Giáo trình Sản xuất protein trong y học - Trần Hoàng Dũng (Phần 1)

ự điều
khiển làm ức chế, hay làm suy yếu, ràng buộc cấu tạo. Với mỗi sự thay đổi của xung
điện liên quan đến gel, trong điều kiện mới những đoạn DNA nhỏ hơn sẽ bắt đầu di
chuyển nhanh hơn những đoạn DNA lớn. Vì vậy những đoạn DNA lớn hơn chậm trễ
ở phía sau, tạo ra 1 sự phân chia các đoạn DNA. Hệ thống điện di được dùng thay đổi
trường điện từ được tạo ra từ các cực tĩnh điện. Khi đó, DNA không di chuyển theo
đường thẳng sẽ giúp giải thích các vấn đề trên gel. Lý tưởng hơn, DNA nên phân tách
thành những đoạn nhỏ để làm đơn giản cho việc so sánh đường này với đường kia.
Sản xuất protein trong y học
71
Figure 2.17. hiện tượng điện di (PFGE).(a)đảo chiều dòng điện trong suốt quá trình
PFGE.chiều dòng điện được đưa vào gel để xác định chu kì-thời gian của xung điện-thường
từ 0.5 – 2 phút. Sau thời gian này sự vận hành chiều dòng điện được thay đổi.(b)Việc lặp lại
sự chuyển mạch của chiều dòng điện làm DNA sẽ đi xuống theo hình zig-zag trên gel.
Kĩ thuật cơ bản PFGE dùng 2 dòng điện không tương đồng để thay đổi sự điều khiển sự di
chuyển của DNA trong suốt quá trình điện di (Schwartz, Cantor, 1984). Việc di chuyển theo
hình zig-zagging cho phép phân tách những phân tử DNA lớn,nhưng dòng điện không
đồng nhất dẫn đến những mẫu DNA mạch vòng. (c)Việc dùng dòng điện tương đồng,những
mẫu phân tách theo đường thẳng được thể hiện,giống như là việc phân tách toàn bộ sợi NST
được thể hiện ở trên.
Cách tiếp cận đơn giản nhất để thu được những vạch thẳng là dung kĩ thuật
(FIGE),dùng song song các cực để đảm bảo 1 dòng điện đồng nhất. FIGE chuyển đổi
có chu kì chiều phân cực của các cực trong suốt quá trình điện di. Vì FIGE làm thay
đổi hình thái DNA 180°, nên một số lượng DNA sử dụng được biết chắc chắn về thời
gian di chuyển qua lại. Việc thay đổi góc 180° của kĩ thuật điện di xung (FIGE) áp
dụng tốt nhất cho sự xắp xếp phân tách những phân tử có kích thước dưới 2000kbp.
Hơn nữa, FIGE có khả năng đảo chiều chuyển động, trong đó những phân tử
DNA lớn hơn có thể di chuyển lên phía trước những phân tử nhỏ hơn trong suốt quá
trình điện di. Việc dùng dòng điện đồng nhất kết hợp với kĩ thuật PFGE cũng tạo ra
dòng DNA di chuyển theo đường thẳng.Ví dụ, trong kĩ thuật điện di đối lưu(CHEF)
làm thay đổi DNA tại những góc xiên nhỏ hơn, thông thường nằm ở giữa 96 và 120°.
Điều này làm cho DNA lúc nào cũng di chuyển lên phía trước theo hình zig-
zag trong gel, nhưng DNA không di chuyển theo đường nhỏ và đường thẳng đã được
thể hiện ở hình 2.18.
Sản xuất protein trong y học
72
Một vài thông số hoạt động liên tục trong suốt quá trình PFGE tác động đến hiệu
quả của việc phân tách trên 1 khu vực gel riêng biệt.Bao gồm mẫu và sự tập trung
agarose đem dùng,thành phần đệm,nhiệt độ đệm,cường độ dòng điện,sự thay đổi
góc...Tuy nhiên,thời gian của xung điện chủ yếu làm nhiệm vụ thay đổi hiệu quả của
việc phận tách, thời gian xung điện là khoảng thời gian của mỗi loại dòng điện xoay
chiều. Những thời gian xung điện ngắn hơn giúp cho sự phân chia những phân tử DNA
nhỏ hơn vì những đoạn DNA nhỏ hơn sẽ bắt đầu di chuyển nhanh hơn những đoạn lớn
hơn phụ thuộc vào sự thay đổi ở trên. Tương tự, thời gian của nhũng xung điện dài hơn
giúp cho sự phân tách những phân tử DNA lớn(Figure 2.19).
Việc tiếp cận kĩ thuật PFGE làm cho những phân tử DNA riêng biệt đặc trưng
cho toàn bộ NST được phân tách dễ dàng trên gel. Những phân tử DNA lớn như những
sợi NST nguyên vẹn thì dịch chuyển dễ dàng và cũng khó khăn trong pipet do tính
nhớt của chúng. Sự cần thiết đối với vật liệu nguyên vẹn trong điện di là hiển nhiên. Sự
thử nghiệm để phân tách rã ra từng phần hay làm mất 1 phần vật liệu có chủ ý sẽ tạo ra
những vết bị nhòe và do đó gel trở nên khó phát hiện. Cách giải quyết vấn đề này là
trước tiên phải bảo quản những TB không bị hư hỏng (e.g).
Figure 2.18. Hai kĩ thuật chính của PFGE. Đảo chiều điện trường trong điện di
trên gel (FIGE) là kĩ thuật chiều dòng điện được đảo ngược trở lại và quay 1 góc 180◦để điều
khiển sự di động của toàn bộ DNA.Kĩ thuật điện di đối lưu (CHEF) sử dụng nhiều cực tại
những vị trí chính xác của điện trường và có thể thay đổi 1 cách chính xác.
Sản xuất protein trong y học
73
Figure 2.19. Ảnh hưởng của thời gian xung điện lên sự phân tách các đoạn
DNA có kích cỡ khác nhau.Sợi NST của Saccharomyces cerevisiae và cách thiết lập 1
DNA markers đã biết kích thước phân tử được đưa ra trong kĩ thuật PFGE với điều
kiện sử dụng các thời gian xung điện khác nhau.Chú ý rằng việc tạo ra thời gian xung
điện được tăng lên để giúp cho việc phân tách những đoạn DNA có kích cỡ lớn.Kích
cỡ của các DNA marker được thể hiện dưới dạng kbp.Tái sản xuất từ
Wrestler...(1996) được sự cho phép của Bruce Birren (Whitehead Institute)
Ở đầu agarose và sau đó xử lý những đầu này với enzyme để phân loại vách TB
với protein vì vậy DNA còn nguyên vẹn tinh khiết trên agarose. Những đầu này sau đó
sẽ được cắt để tạo kích thước, được xử lý với enzyme cắt nếu cần thiết và sau đó được
đưa lên các giếng ở gel agarose (Figure 2.20).
Ở đầu agarose và sau đó xử lý những đầu này với enzyme để phân loại vách TB
với protein vì vậy DNA còn nguyên vẹn tinh khiết trên agarose. Những đầu này sau đó
sẽ được cắt để tạo kích thước, được xử lý với enzyme cắt nếu cần thiết và sau đó được
đưa lên các giếng ở gel agarose (Figure 2.20).
Ở đầu agarose và sau đó xử lý những đầu này với enzyme để phân loại vách TB
với protein vì vậy DNA còn nguyên vẹn tinh khiết trên agarose. Những đầu này sau đó
sẽ được cắt để tạo kích thước, được xử lý với enzyme cắt nếu cần thiết và sau đó được
Sản xuất protein trong y học
74
đưa lên các giếng ở gel agarose (Figure 2.20).
2.6 Vết nucleid acid
Khi chúng ta thấy những đoạn DNA trong thuốc nhuộm gel ethidium bromide,tất
cả các dãy DNA ở mỗi loại trên gel thì khác nhau so với loại kia.
Figure 2.20. Chuẩn bị những phân tử DNA có khối lượng phân tử lớn để phân
tích bởi kĩ thuật PFGE. Những TB nguyên vẹn được hòa lẫn vào nhau với agarose
nóng chảy nhưng đã làm mát và được rót vào 1 khối nguyên vẹn. Khối agarose có
thể được xử lý với enzyme thủy phân loại bỏ vách TB và nhận biết DNA NST.
Nếu theo yêu cầu, DNA có thể được phân hủy bởi các enzyme cắt trong khối gel
agarose. Những khối được xử lý sau đó được đem vào các giếng của gel agarose
trước khi được xử lý với kĩ thuật điện di (PFGE).
Thậm chí những đoạn có chiều dài đồng nhất cũng có trình tự khác nhau.Dĩ nhiên
trình tự DNA của chính nó đóng vai trò sự sống trong chức năng của phân tử.Vào giữa
thập niên 1970 phương pháp này được phát triển để phân biệt các dải băng trên gel có
chứa trình tự DNA riêng biệt. Những phương pháp này phụ thuộc cách lai của trình tự
Sản xuất protein trong y học
75
acid nucleic để nhận biết sự có mặt của trình tự bổ sung. Phương pháp truyền thống
được thực hiện bởi ED Southern 1975 để phát hiện phân đoạn DNA trên gel agarose
mà nó bổ sung với trình tự acid nucleic.
2.6.1. Southern Blotting
Hình 2.21. Southern blotting. Các phân đoạn DNA được tách ra trên gel
agarose và chuyển tới màng. DNA được làm biến tính tạo chuỗi đơn trước khi cho kết
hợp với mẫu dò. Sự kết hợp của mẫu dò với màng- thông qua liên kết hydrogen- được
phát hiện bằng màng phim X-ray. Các mẫu dò có gắn phóng xạ hình thành những
băng trên phim tại vị trí tương ứng với trình tự bổ sung trên màng.
Trong qui trình Southern blotting, đoạn DNA tách ra khỏi gel agarose và được
cố định trên màng. Sau khi gel được chạy, đoạn DNA bị biến tính (thành từng chuỗi
riêng biệt) khi dung kiềm.. Bản chất sợi đơn của ADN trên màng tế bào là rất quan
trọng cho phép các trình tự DNA bổ sung có thể gắn vào các đoạn DNA trên màng.
Sau khi các DNA trong gel đã được biến tính, chúng được chuyển đến màng. Quá
trình chuyển có thể là qua trung gian hoặc electrophoretically hoặc lực hút mao dẫn
bằng cách đặt các gel và màng tiếp xúc với các chất khác đệm và cho đệm chảy qua
gel lên màng tế bào - đoạn DNA di chuyển với đệm và bị giữ trên màng. Ban đầu, sử
dụng màng nitrocellulose, nhưng nó mỏng và dễ bị phá vỡ. Hiện nay người ta thường
Sản xuất protein trong y học
76
sử dụng màng nilon. Sau khi chuyển, các đoạn DNA cần được cố định vào màng để
chúng không tách rời ra. Một số phương pháp cố định thường dùng là đun nóng ở 80 ◦
C kết hợp sử dụng ultraviolet cross-linking. Nó dựa trên sự hình thành các liên kết
chéo giữa một lượng T rất nhỏ trong DNA, các nhóm tích điện dương và amino trên bề
mặt của màng nylon. Sau khi đông đặc, màng được đặt trong một dung dịch acid
nucleic có đánh dấu (thường là các chất có tinh phóng xạ) một trong hai sợi đơn DNA
hay RNA. Các nucleic acid đánh dấu (hoặc đầu dò) cho phép lai với các trình tự bổ
sung của nó trên màng. Sự tương tác giữa đầu dò đơn sợi và trình tự bổ sung của nó sẽ
dẫn đến sự kết hợp của các đầu dò với màng thông qua liên kết hydro không đồng hóa
trị- liên kết thường giữ chuỗi ADN xoắn kép với nhau. Sau đó màng này được rửa
sạch để loại bỏ các đầu dò không liên kết.
Hình 2.22. Màng Washing Southern blot tại những nhiệt độ khác cho kết quả
khác nhau. Rửa màng ở nhiệt độ cao sẽ loại những phân tử DNA liên kết yếu- những
phân tử này giống trình tự mẫu dò. Rửa màng ở nhiệt thấp có thể loại bỏ những trình
tự trên màng mà chỉ tương tự chứ không giống trình tự mẫu dò. Nhiệt độ phù hợp để
rửa tùy thuộc chiều dài và khả năng kết hợp chính xác với các trình tự trên màng.
Southern blotting được sử dụng để phát hiện các trình tự ADN hoặc là trùng
hoặc tương tự như trình tự các đầu dò. Việc lai tạo các đầu dò với các trình tự DNA bị
giữ trên màng là yếu tố quan trọng của sự thành công trong những thí nghiệm này.
Như chúng ta đã thấy trước đây, một sợi đơn DNA sẽ liên kết với trình tự bổ sung của
nó bằng một ái lực cao. Cũng có những liên kết tương tự được tạo ra, nhưng không
giống nhau và ái lực với các trình tự DNA giảm. Điều này được thực hiện bằng cách
thay đổi nhiệt độ (hoặc nồng độ muối) mà tại đó các đầu dò được rửa sau khi đã bị kết
Sản xuất protein trong y học
77
hợp (Hình 2,22). Rửa màng ở nhiệt độ cao sẽ gây gián đoạn nhưng các trình tự liên kết
chặt chẽ. Do đó, các băng hiển thị trên phim X-ray hoặc là trùng hoặc liên kết chặt với
đầu dò. Rửa màng ở nhiệt độ thấp hơn sẽ làm giảm mức độ stringency, và trình tự liên
kết yếu với đầu dò sẽ thể hiện điện tích dương trên phim X-ray. Cách tiếp cận này là
vô cùng hữu ích khi bạn không biết chính xác trình tự của gen mà bạn muốn xác định.
Điều này được thực hiện khi kiến thức về các trình tự protein được biết đến, nhưng
chuỗi ADN mã hóa protein mà chưa được biết rõ. Chúng ta sẽ thảo luận về vấn đề này
hơn nữa trong Chương 6.
2.6.2 Những điểm Compass của Blotting
Từ mô tả đầu tiên của Southern và lai tạo, một số phương pháp khác đã được mô
tả. Những sự thay đổi này liên quan đến việc chuyển vật liệu từ gel tới màng và nhận
biết các phân tử riêng biệt. Các kỹ thuật này cho biết tên vị trí điểm đó chứ không chỉ
là mô tả.
• Northern blotting- nhận biết trình tự RNA bằng cách sử dụng các đầu dò
(Thomas, 1980). RNA được tách trên gel agarose và được chuyển đến màng, giống
như mô tả ở trên. Cụ thể, các phân tử RNA này sau đó được nhận biết bằng cách lai sử
dụng sợi đơn RNA, hoặc sợi bổ sung cho RNA có đánh dấu.
• Western blotting- nhận biết các protein cụ thể bằng cách sử dụng các kháng thể
(Bur-nette, 1981). Protein được tách thông qua một gel polyacrylamide có chứa chất
tẩy SDS để giữ chúng không bị cuộn lại (biến tính). Các protein được chuyển từ gel tới
màng giống như mô tả ở Southern blotting. Đặc biệt, các protein này sau đó được phát
hiện bằng cách sử dụng các kháng thể. Sự tương tác cụ thể giữa các kháng thể và
kháng nguyên của nó xảy ra trên màng tế bào, và nhận biết được vị trí liên kết kháng
thể. Ban đầu, sử dụng kháng thể có đánh dấu, nhưng phần lớn đã được thay thế bằng
kháng thể “sandwiches”. Phương pháp này giống bánh mì kẹp chả tức là kháng
nguyên nằm giữa và hai kháng thể nằm hai bên. . Điều này có một số ưu điểm, trước
hết, bản chất của kháng thể là protein thì khả năng bắt cặp với kháng nguyên rất cao
làm tăng đáng kể độ nhạy, và thứ hai, một kháng thể đơn dòng thứ cấp có thể được sử
dụng để phát hiện một số kháng thể sơ cấp khác nhau. Ví dụ, các kháng thể đơn dòng
sơ cấp thường sử dụng ở chuột. Nhưng kháng thể đơn dòng thứ cấp, chẳng hạn
globulins miễn dịch ở thỏ có khả năng tương tác với kháng thể sơ cấp ở chuột.
Sản xuất protein trong y học
78
Hình 2.23. Western blotting sử dụng kháng thể để nhận diện các protein đặc
trưng. Protein được tách nhờ gel polyacrylamide, sử dụng SDS gây biến tính trước khi
cho thấm trên màng nitrocellulose. Các protein không liên kết mà bị dính trên màng- sử
dụng bột sữa hòa tan- trước khi sử dụng kháng thể sơ cấp. Kháng thể sơ cấp kết hợp với
kháng nguyên. Một kháng thê thứ cấp khác sau đó được thêm vào để nhận biết kháng
thể sơ cấp. Các kháng thể thứ cấp thường được gắn nhãn với một loại enzyme có hoạt
động, trong sự hiện diện của các cơ chất thích hợp, kết quả là thay đổi màu sắc trên
màng hoặc phát xạ ánh sáng có thể được phát hiện bằng cách sử dụng phim X-ray.
• South- Western blotting- xác định các protein liên kết với các trình tự DNA cụ
thể (Singh và cộng sự, 1988). Protein được tách bằng hai cách hoặc trên gel hoặc thấm
trực tiếp trên màng tế bào. Màng tế bào này sau đó được kết hợp với một chuỗi
oligonucleotide DNA có đánh dấu. Nếu một protein có khả năng liên kết DNA, nó sẽ
được phát hiện bởi sự hiện diện của mẫu có đánh dấu này.
Sản xuất protein trong y học
79
2.7 Tinh sạch DNA
Nhiều kĩ thuật được thảo luận trong chương này chủ yếu phụ thuộc vào các DNA
đã được tinh sạch. Sự cô lập vật chất di truyền từ tế bào là quá trình tương đối đơn
giản. Việc phá vỡ vách tế bào làm vật chất di truyền thoát ra khỏi tế bào, nhưng DNA
bị nhiễm với RNA và protein. Vì thế phương pháp này đòi hỏi phải loại hết các thành
phần tạp để tăng hiệu suất tinh sạch phân đoạn DNA. Tổng lượng DNA phân lập được
chủ yếu dựa vào các qui trình sau đây:
• Phá vỡ vách tế bào chủ. Phương pháp phá vỡ tùy bản chất mỗi loại tế bào. Ví
dụ, các tế bào vi khuẩn thường được xử lí với các enzyme lysozyme để phá vỡ bớt
thành tế bào trước khi sử dụng chất tẩy rửa. Mặt khác, tế bào nấm men, được xử lí
bằng zymolase để phá vỡ hoàn toàn thành tế bào trước khi tiến hành phân giải -
thường là bằng cách nghiền các tế bào với hạt thủy tinh để phá vỡ chúng.
• Li tâm để loại các thành phần tạp của tế bào
• Các thành phần hòa tan còn lại sau đó sẽ được vortexed với phenol để loại bỏ
protein sau khi đã gây biến tính. Chlorofom thường được sử dụng kết hợp với phenol,
nó cũng là một chất biến tính protein nhưng tạo sự phân lớp rõ ràng giữa các dịch nước
và phenol.
• Các acid nucleic còn lại trong lớp dung dịch nước có thể được kết tủa bằng cách
sử dụng ethanol. Khi bổ sung ethanol DNA sẽ hình thành một kết tủa trắng dạng sợi có
thể được thu bằng phương pháp ly tâm.
• RNA được loại bỏ từ việc chuẩn bị bằng cách xử lý với RNase.
Đối với nhiều ứng dụng, DNA phải được tinh sạch hơn. Isopycnic centrifugation-
được sử dụng để tách DNA khỏi các tạp chất, và cũng để cô lập từng phân tử DNA.
Các mẫu DNA được trộn với một chất (caseium chloride, CsCl) có khả năng hình
thành self-generating ổn định gradient nồng độ trong quá trình ly tâm. Các phân tử
DNA sẽ lắng xuống ống ly tâm khi gradient của dung dịch bằng gradient của chính nó,
và nó tạo thành một băng. Sau đó, chúng được lấy ra khỏi các ống ly tâm và CsCl
được loại bỏ bằng cách tủa ADN với rượu. Một ưu điểm lớn của kỹ thuật này là khả
năng riêng biệt các loại phân tử DNA khác nhau.
Sản xuất protein trong y học
80
Hình 2.24. Li tâm isopycnic các phân tử DNA nhờ gradient của caesium
chloride- ethidium bromide. DNA mẫu trộn với caesium chloride va ethidium bromide
và li tâm tốc độ cao trong vòng 48h. Mỗi nồng độ sẽ xuất hiện một băng, trong đó, đối
với ADN, chịu ảnh hưởng ở mức mà phân tử không bị biến tính bởi ethidium bromide.
Sự kết hợp của ethidium bromide trong ly tâm để tăng khả năng liên kết của
DNA. Những hạn chế trong cấu trúc xoắn cuộn DNA có nghĩa là các phân tử DNA
khép vòng (ví dụ plasmid) có thể liên kết yếu với ethidium bromide. DNA mạch vòng,
và những đoạn DNA mạch thẳng liên kết với ethidium bromide chặt hơn và cấu trúc
không bị phá hủy khi được chèn thêm chất này (hình 2.12). Kết quả DNA mạch vòng
và mạch thẳng nhẹ hơn so với mạch xoắn cuộn tương ứng của nó, và do đó được tách
ra ở vị trí khác nhau trên CsCl. Nhược điểm chính của isopycnic là thời gian li tâm dài
để hình thành gradients, với băng DNA isopycnic mất 36-48 h để hình thành một
gradient CsCl. Kỹ thuật này hiện nay ít được sử dụng do sự ra đời của bộ “kits”
thương phẩm cho phép phân lập DNA nhanh và không ảnh hưởng tới DNA khi tiếp
xúc với thuốc thử có hại. Cơ sở của những bộ “kits” này được thảo luận dưới đây.
Tinh sạch DNA plasmid (xem Chương 3) là cực kỳ quan trọng đối với nhân bản
vô tính trong ống nghiệm và thao tác các gen. DNA plasmid thường được phân lập từ
tế bào vi khuẩn. Một lần nữa, việc phá vỡ tế bào là một giai đoạn quan trọng trong tiến
trình. Phá vỡ tế bào không tốt sẽ dẫn đến lượng plasmid thấp. Các phương pháp phổ
biến nhất trong chiết xuất DNA từ tế bào chủ yếu dựa trên qui trình của Birnboim và
Doly (1979). Phương pháp này được gọi là qui trình phân giải nhờ dung dịch kiềm,
dựa vào pH hoạt động trong môi trường kiềm (giữa 12,0 và 12,5) chỉ có DNA mạch
thẳng bị biến tính còn DNA mạch vòng thì không. Qui trình này đảm bảo kết quả cắt
của genome E.coli dạng vòng để tạo ra những đoạn lớn AND mạch thẳng. Hầu hết các
phương pháp để tinh sạch DNA plasmid dựa trên quan sát này đòi hỏi môi trường nuôi
cấy tế bào vi khuẩn là 1-5ml. Các phương pháp cơ bản để tinh sạch plasmid như sau.
Sản xuất protein trong y học
81
Hình 2.25. Tinh sạch DNA plasmid. Sử dụng SDS phá vỡ DNA plasmid chứa
trong tế bào vi khuẩn. Bổ sung sodium hydroxide để gây biến tính genomic DNA. Sau
khi trung hòa, genomic DNA hình thành dạng kết tủa với phức SDS-protein. Chúng
được loại bỏ bằng cách li tâm. DNA plasmid sau đó kết hợp với dịch matrix mà không
kết hợp với tạp chất. DNA plasmid tinh sạch sau đó được phân tách từ dịch này.
• Các tế bào vi khuẩn được xử lí bằng chất tẩy rửa (SDS) trong môi trường
NaOH để đảm bảo pH kiềm. SDS phá vỡ màng tế bào và biến tính protein. Trong quá
trình này, DNA nhiễm sắc thể bị biến tính, nhưng các phân tử DNA plasmid sẽ vẫn
còn trong dung dịch.
• Hỗn hợp này sau đó bất hoạt bằng cách sử dụng acid acetate kali (pH 5.2). Các
DNA nhiễm sắc thể tái cấu trúc sau khi trung hòa, nhưng kết hợp để tạo thành dạng
không hòa tan. Nồng độ acid acetate kali cao cũng gây kết tủa của protein này - phức
Sản xuất protein trong y học
82
SDS và trọng lượng phân tử RNA cao. Một lần nữa, các phân tử DNA plasmid sẽ vẫn
còn trong dung dịch.
• Các kết tủa sau đó được loại bỏ bằng ly tâm và DNA plasmid tiếp tục được tinh
sạch từ dịch nổi này.
• Các DNA plasmid trong dung dịch sau đó được tinh sạch từ các tạp chât (chất
chuyển hóa, ARN, phân đoạn genome DNA v.v) bằng cách liên kết các DNA hoặc là
silica hoặc trao đổi (anionic) ion tích điện dương. Đối với nhiều quy trình nhỏ, các
DNA plasmid được nhốt trong dịch silica với đệm có chứa hàm lượng muối cao.
Trong điều kiện này, các tạp chất khác sẽ không liên kết với các dịch và có thể được
rửa trôi. Sau đó, DNA có thể được phân tách từ dịch silica bằng cách sử dụng dung
dịch đệm nồng độ muối thấp (hoặc nước). Quy trình lớn hơn, các chế phẩm plasmid
thường gắn vào DNA plasmid với một cực trao đổi ion mang điện tích dương, chẳng
hạn như DEAE (diethylaminoethanol), trong môi trường chứa dung dịch đệm, ví dụ,
1M NaCl. Nồng độ muối cho phép DNA kết hợp với dịch, nhưng không kết hợp với
tạp chất. Sau khi rửa, nồng độ muối được tăng lên đến 1,6 M để phân tách các DNA.
Qui trình này đòi hỏi các DNA được kết tủa (với ethanol hoặc isopropanol) và
resuspended trong dịch đệm hàm lượng muối thấp trước khi được sử dụng trong các
qui trình sinh học phân tử.