ liên tiếp	- Cấy vào loạt ống nghiệm (9 hoặc 15 ống) chứa môi trường chọn lọc một lượng mẫu xác định từ 3 nồng độ đã chọn	- Nuôi ủ, xác định số ống dương tính ở 3 nhóm	- Tra bảng Mac Cradytrị số MPN (a)Tính mật độ:	Số MPN/100ml (MPN/1g) = a x x d Với: a: trị số tra từ bảng Mac Crady V1: thể tích mẫu sử dụng (thường là 1) V2: thể tích mẫu theo bảng Mac Crady ở loạt ống đầu tiên (10ml) d: độ pha loãng ở loạt ống đầu tiênVI. PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤCPHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng tế bào vi sinh vật có trong môi trường. Trong một thời gian nhất định, mối quan hệ giữa số lượng vi sinh vật trong nước tỷ lệ tuyến tính với độ đục của môi trường. Định lượng vi sinh vật trong môi trường bằng máy đo độ đục hay máy so màu ở bước sóng 550- 610nm. Trong phương pháp này cần xây dựng biểu đồ tương quan tuyến tính giữa độ đục và số lượng vi sinh vật trong môi trường bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếpPHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤCPhương pháp tiến hành:Pha loãng huyền phù chứa vi sinh vật cần kiểm nghiệm sao cho các dung dịch thu được khi đo trên máy so màu ở bước sóng 610nm được các trị số OD gần 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.Dùng phương pháp đếm trực tiếp xác định số lượng tế bào vi sinh vật có trong 1ml kí hiệu N/mlTính giá trị log(N/ml) cho từng nồng độ pha loãng, Vẽ đồ thị biểu diễn log(N/ml) theo các giá trị OD. Xác định khoảng tuyến tính giữa log(N/ml) với OD.Tính mật độTừ trị số OD đo được đối chiếu trên đồ thị tương quan giữa mật độ tế bào và OD để xác định số lượng tế bào có trong mẫu.	N/ml = 10a với a=log (N/ml).VII. PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzym linked immunosorbent asay) ELISA (Phương pháp hấp thụ miễn dịch dùng enzyme) dựa trên nguyên tắc phản ứng kết hợp giữa tế bào (kháng nguyên) với một kháng thể đặc hiệu. Tín hiệu phản ứng miễn dịch được nhận biết qua sự ngưng tủa, kết dính kháng nguyên kháng thể hoặc bằng những kháng thể đã được đánh dấu (phát huỳnh quang đồng vị phóng xạ hay enzyme)Đĩa giếng ELISA HỆ THỐNG ELISAMáy rửaMáy đọc QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRONG THỰC PHẨMCÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRONG THỰC PHẨMTổng vi sinh hiếu khí Tổng nấm men, nấm mốc Coliform tổng số E.coli Sallmonella Staphylococcus aureus Bacillus aureus.