Giáo trình Dược liệu (Phần 1)

 kia nay đã đợc điều chế bằng con đờng tổng 
hợp hay bán tổng hợp vẫn đợc gọi là chất kháng sinh: cloramfenicol, streptomycin, 
tetracyclin, penixilin 
 Ngày nay từ kháng sinh còn đợc mở rộng đối với hợp chất trị vi khuẩn đợc 
phân chiết từ thực vật thợng đẳng. Ngời ta gọi những chất kháng sinh có nguồn gốc 
từ thảo mọc này là kháng sinh thảo mọc hay là phytoncid. 
 Ngoài các chất trị vi khuẩn nh đã nói ở trên, ngày nay ngời ta còn xếp các chất 
với nồng độ thấp có tác dụng trị nấm hạ đẳng gây bệnh, siêu trùng, Ricketsia, 
nguyên sinh động vật cũng là chất kháng sinh. 
2, Lịch sử tìm kiếm Phytoncid: 
Trong lịch sử phát triển Y học của dân tộc ta cũng nh nhiều dân tộc khác trên 
thế giới, trớc khi có khái niệm kháng sinh nói chung và Phytoncid nói riêng, loài ngời 
cũng đã từng sử dụng nhiều loại cỏ cây vào mục đích chống nhiễm trùng. Tuệ Tĩnh 
(thế kỷ XIV) đã biết sử dụng nhiều loại thực vật có tính chất kháng khuẩn mạnh: 
Tỏi, Hẹ, Tô mộc trị các bệnh nhiễm trùng. Mãi về sau này (thế kỷ XIX) ngời ta 
mới biết trong tỏi có alixin, hẹ có odorin, tô mộc có Brazilin là những hoạt chất có 
tác dụng kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh. 
Lịch sử tìm kiếm Phytoncid đợc bắt đầu từ việc tìm những tinh dầu thơm chế 
từ thực vật có tác dụng trị bệnh. 
Năm 1880 Davane đã nghiên cứu tính kháng khuẩn của lá bồ đào với 
B.anthracis. 
Năm 1887 R.Koch tìm thấy tính kháng khuẩn của nhiều loại tinh dầu. 
Cùng năm, Chamberland học tró của Pasteur đã chứng minh rằng nhiều loại 
tinh dầu có tính kháng khuẩn mạnh không kém gì axit cacbonic. 
1928, B.P.Tokin đã gọi các chất bay hơi từ cây xanh có tác dụng đối với vi 
khuẩn là Phytoncid. 
Gần đây, ngày càng có nhiều tài liệu chứng minh rằng nguồn gốc kháng sinh 
thực vật phong phú. 
Đến năm 1961 đã khảo sát trên 20.000 loài thực vật để kiểm tra tính kháng 
khuẩn của chúng. 
ở Việt Nam, cũng từ những năm đầu của thập kỷ 60 (thế kỷ 20) phòng đông y 
thực nghiệm do bác sĩ Nguyễn Văn Hởng lãnh đạo, đã bắt đầu sử dụng các kỹ thuật 
mới để điều tra các phát hiện tập đoàn kháng sinh thảo mộc. Ông đã xác định đợc 
198 loài thực vật ở Việt Nam có Phytoncid. Bộ môn Dợc Thú y Trờng Đại học Nông 
nghiệp I cũng trong thời gian này đã nghiên cứu và tuyển chọn đợc 28 loài thực vật 
có tác dụng mạnh với các vi trùng gây bệnh trong thú y ở nớc ta. 
Phạm vi ứng dụng của Phytoncid trong Y học và Thú y học ngày càng rộng rãi. 
Qua kết quả nghiên cứu của chúng tôi, việc sử dụng kháng sinh thảo mộc điều 
trị có hiệu quả tốt các bệnh nhiệm khuẩn đờng tiêu hoá, đờng hô hấp, tiết niệu của 
gia súc, gia cầm và ông mật ở nớc ta, đã khẳng định; mở ra một triển vọng tốt đẹp 
trớc mắt cũng nh lâu dài. 
3. Phân Loại 
 Ngày nay ngời ta chia Phytoncid ra làm 2 nhóm sau: 
 a) Nhóm Phytoncid bay hơi 
 Là những Phytoncid do thực vật thợng đẳng tiết ra có khả năng khuếch tán vào 
không khí và có tác dụng ức chế sự sinh trởng, phát triển của vi khuẩn. 
 Nói cách khác, Phytoncid bay hơi chính là các ether thực vật. 
 b) Nhóm Phytoncid không bay hơi: 
 Là những Phytoncid do thực vật thợng đẳng tiết ra. Nó ở sâu trong các tế bào 
thực vật, không có khả năng khuếch tán vào không khí. Muốn sử dụng nó, phải dựa 
vào đặc điểm, tính chất của từng loại Phytoncid. Thờng ngời ta hay sử dụng chúng 
dới các dạng: 
 + Giả nát lấy nớc cốt cho uống 
 + Ngâm, sắc. 
 + Chiết bằng các dung môi thích hợp. 
4 Ưu, nhợc điểm của Phytoncid 
1) Ưu điểm 
+ Phytoncid đợc phân bổ khá rộng rãi ở giới thực vật, gần nh bốn màu lúc nào 
chúng ta cũng có sẵn Phytoncid để chữa bệnh cho gia súc. 
+ Cách chế biến. 
+ Giá thành hạ. 
+ Không gây nên các hiện tợng: Sốc, dị ứng, không có tác dụng phụ nh của các 
kháng sinh nguồn gốc vi nấm, vi khuẩn. 
Ví dụ: Streptomixin có ảnh hởng xấu đến thần kinh thính giác, thần kinh 7 
Chloramfenicol ức chế sự tạo thành các tế bào non, nhất là các tế bào máu, tế 
bào tinh trùng, dễ gây hiện tợng suy tuỷ và quái thai. 
Penicilin gây hiện tợng dị ứng, sốc quá mẫn, còn kháng sinh thảo mộc không đa 
tới hiện tợng dị ứng; ngợc lại một số loại còn có tác dụng phòng, chống dị ứng nh 
Brasilin và Brasilein của tô mộc, Inteolin của Kim ngân. Những chất này có tác dụng 
khoa men histamin decarboxilaza, phản ứng sinh histamin bị đình lại; do hiện tợng 
dị ứng không xẩy ra. 
+ Thực tế cha có tài liệu nào nói về quá trình kháng Phytoncid tự nhiên của vị 
trùng; còn trong phòng thí nghiệm của chúng tôi quá trình gây kháng nhân tạo của 
E.Coli với Phytoncid xẩy ra rất chậm. 
Ngợc lại, quá trình làm mẫn cảm trở lại của E.Coli đã kháng Alixin, trong môi 
trờng canh than có thêm men tiêu hoá và cao mật lợn, lại nhanh hơn rất nhiều so với 
việc làm mẫn cảm trở lại các vi khuẩn đã kháng Nitrofurantoin và Tetracielin. 
2) Nhợc điểm 
ở một số dợc liệu, thời gian trồng cây có Phytoncid kâu hơn so với việc nuôi cấy 
xạ khuẩn hay bằng con đờng tổng hợp. Ví nh trong tỏi, ta phải trồng và chăm sóc tỏi 
4 tháng. Còn tô mộc thì ít phải có 7 năm tuổi mới có tác dụng chữa bệnh tốt. 
II- Tìm một Phơng pháp đại cơng để nghiên cứu có hệ thống các chất kháng sinh 
thảo mộc 
 Bớc 1: Khảo sát hàng loạt để phát hiện những cây có tác dụng kháng sinh đối 
với các vi khuẩn gây bệnh. 
 Bớc 2: Chiết xuất tìm hoạt chất có tác dụng, kháng sinh. 
 Bớc 3: Tìm hiểu tính chất lý, hoá học, xác định công thức hoá học của hoạt 
chất; thông qua đó nghiên cứu cơ chế tác dụng của Phytoncid. 
 Bớc 4: Tìm biện pháp để tiến tới tổng các chất kháng sinh này. 
 ở nớc ta, các bớc 1 và 2 đã và đang đợc tiến hành 
A- Chuẩn bị thuốc thử 
 Trớc khi làm kháng sinh đó, phải chuẩn bị một hay hai mẫu trong số tất cả các 
dạng thuốc sau: 
 1) Dạng thuốc tơi 
 + Giá nhỏ dợc liệu tơi, lấy nớc cốt. 
 + Lấy nớc cốt, pha thêm nớc cất vào, với tỷ lệ pha loãng 1/101/100 (tuỳ 
theo tác dụng kháng sinh của dợc liệu đó mạnh hay yếu). 
 Nhợc điểm: Nếu làm kháng sinh đó ở dạng này dễ lẫn nhiều tạp chất, gây khó 
khăn cho việc nhận xét, đánh giá kết quả của vòng vỏ khuẩn. 
 2) Dạng thuốc sắc 
 Mục đích để kiểm tra hoạt chất kháng sinh có chịu đợc nhiệt không. 
 Ví dụ: Các Phytoncid ở dạng bay hơi một vài dạng Phytoncid khác, không chịu 
đợc tác dụng cuả nhiệt. Nếu đem sắc, rồi thử, sẽ mất hoạt tính kháng sinh. 
 Ngợc lại, các Phytoncid của tô mộc. Kim ngân, sắt đất đem sắc đặc, rồi thử 
thì hoạt tính kháng sinh vẫn không thay đổi. 
 3) Làm cao ở các dạng 
 Cao lỏng, cao đặc và cao khô để kiểm tra kháng sinh đỏ, cách này cho ta chọn 
đợc các dợc liệu có hoạt tính kháng sinh có chịu đợc nhiệt độ cao hay không? tác 
dụng kháng sinh có bị thay đổi bởi quá trình chế biến không? 
 4) Phơi khô, nghiền bột rồi đập viên để thử 
 5) Chiết hoạt chất trong các dạng dung môi khác nhau: 
 Mục đích: Xem hoạt chất kháng sinh của dợc liệu, tan tốt nhất trong môi trờng 
nào. Từ đó, ta lựa chọn Phơng pháp chiết xuất. Để tránh các sai lầm trong khi bào 
chế, và sử dụng dợc liệu sau đây: khi thử hoạt lực kháng sinh, ta cần chú ý thêm một 
số đặc điểm sau: 
 1) Về pH: Ta tiến hành thử hoạt lực kháng sinh của dợc liệu trong các môi tr-
ờng pH khác nhau (Kiềm, trung tính, và toan tính) với mục đích xác định xem kháng 
sinh có tác dụng tốt nhất trong môi trờng pH nào? Nh thế nào có thể giúp lựa chọn 
đờng cho thuốc này. 
 2) Thử hoạt tính kháng sinh của Phytoncid dới tác dụng của các men tiêu hoá. 
 Cách làm: Kiểm tra hoạt lực của Phytoncid dới tác dụng của men tiêu hoá bằng 
hai cách (chủ yếu và quan trọng nhất là thử với Pepsin và Trypsin). 
 Cách 1: Gồm 3 ống nghiệm sau: 
ống nghiệm 
Thành phần 1 ống 
1 
2 
3 
Canh thang 
Phytoncid 
Men tiêu hoá 
3 
có 
có 
3 
có 
không 
3 
không 
có 
Vi khuẩn thử (1 que Cấy đều vào cả 3 ống nghiệm 
cấy) 
 Sau đó chỉnh pH cả 3 ống nghiệm giống nhau và là pH của men tiêu hoá hoạt 
động, tức là nếu ta dùng trypxin thì pH cả 3 ống là 7 – 7,5. Nếu là men peoxin thì pH 
= 3 – 4. Đạt cả 3 ống trong tủ ấm 370C/24 giờ, sau đọc kết quả. 
 Kết quả dơng tính: ống nghiệm 1 và 2 vi khuẩn không phát triển đợc, ống 
nghiệm 3 vi khuẩn phát triển bình thờng, ta dùng Phytoncid cho gia súc uống đợc. 
 Ngợc lại, nêú cả 3 ống nghiệm vi khuẩn đều phát triển thì với Phytoncid đó ta 
phải tìm cách chế biến khác không chi gia súc trong dợc. 
 Cách 2: Cũng tiến hành tơng tự nh cách một trong ống nghiệm nhng trớc khi 
cấy vi khuẩn vào ống nghiệm, ta chọn men tiêu hoá tác dụng với Phytoncid, chỉnh 
pH sinh lý, đạt tủ ấm 370/2 – 3 giờ lấy ta cấy tiếp vi khuẩn vào, đặt trở lại tủ ấm 12-
18giờ sau đọc kết quả. 
 Cách đánh giá kết quả cùng giống nh cách 1: 
 3) Chế các dạng thuốc dới dạng hỗn hơp nhiều loại Phytoncid 
 Mục đích: Xem những loại dợc liệu nào phối hợp với nhau thì có tác dụng hiệp 
đồng làm tăng khả năng chữa bệnh và ngợc lại. 
 Ví dụ: Các dợc liệu sau đây nên phối hợp với nhau sẽ có tác dụng kháng sinh 
hiệp đồng. 
29Tô mộc với ngũ vị. 
30 He tơi với vỏ tơi. 
Ngợc lại, các dợc liệu sau đây nếu phối hợp sẽ làm mất tác dụng kháng sinh của 
nhau: 
31Hoàng bá và phúc bồn. 
32 Kim ngân với tô mộc, với hoàng bá. 
B- Phơng pháp tiến hành 
 Tuỳ theo yêu cầu và mục đích nghiên cứu. Bằng phơng pháp thí nghiệm khác 
nhau chúng ta có thể tiến hành cả định tính và định lợng Phytoncid. 
1) Phơng pháp định tính (làm trên thạch đĩa) 
 1- Mục đích: 
 Cho thấy rõ phạm vi tác dụng và những đánh giá sơ bộ về khả năng của loại 
kháng sinh đó còn dang ở giai đoạn thô. Cần phân biệt cách thử giữa kháng sinh thô, 
kháng sinh bay hơi giữa vi khuẩn hiếu khí và yếm khí. Có thể kết quả mới chính xác. 
 Hiện tại ở các cơ sở sản xuất, mới chỉ tiến hành thử Phytoncid thô với vi khuấn 
hiếu khí bằng cách làm kháng sinh đó. Để đánh giá hiệu lực kháng sinh của thuốc 
tuỳ hoàn cảnh thực tế chúng ta có thể làm một số cách làm kháng sinh đồ sau: 
1) Cách tiến hành 
 a) Phơng pháp đặt vòng khâu của Heathey 
 a.1. Chuẩn bị dụng cụ: 
 Vòng khâu: có thể là những vòng bằng kim loại đúc sắn không gỉ. ở các cơ sở 
sản xuất, có thể thay bằng khâu thuỷ tinh có kích thớc tơng đơng, đờng kính 8 – 
9mm. Chiều cao vòng khâu 9 -10mmm. Kinh nghiệm thực tế cho thấy khâu bằng 
thuỷ tinh tốt, thuận tiện, dễ tiết kiệm, các cơ sở sản xuất tự tìm đợc. 
33Hộp lồng: gồm các kích thớc đờng kính 20cm, 10cm, và 8cm. 
Các dụng cụ cần thiết khác của phòng thí nghiệm pipette, cốc đong, ống đong. 
 - Phơng pháp đặt viên thuốc. 
 - Phơng pháp khoét lỗ trên thạch rồi bơm bay trộn thuốc hoặc đặt viên thuốc 
vào. 
 - Phơng pháp bơm, phun vi khuẩn vào các chuông thuỷ tinh kín trong có các 
đĩa thạch đã trộn kháng sinh cần thử, của Giáo s Đặng Văn Ngữ. 
 - Phơng pháp đặt vòng khâu cảu Heathey. ở Việt Nam, hay dùng Phơng pháp 
này. Nó đơn giản, an toàn mà vẫn đảm bảo đợc độ chính xác. Phơng pháp này có 
mấy u điểm sau: 
 1) Trong lúc chuẩn bị các dạng thuốc để thử còn lẫn một số vi khuẩn khác, ống 
khâu sẽ giữ vi khuẩn không cho khuếch tán ra ngoài thạch dợc. 
 2) Một số tanin, gồm có trong thuốc cũng bị giữ lại trong ống khâu, không thể 
khuếch tán vào thạch làm tủa pepton cũng nh thức ăn khác của vi khuẩn thí nghiệm. 
 3) Nếu ống nghiệm khâu đảm bảo tiêu chuẩn quy định, chỉ Phytoncid đợc thẩm 
thấu vào thạch, rồi ức chế sự phát triển hay tiêu diệt vi khuẩn. Cho vòng vô khuẩn 
to, nhỏ tuỳ thuộc tác dụng dợc lý mạnh hay yếu của Phytoncid. 
34 
a.2. Chuẩn bị nguyên liệu 
Các dạng thuốc thử cần thí nghiệm 
35Các loại vi khuẩn cần thử 
Thạch: riêng về thạch vào hộp lồng, ta chuẩn bị 2 loại: thạch nền và thạch 
trắng. 
+ Thạch nền: Đặc hơn thạch trắng, thờng là loại thạch kém phẩm chất hơn, đợc 
nấu trong môi trờng canh thang rất loãng. So với thạch trắng hàm lợng chất dinh d-
ỡng có ở thạch nền rất ít. Thạch này, sau khi đã hấp thanh trùng, đung nóng, chẩy 
trở lại, tuỳ theo kích thớc của từng loại hộp lồng mà ta đổ: 
Với đĩa = 20cm ta đổ vào mỗi đĩa 25-30 ml thạch 
 = 10cm ta đổ vào mỗi đĩa 15ml thạch 
 = 8cm ta đổ vào khoảng 10 – 12ml thạch, chờ đông, bảo quản tủ 
lạnh dùng dần. 
+ Thạch tráng (thạch mặt): Là thạch bảo đảm đúng, đủ thành phần các chất 
dinh dỡng để vi khuẩn phát triển nh: Huyết thanh, glucoza, các axit amin, vitamin... 
nếu nh vi khuẩn thí nghiệm yêu cầu, lắc đều thanh trùng, đun nóng chảy hết, để 
nguội 46-480C rồi cho vi khuẩn cần thử vào, lắc đều, chia các đĩa. Thờng cứ 25ml 
thạch tráng cho thêm 0,2 ml canh trùng thí nghiệm, sau khi cấy 24 giờ ở tủ ấm, lắc 
thật đều, chia cho từng đĩa, mỗi đĩa tuỳ theo kích thớc cho khoảng 3 -10ml thạch 
trắng có canh trùng. Tráng khắp mặt đĩa. Nh vậy trong từng đĩa sẽ có 2 lớp thạch: 
36Lớp thạch nền: chắc hơn, dày hơn ở phía dới 
37 Lớp thạch mặt: mỏng hơn, lỏng hơn đã có vi khuẩn cần thử ở phía trên. 
Sau khi lớp thạch trên da đóng lại, ta tiến hành đặt khân: khâu sâu khoảng 1 – 
2mm (tức chân của khâu vừa chạm tới mặt của lớp thạch nền). Nhỏ thuốc thử kháng 
sinh vào. Để tủ lạnh 6 – 8giờ chờ cho chất kháng sinh thẫm thấu vào lớp thạch mặt, 
nhng vi khuẩn cha mọc. 
Tiếp đó để tủ ấm 370C; khoảng 12 – 18 giờ sau, đọc kết quả. 
Do đờng kính vòng vô khuẩn, là đờng kính đi qua tâm vòng tâm khâu, tới mép 
vòng vô khuẩn. Số lợng địa thạch yêu cầu đợc tính theo công thức: 
 X = AxB/C 
 X : Số đĩa thạch cần chuẩn bị 
 A : Số lợng cây thuốc (mẫu) cần thử. 
 B : Số vi khuẩn cần thử. 
 C : Số lợng vòng khâu đạt trong từng đĩa. 
Với phơng pháp này chúng ta cũng có thể tiến hành định lợng, hàm lợng 
Phytoncid có trong dợc liệu đợc khi so sánh với chất chuẫn. 
Cánh đánh giá kết quả: tuỳ theo mc độ mẫn cảm của vi khuẩn với từng loại 
thuốc cần thử mà ta chia ra các mức độ sau: 
Vi khuẩn rất mẫn cảm với thuốc: đờng kính vòng vô khuẩn sẽ lớn hơn 30mm . 
Thuốc xẽ có tác dụng rất tốt trong điều trị . 
Vi khuẩn ít mẫn cảm với thuốc, đờng kính vòng vô khuẩn khoảng 20-30mm với 
thuốc này muốn điều trị ta phải tăng liềuđiều trị lên so với liều đang dùng . 
Vi khuẩn không chịu tác dụng của thuốc thì xung quanh ống khuẩn xẽ không 
xuất hiện vòng vi khuẩn .Thuốc này xẽ không đợc dùng trong điều trị . 
b) Phơng pháp của giáo s: Đặng Văn Ngữ 
Các mẫu dợc liệu cần nghiên cứu đem nghiền nát thành bột rồi nén thành viên 
bánh trụ cao 0,8cm đờng kính 0,3cm đạt viên vào hộp lồng đã có thạch để tủ lạnh 
4
0
C /6h chờ hoạt chất kháng sinh từ khuyếch tán ra ngoài môi trờng. Sau lấy hộp 
lồng từ tủ lạnh ra, đặt vào chuông thuỷ tinh có chứa các đĩa thạch kể trên. Chuyển 
thạc đĩa vào tủ ấm 370C trong 12 giờ sau đọc kết quả bằng cách do vòng vô khuẩn 
xung quanh chân viên nén. 
Phơng pháp này tránh đợc việc sử dụng các khâu nhng lại phải dùng những 
phơng tiện cồng kềnh khác: Máy nghiền dợc liệu, máy nén viên trụ 
Chú ý: Phơng pháp này rất nguy hiểm nhất là khi nghiên cứu những loại vi 
khuẩn gây bệnh chung giữa gia súc và ngời. 
c) Phơng pháp thử các Phytoncid bay hơi với các vi khuẩn hiếu khí: 
Có nhiều cách làm, ở đây chúng tôi giới thiệu phơng pháp của giáo s Rudat ng-
ời Đức. Phơng pháp này đợc áp dụng phổ biến hơn cả. Cách làm nh sau: 
Lấy 2 nữa hộp lồng có đờng kính bằng nhau. Nửa trên của hộp lồng ta đổ thạch 
và cấy vi khuẩn cần thử. Nửa dới hộp lồng ta đặt chất thuốc là những Phytoncid bay 
hơi (dợc liệu giã nhỏ, tinh dầu nguyên chất, bông tẩm nớc cốt của dợc liệu).Gắn 
parafin đặt tủ ẩm 37oC/12 giờ đọc kết quả. Nếu kháng sinh bay hơi này có khả năng 
ức chế vi khuẩn thí nghiệm, thì nửa trên của hộp lồng, vi khuẩn không mọc, hay mọc 
rất ít so với đối chứng. 
d) Phơng pháp thử Phytoncid với vi khuẩn kỵ khí 
Phơng pháp này đợc áp dụng chủ yếu ở các cơ sở nghiên cứu: Cục, Viện và Tr-
ờng của Trung ơng để đảm bảo tính chất an toàn khi nghiên cứu một dợc liệu nào 
đó, còn ở các cơ sở sản xuất: các Chi cục Thú y và trại chăn nuôi tập thể hiện nay 
cha áp dụng. 
Trớc khi tiến hành Phơng pháp nay, ta phải loại bỏ hết tạp chất gồm: tanin, 
gôm, protein của dợc liệu. Rồi bằng Phơng pháp làm lạnh, để lấy hết không khí 
trong môi trờng nuôi cấy đi. Cho dợc liệu thí nghiệm. Với các nồng độ khác nhau 
vào môi trờng nuôi cấy vi khuẩn. Đặt ống nghiệm vào tủ ấm 370C trong 12 giờ sau 
đọc kết quả. 
Phơng pháp này hiện nay còn một số điểm cha thống nhất phải tiếp tục nghiên 
cứu để hoàn chỉnh thêm. 
Trong thực tế ta có thể nuôi vi khuẩn ở môi trờng nớc thịt có gan phía trên 
tráng một lớp dầu parafin để tạo môi trờng yếm khí. Sau khi cho các Phytoncid cần 
thử và cấy vi khuẩn vào, ta cũng đặt tủ ấm 370C/12 giờ sau độc kết quả. 
Nếu ống nghiệm vẫn trong suốt, giữ nguyên mẫu canh thang, tức là vi khuẩn 
không phát triển đợc, chứng tỏ Phytoncid đó có tác dụng chống vi khuẩn yếm khí. 
 2) Phơng pháp định lợng 
 Mục đích của Phơng pháp: 
 Định lợng cho ta biết đợc mức độ tác dụng mạnh của Phytoncid. Thờng sử 
dụng các Phơng pháp sau để tiến hành định lợng. 
 1) Phơng pháp hệ nống độ pha loãng 
 Nó đợc áp dụng rộng rãi khi nghiên cứu vi khuẩn học và tính chống chịu kháng 
sinh ở cả 2 loại môi trờng đặc biệt (thạch) và lỏng (canh thang). 
 a- Trong môi trờng đặc: Dung dịch chất cần thử (Phytoncid) đã pha sẵn trong 
nớc cất vô trùng, nồng độ 1/10: 1/100 sau đó cứ 1ml chất thử ở các nồng độ khác 
nhau đem trộng đều với 4ml môi trờng thạch ở 45-480C trong ống nghiệm vô trùng, 
lắc thật đều để yên cho môi trờng đông lại, sau đó nuôi ống cây một vật nhỏ vi khuẩn 
cần thử lên mặt thạch, đặt tủ ấm 370C/12 – 18 giờ sau đọc kết quả, ta tìm đợc nồng 
độ thấp nhất có tác dụng của thuốc với vi khuẩn. Đó là nồng độ tối thiểu tác dụng 
của chất kháng sinh. 
 b- Trong môi trờng loãng: Phơng pháp này đã đợc Fleming dùng để xác định 
tác dụng dợc lý của Penixilin. Phơng pháp này cũng cơ bản giống Phơng pháp trên 
nhng đợc thay 4 ml thạch bằng 4ml canh thang và cấy vi khuẩn cần thử vào. Yêu cầu 
của Phơng pháp này: số lơng vi khuẩn cấy vào từng loại nồng độ giống nhau. Thờng 
là lấy 1 que cấy. 
 Yêu cầu chung của Phơng pháp hệ nồng độ pha loãng là: 
 + Số lợng vi khuẩn trong từng nồng độ phải đợc xác định và ít nhất là phải 
giống nhau về số lợng vi khuẩn. 
 + Vi khuẩn thí nghiệm phải nuôi trong môi trờng luôn luôn có các thành phần 
giống nhau với nhiệt độ xác định và tuổi giống nhau. 
 + Trong môi trờng loãng, muốn có kết quả chính xác về nồng độ tối tiểu tác 
dụng, ta có thể chọn 2-3 ống nghiệm liền nhau ở nồng độ nghỉ ngờ , cấy lên 2-3 đĩa 
thạch để tủ ấm 24 giờ (mỗi ống cấy 1 đĩa). Nếu vi khuẩn ở đĩa nào không mọc (nhng 
phải liền với ống có nồng độ thấp hơn vi khuẩn vẫn mọc). Ta gọi nồng độ ở đĩa đó là 
nồng độ tối thiểu tác dụng của Phytoncid với vi khuẩn cần thử. 
 2) Phơng pháp khuếch tán: 
 Phơng pháp náy đợc áp dụng phổ biến ở các cơ sở sản xuất do Reddish tìm ra 
năm 1920 sau đó đợc Abranam (1941) cải tiến để xác định hàng loạt tính kháng 
khuẩn của penixilin. 
 Nội dung và Phơng pháp tiến hành nói chung giống Phơng pháp đặt khâu của 
Healley, chỉ khác: mỗi một ống khâu trong hộp lồng ta nhỏ một loại nồng độ kháng 
sinh nhất định. Trong từng hộp lồng ta nên bố trí xen kẽ có khân nhỏ dung dịch 
chuẩn đã biết trớc nồng độ để sau này đánh giá, so sánh xem mức độ tác dụng của 
từng nồng độ so với thuốc chuẩn. Đặt hộp lồng vào tủ 370C/12 – 18 giờ sau đọc kết 
quả. 
 3) Phơng pháp xác định độ đục 
 Phơng pháp nàu rất chính xác và nhanh, chỉ trong vòng 2-3 giờ chờ vi khuẩn 
mọc. 
 Phơng pháp này dựa trên cơ sở quan hệ số học giữa mức độ kìm hãm sự phát 
triển của vi khuẩn với nồng độ của Phytoncid có trong dung dịch. 
 Ngời ta pha loãng dung dịch chuẩn của Phytoncid ở các nồng độ khác nhau nh 
phơng pháp hệ nồng độ pha loãng. Dung dịch này đem trọng vào môi trờng canh 
thang. Cấy vi khuẩn vào. Mỗi ống nghiệm một que cấy vi khuẩn để khống chế nồng 
độ vi khuẩn trong từng ống là giống nhau. Đặt tủ ấm 370C sau 2 – 3 giờ. Ta có thể đo 
độ đục của môi trờng để biết tốc độ phát triển của vi khuẩn, bằng máy đo quang kế 
Spekol hoặc các pek ở phòng thí nghiệm. 
 Nồng độ tác dụng của dung dịch Phytoncid cần thử đợc tính theo mức độ tác 
dụng của dung dịch Phytoncid chuẩn đã biết trớc nồng độ. 
 Phơng pháp này yêu cầu hàng ngày xác định đồ thị của nồng độ dung dịch 
chuẩn.