Đề tài Chẩn đoán bệnh Newcastle bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

ty Index) đã củng cố và sáng tạo thêm sự phân nhóm này ( 
bảng 1.2). 
Bảng 1.2: Phân loại nhóm độc lực của virus Newcastle được đánh giá qua các chỉ 
số độc lực cơ bản 
Nhóm độc lực MDT (giờ) ICPI IVPI 
Viscerotropic 
VNDV* 
<60 1.5-2.0 2.0-3.0 
Neurotropic 
VNDV* 
<60 1.5-2.0 2.0-3.0 
Mesogenic NDV 60-90 1.0-1.5 0.0-0.5 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 11 
Lentogenic NDV >90 0.2-0.5 0.0 
Asymptomaic 
NDV 
>90 0.0-0.2 0.0 
Nguồn: Alexander, 1989 [89] 
VNDV*: Velogenic NDV 
d. Đặc tính nuôi cấy 
Tất cả APMV đều có thể nhân lên trong phôi trứng gà. Các virus Newcastle có 
khả năng và thời gian gây chết phôi gà rất khác nhau. Khi có virus Newcastle vào 
xoang niệu mô của phôi gà ấp từ 9-11 ngày, tùy theo độc lực của từng chủng mà có 
thể làm chết phôi từ 48 -100h. Hiệu giá virus cũng thay đổi theo chủng virus và 
những chủng gây chết phôi chậm hoặc không gây chết phôi sẽ cho hiệu giá cao 
nhất ( Gough và ctv, 1974) [115]. Đường tiêm cũng rất quan trọng, khi tiêm vào túi 
lòng đỏ thường gây chết phôi nhanh hơn khi tiêm virus Newcastle vào túi niệu ( 
Estupinan và ctv, 1968; Beard và Hanson, 1984) [101, 72]. 
g. Sức đề kháng: Ở 600C virus Newcastle bị diệt trong 30 phút, ở 1000C thì bị 
diệt trong 1 phút. Nhiệt độ môi trường từ 4-200C, virus có thể tồn tại trong 1 tháng 
và ở nhiệt độ âm virus tồn tại nhiều năm. Khả năng chịu nhiệt của từng chủng virus 
Newcastle là một đặc tính di truyền, các chủng khác nhau có khả năng chịu nhiệt 
khác nhau ( Trần Đình Từ, 1995) [31]. Ở nhiệt độ 560C có một số chủng virus chịu 
nhiệt tới 6 giờ mà vẫn còn khả năng gây nhiễm. 
Trong thịt thối rữa, phân, xác chết, virus tồn tại không quá 24 giờ. Trong phôi 
gà bệnh ở trạng thái khô lạnh, virus vẫn có khả năng gây bệnh trong 2 năm. 
Do virus Newcastle có màng bọc ngoài là lipid nên dễ mẫn cảm với các hóa 
chất như ether, chloroform, cồn, formol, phenol, beta-propiolacton làm mất khả 
năng gây nhiễm nhưng không ảnh hưởng đến tính miễn dịch của virus. Chất sát 
trùng như crezyl 5%, sữa vôi 10% có khả năng diệt virus ( Nguyễn Vĩnh Phước, 
1977 và 1978) [25, 26] 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 12 
Dung dịch Glycerin 50% có thể giữ virus trong bệnh phẩm 7 ngày ở 370C 
nhưng không còn khả năng gây nhiễm. 
Ở pH 10, virus mất khả năng gây nhiễm, virus cũng dễ bị diệt 
bởi các tia tử ngoại ( Nguyễn Lương, 1994) [21] 
1.3 Đặc điểm dịch tễ học của bệnh Newcastle 
1.3.1 Phân bố và diễn biến của bệnh 
Việc sử dụng rộng rãi phòng bệnh Newcastle ở nhiều nước trên thế giới là một 
bằng chứng về sự phổ biến của bệnh này trên thế giới. 
Hiện tại, vẫn có thể nói rằng bệnh Newcastle hiện diện ở khắp thế giới nhưng 
xảy ra thường xuyên chủ yếu là ở châu Phi, châu Á, Trung Mỹ, và một số vùng của 
Nam Mỹ. 
 Do vậy, bệnh này vẫn được quan tâm giám sát và việc nghiên cứu cải tiến các 
kỹ thuật chuẩn đoán và biện pháp phòng bệnh luôn luôn được khuyến khích ( Falcon, 
2004) [104]. 
1.3.2 Vật chủ 
 Bên cạnh gà, có lẽ hầu hết chim nuôi và chim hoang dã đều có thể bị nhiễm với 
các dòng virus Newcastle. Gà là vật chủ quan trọng nhất đối với virus Newcastle đồng 
thời có thể có vai trò của các loài chim khác như vịt, ngỗng, gà lôi, chim cút, bồ câu, 
gà tây. 
Virus newcastle cũng có thể gây nhiễm các loài động vật hữu nhũ. Con người 
cũng nhiễm bệnh, kể cả với các loài virus có độc lực cao lẫn độc lực thấp và sự nhiễm 
bệnh cũng có thể gây nên chứng viêm kết mạc nặng ( Chang, 1981) [88] 
1.3.3 Đường xâm nhập và truyền lây của virus 
 Virus Newcastle xâm nhập vào cơ thể gà qua đường hô hấp, kết mạc mắt và 
đường tiêu hóa. Có giả định cho rằng gà mẫn cảm hơn đối với virus Newcastle khi 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 13 
xâm nhập vào đường hô hấp ( Spradbrow, 2001) [221]. Virus bài xuất ra khỏi cơ thể 
qua đường hô hấp hoặc qua phân. 
 Lancaster (1966) [154] và Alexander (1988) [48] đã liệt kê những phương thức lây 
lan chủ yếu của bệnh Newcastle như sau: 
(1) Sự vận chuyển chim sống như buôn bán gia cầm, chim cảnh, bồ câu, chim 
hoang dã, (2) Tiếp xúc giữa những động vật khác, (3) Di chuyển người và 
phương tiện, (4) Luân chuyển sản phẩm gia cầm, (5) Truyền lây qua đường 
không khí, (6) Thức ăn gia cầm bị vấy nhiễm, (7) Nước uống, (8) Vaccine 
1.4 Đặc điểm bệnh học 
1.4.1 Quá trình sinh bệnh 
Virus Newcastle xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp và tiêu hóa. Những hạt 
< 5 micron trong không khí có thể phân tán vào trong toàn bộ khí quan hô hấp của 
gia cầm, kể cả túi khí. Các hạt > 5 micron bị giữ lại ở kết mạc, niêm mạc mũi và 
khí quản ( Kouwenhoven, 1993) [152]. Trong khí quản, virus lan truyền bằng cách 
nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác do hoạt động của các lông tơ. Hiệu giá virus 
cao nhất được phát hiện 24 – 96h sau khi nhiễm, sau đó giảm dần có thể do kháng 
thể được tạo thành từ ngày thứ 5, nhưng virus vẫn còn hiện diện tới ngày thứ 12. 
Sự lan truyền tiếp theo phụ thuộc rất lớn vào độc lực của chủng virus. Trong 
khi các chủng virus độc lực thấp chỉ hiện diện trong hệ thống tuần hoàn với hiệu 
giá thấp, các chủng độc lực trung bình có thể xâm nhập vào thận, phổi, túi 
Fabricius và lách. Còn các chủng virus độc lực cao có thể phát hiện trong vòng 22 
– 24h trong tất cả các mô bào với hiệu giá cao nhất ở trong tuyến ức ( Thymus) và 
thấp nhất ở trong mô cơ và não (Singh và El – Zein, 1978) [214]. Sau khi nhân lên 
ban đầu ở vị trí xâm nhập virus độc lực cao xâm nhập vào máu, tới lách, gan, thận 
và phổi. Từ giờ thứ 36 sau khi nhiễm, sự nhân lên virus bị cản trở trong khoảng 12 
– 24h và hiệu giá virus tụt xuống. Virus xâm nhập vào não sau khi quá trình nhân 
lên ở các mô ngoài hệ thống thần kinh ngừng lại từ giờ thứ 60 sau khi nhiễm và gà 
bắt đầu chết ( Asdell và Hanson, 1960) [65]. Đa số virus xâm nhập vào hệ thống 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 14 
thần kinh trung ương qua đường máu trước khi một lượng kháng thể có ý nghĩa 
xuất hiện ở trong hệ thống tuần hoàn. Tuy nhiên một số virus hướng thần kinh đã 
nằm trong hệ thống thần kinh cùng thời điểm ở đường tiêu hóa và hô hấp là do có 
thể xâm nhập vào trung ương thần kinh thông qua dây thần kinh khướu giác. 
 1.4.2 Triệu chứng và bệnh tích 
 Thời gian nung bệnh rất khác nhau, trung bình là 5-6 ngày.Hiên nay có 4 dạng 
bệnh khác nhau: 
 a. Dạng gây ra do chủng độc lực mạnh-nhóm velegenic. 
 * Triệu chứng: bệnh xuất hiện đột ngột và lây lan nhanh, chết cấp tính trong 3-4 
ngày và biểu hiện rõ triệu chứng,bệnh tích. Chỉ thấy một số triệu chứng. 
 - Gà lờ đờ, hô hấp tăng, thở mạnh, ho. 
 - Đi tiêu chảy đôi khi có máu. 
 - Một số chảy dịch nhờ ở mũi, mặt. 
 - Mào, mồng, tích tím, có thể phù quanh đầu. 
 - Sau 4-5 ngày nếu không chết thì biểu hiện triệu chứng thần kinh ( Mổ lung 
tung , đi quay tròn ). 
 - Gà đẻ giảm số lượng trứng, vỏ mềm. 
 - Tỉ lệ chết 50%- 90% tùy từng đàn. 
 * Bệnh tích: 
 - Đường tiêu hóa xuất huyết và loét từng điểm. 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 15 
 - Thực quản, dạ dày tuyến, dạ dày cơ ( mề ), ruột tịt, ruột già, lỗ huyệt đều thấy 
xuất huyết. 
 - Mạch ruột viêm đỏ và xuất huyết. 
 - Niêm mạc mũi, có dịch nhầy và đôi khi xuất huyết lấm tấm đỏ. 
 - Buồng trứng sung huyết đỏ và một số trứng bị teo. 
 - Mào, não bị xuất huyết điểm đỏ lấm tấm. 
 b. Dạng gây ra do chủng độc lực vừa-Nhóm Mesogenic. 
 * Triệu chứng: Bệnh xuất hiện đột ngột, lây lan nhanh. 
 - Giảm ăn, ho, tiêu chảy phân xanh hoặc hơi vàng 
 .- Trạng thái run rẩy, sau 2 tuần triệu chứng thần kinh sẽ nặng 
 - Gà đẻ tỉ lệ trứng giảm, trứng non nhiều. 
 - Tỉ lệ chết từ 5%-50%, có đàn trên 50% . 
 * Bệnh tích: 
 - Niêm mạc dạ dày tuyến xuất huyết. 
 xuất huyết khí quản 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 16 
 - Niêm mạc đường hô hấp có dịch nhờn, đôi khi có xuất huyết. 
 - Giai đoạn đầu lách sưng to. 
 c. Dạng gây ra do chuẩn độc lực yếu- nhóm Lenetogenic. 
 * Triệu chứng: Chủ yếu ở đường hô hấp ( ho, thở khò khò vào ban đêm ). 
 - Trứng đẻ giảm nhưng sau một vài tuần lại đẻ lại trở lại bình thường. 
 - Gà lớn không chết, chỉ có gà con chết nhưng tỉ lệ ít 1%-10%. 
 * Bệnh tích: Chủ yếu ở đường hô hấp, khí quản viêm nhẹ. 
d. Dạng mang trùng ( không có triệu chứng ) 
 - Không gây chết nhưng nguy hiểm là tồn trữ mầm bệnh làm lây lan cho đàn gà 
mới nhập. 
2. Phương pháp nuôi cấy tế bào. 
2.1 Khái niệm 
 Nuôi cấy tế bào là kỷ thuật duy trì và phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể sống, 
các tế bào trong điều kiện phòng thí nghiệm vẫn tự phân chia, thực hiện đầy đủ các 
chức năng biến dưỡng và chức năng chuyên biệt của tế bào. 
2.2 Các loại tế bào nuôi cấy: Tế bào biểu mô, Nguyên sợi bào, Tế bào cơ, 
 Tế bào thần kinh, Lympho bào. 
2.3 Một số máy móc thiết bị cần thiết 
Tủ cấy vô trùng chuyên nuôi cấy tế bào, tủ ấm thường và tủ ấm CO2 tủ lạnh thường và 
lạnh sâu, bình Nito lỏng, hệ thống nước cất hai lần, hệ thống lọc vô trùng và hệ thống 
trypsin hóa, dụng cụ thủy tinh và nhựa, kính hiển vi soi ngược và một số máy móc 
khác. 
2.4 Thành phần môi trường. 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 17 
 - Carbohydrate: Glucose cung cấp nguồn năng lượng. 
 - Aminoacid nồng độ 0,1- 0,2 mol tiền chất tổng hợp protein. 
 - Muối đẳng trương: Giữ cân bằng trong và ngoài tế bào. 
 - Bicarbonate: Hệ thống đệm trong sẽ kết hợp 5-10% CO2 ( tủ ủ ) 
 - Vitamin, hormon: Nồng độ sử dụng khác nhau tùy theo nhu cầu các loại tế bào. 
 - Phenol red: Chất chỉ thị PH môi trường. 
* Điểu kiện nuôi cấy. 
 - Nhiệt độ 37o C. 
 - PH 7,4. 
* Chất bổ sung vào môi trường. 
 - Huyết thanh phải lọc qua lưới lọc 0.1µm ( vô trùng ) vì huyết thanh rất dễ bị 
nhiễm các loại vi khuẩn, virus. Đặt biệt là Mycoplasma dễ nhiễm vào huyết thanh vì 
nó có thể lọt qua lưới lọc 0,2µm.Vì vậy để khắc phục cần tìm hiểu rõ nguồn gốc của 
huyết thanh. 
 - Ngoài ra trong môi trường nuôi cấy còn bổ sung thêm kháng sinh nhằm ngăn 
cản hiện tượng tạp nhiễm của vi khuẩn ( Pennicyline+ Streptomycne+ Gentamycine ). 
2.5. Kiểm soát việc nuôi cấp tế bào. 
 - Đưa tế bào vào môi trường nuôi cấy tiệt trùng. 
 - Mật độ lúc cấp 104- 105 tế bào tb/ml. 
 - Sau 3 – 4 ngày đạt 106 tế bào hoặc 105 tế bào/ cm2/bề mặt cứng 
 - Sự sinh trưởng ngừng lại do giới hạn chất dinh dưỡng, tích tụ sản phẩm độc, 
thiếu bề mặt tăng trưởng. Lúc này ta cần thay thế môi trường hoàn toàn hay một phần 
sau 2 ngày để đạt mật độ tối đa cao hơn. 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 18 
2.6. Thu hoạch tế bào 
2.7. Bảo quản tế bào. 
 - Nhiệt độ: -700C: hàng tuần, hàng tháng 
 - Nhiệt độ: -1960C: lâu hơn 
2.8. Nguyên nhân gây nhiễm trùng trong nuôi cấy tế bào 
- Là do vi sinh vật từ rất nhiều nguồn khác nhau: không khí, tủ cấy, vật dụng, người 
thao tác, và chất bổ sung vào môi trường. 
- Cách nhận biết: 
 + Giảm đột ngột pH của môi trường 
 + Tạo lớp mây của môi trường 
 + Môi trường đục, tạo cặn 
- Giảm nguồn nhiễm: 
 + Sát trùng nơi làm việc 
 + Sử dụng vật dụng nuôi cấy vô trùng 
 + Vệ sinh cá nhân 
 + Chọn nguồn huyết thanh 
2.9. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 - Trong chẩn đoán bệnh 
 - Chẩn đoán và điều trị ung thư 
 - Sản xuất kháng thể đơn dòng 
 - Sản xuất vaccine 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 19 
 - Chẩn đoán biến đổi gen và sản xuất các sản phẩm sinh học ( hormon, enzyme trị 
liệu ) 
3. Chẩn đoán bệnh Newcastle bằng phương pháp nuôi cấy tế bào 
- Việc chẩn đoán bệnh rất quan trọng vì những lý do sau đây: 
 + Newcastle là bệnh có trong danh mục kiểm dịch biên giới và các nước có dịch 
xảy ra phải thông báo với tổ chức dịch tễ thế giới ( OIE) 
 + Khi các ổ dịch đã được khẳng định cần phải giúp cho chính quyền địa phương 
hiểu biết về dịch tễ học của bệnh Newcastle tại nước họ và phát triển chiến lược khống 
chế bệnh một cách phù hợp 
 + Cần tìm hiểu rõ nguyên nhân gây chết vì ta biết rằng khi tiêm chủng vaccine 
phòng bệnh Newcastle không thể bảo vệ 100% đàn gà. 
 1. Thu thập và gởi mẫu đi chuẩn đoán bệnh 
1.1 Mẫu cơ: 
Dòng virus cường độc gây bệnh thường yếu chịu nhiệt nên khi gởi mẫu phải đóng 
gói một cách đặc biệt cùng với nước đá. 
 Điều kiện: 
- Mẫu tươi: Mẫu tùy tạng, lá lách, phổi và đầu gà còn nguyên vẹn gói vào giấy 
plastic và đặc vào hộp xốp cùng vói đá hoặc nước đá. 
- Nếu không thể giữ lạnh được mẫu hoặc khi không chắc chắn mẫu sẽ đến phòng 
thí nghiệm trong vòng 24h. Các mẫu lá lách, phổi, đầu nguyên vẹn và các đoạn 
xương dài sẽ được bảo quản trong glycerine 50% trong muối và giữ nó ở mức lạnh 
nhất có thể được và bảo quản trong thời gian đưa mẫu đến phòng thí nghiệm. 
1.2. Mẫu huyết thanh 
-Độ tin cậy của xét nghiệm huyết thanh phụ thuộc phần lớn chất lượng của mẫu. 
Các mẫu đã bị tan máu hoặc bị nhiễm bẩn thường có kết quả không đáng tin cậy. 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 20 
- Kỹ thuật lấy mẫu máu: máu của gia cầm thường được lấy từ tĩnh mạch cánh. Mỗi 
con vật sẽ dùng một kim tiêm riêng để tránh rủi ro về tác nhân gây nhiễm lan 
truyền cơ giới từ con này sang con khác. 
- Dán nhãn cho mẫu: Các mẫu phải được dán nhãn theo thứ tự bằng loại mực 
không thấm nước. 
- Tránh hiện tượng tan huyết của mẫu: tan huyết xảy ra do kỹ thuật lấy mẫu kém, 
các trang bị bẩn hoặc kỹ thuật gởi mẫu kém. Nguyên nhân của hiện tượng tan 
huyết bao gồm: 
 + Máu chảy chậm do tắt nghẽn, không trúng mạch. 
 + Mẫu bị nóng, thường do để trong xe hoặc bị ánh nắng mặt trời chiếu trực tiếp 
quá lâu. 
 + Làm đông lạnh mẫu. 
 + Sự nhiễm bẫn của mẫu do nước. 
 + Sự nhiễm bẩn do phân và các vật liệu khác. 
 + Dùng sức ép mạch máu chảy qua tim 
 + Bị nhiễm khuẩn khi lấy mẫu 
 + Dùng các thùng không khử trùng để lấy mẫu và lưu giữ mẫu. 
- Bảo quản mẫu huyết thanh trước khi đưa đến phòng thí nghiệm 
 + Các mẫu máu và huyết thanh không được để trong bình, các thùng hoặc ống 
và kim tiêm kèm theo chưa được khử trùng. 
 + Để đông mẫu trước khi vận chuyển. Mẫu cần được để nơi ấm cho đến khi 
đông lại ( máu có thể không đông trong thời tiết lạnh hoặc mẫu đã được làm lạnh 
ngay sau khi lấy). 
 + Khi máu đã đông mẫu cần được bảo quản lạnh để giảm sự nhiễm bẫn, giảm 
hiện tượng tan huyết và vỡ hồng cầu. 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 21 
 + Nếu mẫu không chuyển ngay đến phòng thì nghiệm được và để lâu mới xét 
nghiệm nên chắt riêng huyết thanh vào lọ nhựa 5ml và 1.8ml vô trùng có nút vặn 
và chỉ chuyển huyết thanh đi. 
 + Các mẫu máu dùng để chắc huyết thanh không được làm đông lạnh trước khi 
chắc huyết thanh. Các mẫu huyết thanh có thể bảo quản đông lạnh với điều kiện là 
không có tế bào máu bên trong 
2. Xử lý mẫu 
Huyễn dịch được chuẩn bị ngay trước khi tiến hành phân lập virus. Não gà 
được lấy ra rồi ngâm vào dung dịch sinh lý vô trùng có chứa 2000 UI penniciline/ 
ml và 2000 µg streptomycine/ ml trong đĩa petri khoảng 30 phút ở 4 – 80C 
Lấy khoảng 2g não gà nghiền nhuyễn với 0.5g nước cất vô trùng trong cối sứ, 
thêm 8ml dung dịch sinh lý vô trùng có chứa 1000 UI penniciline/ ml và 1000µg 
streptomycine/ ml, nghiền trộn đều một lần nữa. 
Để lắng và hút 5ml dịch nghiền, ly tâm 3000 vòng/ phút trong 10 phút, thúc 
dịch bệnh phẩm cho vào ống nhựa eppendorf (1.5ml) ghi ký hiệu và cho ngay vào 
tủ lạnh (4 – 80C) trong khi chờ tiêm vào môi trường tế bào. 
3. Phương pháp chuẩn bị môi trường xơ phôi gà ( CEF) một lớp. 
3.1 Nguyên liệu 
- Trứng gà có phôi 9 – 11 ngày tuổi. Soi và chọn những trứng có phôi phát triển tốt, 
khỏe mạnh để làm tế bào. 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 22 
- Hóa chất và môi trường: 
 + Dung dịch PBS pH 7,2 có kháng sinh với nồng độ: penniciline 200 UI/ml, 
streptomycine 200µg/ml 
 + NaHCO3 0.75% 
 + trypsin 0.25%, MEM và NCS 
- Tất cả dụng cụ, trang bị và phòng làm tế bào phải vô trùng. 
3.2 Trypsin có tế bào 
- Sát trùng toàn bộ quả trứng bằng cồn iode. Dùng kéo cắt vỏ trứng nơi buồng hơi. 
- Dùng kẹp lấy phôi gà ngâm vào dung dịch PBS có kháng sinh. Dùng kéo cắt bỏ 
đầu, cánh, chân và phủ tạng chỉ lấy phần thân ngâm vào dung dịch PBS. 
- Rửa thân phôi với dung dịch PBS 3 lần 
- Cắt nhỏ phần thân phôi bằng kéo. Cho thân phôi đã được cắt nhỏ vào bình có khía 
với thanh khuấy từ. 
- Cho dung dịch PBS vào bình khía: rửa sạch các mảnh phôi đã được cắc nhỏ và để 
yên cho lắng xuống, chắt bỏ phần nước ở trên. Lập lại 3 lần cho đến khi nước 
trong. 
- Cho trypsin 0.25% mới cũng đã làm ấm trước ở 370C. 20ml/phôi, đặt bình khía 
lên máy khuấy từ và khuấy trong 20 phút ở 370C để phân cách tế bào ra. 
- Thu hoạch huyễn dịch tế bào và thêm một lượng MEM lạnh và huyết thanh để 
ngưng hoạt động của trypsin. 
- Lọc qua 4 lớp vải màng và bình ly tâm và ly tâm lạnh với tốc độ 1500 vòng/ phút 
trong 10 phút. Bỏ phần nước bên trên, phần tế bào bên dưới đáy được pha với một 
thể tích môi trường MEM thích hợp, đếm tế bào với 0.1% Trypan blue và điều 
chỉnh lượng tế bào để được số lượng 106 tế bào/ ml hoặc 1 phôi gà pha với 100ml 
môi trường phát triển( MEM 5% NCS). 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 23 
3.3 Cấy tế bào vào chai 
- Pha môi trường phát triển: 
+ Trong một lít môi trường căn bản có: 
• 5% huyết thanh bê sơ sinh ( NCS) 
• 200000 UI penniciline 
• 200 mg streptomycine 
• 50 mg Mycostatin 
• 0.75% NaHCO3 
- Pha tế bào vào môi trường và ra chai: 
Pha trực tiếp số lượng tế bào thích hợp đã được xác định vào môi trường phát triển. 
Lắc đều tế bào trong môi trường bằng cách lắc bình xoay vòng nhiều lần và ra chai: 
0.2ml huyễn dịch tế bào/ cm3 bề mặt chai nuôi cấy 
Để tất cả các chai tế bào vào tủ ấm 370C để tế bào tăng trưởng cho đến khi mọc đầy 
một lớp có thể nhiễm virus. 
4. Kiểm tra mẫu bệnh phẩm 
Lấy mẫu bệnh phẩm cho vào môi trường xơ phôi gà. Nếu thấy những mảnh lớn 
trong hoặc đỏ kích thước từ 0.5-1.5-2.4 mm trong môi trường tế bào thì kết luận 
bệnh phẩm bị nhiễm bệnh. 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 24 
Chủng độc lực mạnh gây bệnh tích tế bào có kích thước 2-4 mm. 
Chủng độc lực vừa nhóm Mesogenic gây bệnh tích tế bào với kích thước mảng 
nhỏ 0.6-1.5 mm 
Đối với chủng độc lực yếu ta phải bổ sung vào môi trường tế bào chất Mg và 
DEAE mới thấy tế bào bị nhiễm. 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 25 
IV. KẾT LUẬN 
Bệnh Newcastle là bênh truyền nhiễm cấp tính và lây lan rất nhanh, bệnh gây xáo 
trộn và bệnh tích trên đường hô hấp, tiêu hóa và thần kinh. Hiện nay bệnh là mối 
nguy hiểm cho ngành chăn nuôi gia cầm, bệnh thường gây nhiễm ghép với các 
bệnh khác và tỉ lệ chết là 100%. Do đó bệnh Newcastle đã gây ra những tổn thất to 
lớn cho nền kinh tế của các nước xảy ra dịch bệnh cũng như của cả thế giới. Ngoài 
ra nó còn ảnh hưởng đến sức khỏe của con người, gây ô nhiễm môi trường và gây 
ra những vấn đề về dinh dưỡng. Vì vậy, việc chẩn đoán bệnh có ý nghĩa rất lớn cả 
về phương diện kinh tế lẫn xã hội. Phương pháp chẩn đoán bằng nuôi cấy tế bào 
có độ chính xác cao và đây là phương pháp duy nhất thu nhận virus cho các 
nghiên cứu tiếp theo. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là rất chậm, đắt 
tiền, đòi hỏi tay nghề kỷ thuật cao. 
 Hiện nay, không có thuốc điều trị đặc hiệu. Nên bổ sung thêm vitamin C và 
vitamin nhóm B, chế phẩm K.C- Electrolyte, cải thiện khẩu phần thức ăn có thể 
làm giảm bớt tỉ lệ tử vong trong giai đoạn cuối ổ dịch. 
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 
 26 
V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Nguyễn Ngọc Hải. Công nghệ sinh học trong thú y 
2.Trần Thị Bích Liên. Nuôi cấy mô tế bào động vật 
3. Dương Quốc Nghĩa. Nghiên cuuws bệnh Newcastle trên gà thả vườn ở tỉnh 
Đồng Tháp và xây dựng quy trình tiêm chủng vaccine phòng bệnh phù hợp. 
4.  
5.  
6. www.mcb.uct.ac.za/cann/335/Paramyxoviruses.html 
 7. www.stanford.edu/.../1999/leanna/para-EM.html 
 8. www.edu-graphics.com/.../TissueCulture.html 
 9. www.microbelibrary.org/asmonly/details.asp?id