Kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR đa mồi trong phát hiện Salmonella gây bệnh tiêu chảy

Trường ĐH Nông Lâm TP.HCMBộ Môn Công Nghệ Sinh HọcKIỂM TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH TIÊU CHẢY	Sinh viên thực hiện: GVHD: Nguyễn Ngọc Hải 	Trịnh Xuân Thảo	MSSV: 06126142Mục lụcI. ĐẶT VẤN ĐỀII. TỔNG QUAN TÀI LIỆU:III. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU	1. Đối tượng nghiên cứu	2. Vật liệu	3. Phương pháp nghiên cứu	4. Xử lý số liệuIV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨUV. BÀN LUẬNVI. KẾT LUẬNVII. TÀI LiỆU THAM KHẢOI. Đặt vấn đềTiêu chảy là một trong những vấn đề quan trọng về sức khỏe toàn cầu, đặc biệt đối với trẻ em trên toàn thế giới. Tiêu chảy chiếm vị trí thứ hai về tỷ lệ tử vong ở trẻ em dưới 5 tuổi do mắc các bệnh nhiễm khuẩn (chỉ sau nhiễm khuẩn đường hô hấp). Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy, trong đó vi khuẩn đóng vai trò quan trọng.Tiêu chảy còn là nguyên nhân quan trọng gây suy dinh dưỡng, ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển của trẻ. Salmonella là một vi khuẩn có phạm vi lây lan rộng, sống trong ruột của chim, loài bò sát và động vật có vú. Nó có thể lây sang người qua nhiều loại thức ăn từ động vật. Những bệnh do chúng gây ra (salmonellosis) tiêu biểu gồm sốt, tiêu chảy và đau bụng. Salmonella là một căn nguyên gây tiêu chảy đã được đề cập trong nhiều nghiên cứu.II. Tổng quan tài liệu:1.Giới thiệu về salmonella và phương pháp chuẩn doán:	a. Đặc diểm hình thái của salmonella: là vi khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy tiện, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường.	- Trên môi trường lỏng	- Trên môi trường thạch thường	- Trên môi trường phân lập SSSalmonella trên thạch McConkey Salmonella sp. sau 24h trên thạch XLD 	b. Phân loại: salmonella được phân loại theo 2 cách chính như sau:Về phân loại khoa học :	- Giới : Bacteria	- Ngành: Proteobacteria	- Lớp: Gramma Proteobacteria	- Bộ: Enterobacteriales	- Họ: Enterobacteriaceae	- Giống: Salmonella lignieres 1900 	- Loài: S. bongori & S. enterica Về phân loại theo cấu trúc kháng nguyên:c. Các phương pháp chuẩn đóan salmonella:Phương pháp phân lậpPhương pháp miễn dịchHuyết thanh họcELISAMiễn dịch huỳnh quangPhương pháp phân tửPCRRealtime PCRMultiplex PCR	Tuy nhiên, PCR là phương pháp được sử dụng nhiều nhất với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.Quy trình phàn ứng PCR2. Mục tiêu nghiên cứu :- Xác định độ nhạy của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân. - Xác định độ đặc hiệu của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân.PCR đa mồi cho phép tiết kiệm thời gian và nguyên vật liệu (khoảng 5 lần) so với chạy riêng rẽ từng PCR để chẩn đoán các vi khuẩn gây tiêu chảy.Ưu điểm của PCR đa mồi:Thành phần 1 PCR6 – 8 PCRPCR đa mồiTiết kiệmNước cất 11,1 ml66,6 ml6,3 ml60,3 mlÐệm 2,0 ml12,0 ml2,0 ml10,0 mldNTPs 1,6 ml9,6 ml1,6 ml8,0 mlMgCl2 1,6 ml9,6 ml1,6 ml8,0 mlMồi 1,6 ml9,6 ml6,4 ml3,2 mlTaq polymerase 0,1 ml0,6 ml0,1 ml0,5 mlDNA mẫu 2,0 ml12,0 ml2,0 ml10,0 mlThể tích 20,0 ml120,0 ml20,0 ml100,0 mlIII. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU1. Đối tượng nghiên cứu	Chủng Salmonella typhi VCMM2, 5 chủng Salmonella typhi (phân lập từ bệnh phẩm của bệnh nhân), Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp, E. coli ATCC 11775 và 5 chủng E. coli ATCC gây tiêu chảy (EAEC, EHEC, EIEC, EPEC, và ETEC). Các chủng này (trừ 5 chủng S. typhi từ bệnh nhân) do Đề án Lưu giữ nguồn gen Vi sinh vật Y học, Bộ môn Vi sinh vật, Đại học Y Hà Nội cung cấp.2. Vật liệu2.1. Vật liệu dùng cho nuôi cấy và xác định vi khuẩn	Môi trường: Sorbitol Mac Conkey (SMAC), Deoxycholate Citrat Agar (DCA), các loại tube, đĩa petri, kháng huyết thanh của một số vi khuẩn đường ruột, bộ hóa chất xác định vi khuẩn API 20E của Biomerieux (Pháp).2.2. Sinh phẩm, hoá chất, dụng cụ và máy móc dùng trong PCRsử dụng kỹ thuật PCR đa mồi với các cặp mồi đặc hiệu cho Salmonella và V. cholerae 3. Phương pháp nghiên cứu3.1. Độ nhạy của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân.a.Qui trình tách chiết ADN trực tiếp từ phân.	Bước 1: 200 mg phân được hoà với 1ml huyền dịch vi khuẩn và 2 ml nước cất, lắc đều trên máy lắc.	Bước 2: Ly tâm huyền dịch phân ở bước 1 với tốc độ 1000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy nước nổi.	Bước 3: Nước nổi từ bước 2 được ly tâm tiếp với tốc độ 2000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy nước nổi.	Bước 4: Nước nổi từ bước 3 được ly tâm tiếp với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy cặn.	Bước 5: Hoà tan cặn với 500 µl nước cất, trộn đều trên máy lắc. Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút.	Lặp lại quá trình rửa cặn này 1-2 lần đến khi nước nổi không còn màu vàng của phân. Loại bỏ nước nổi	- Bước 6: Hoà tan cặn thu được ở bước 5 vào 300 ml nước cất. Đun sôi cách thuỷ 1000C trong 20 phút.	Sau khi đun làm lạnh ngay Bước 7: Ly tâm lạnh 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ cặn. Nước nổi chứa ADN dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR. Nếu chưa dùng ngay, nước nổi được bảo quản ở -200C.b. Xác định độ nhạy của hệ thống PCR đa mồi	Pha chủng Salmonella typhi vào 1 ml nước cất để có độ đục Macfarland 4.	- Pha loãng 10 lần các huyền dịch chứa 109 vi khuẩn/ml này để có các nồng độ từ 109, 108 đến 101,100 vi khuẩn/ml.	- Trộn 1 ml từng huyền dịch vi khuẩn trên với 200 mg phân đã được xác định không có Salmonella gây tiêu chảy bằng nuôi cấy phân lập và PCR.	. - Tách chiết ADN theo qui trình ở trên.	- Tiến hành kỹ thuật PCR đa mồi với ADN thu được sau khi tách chiết.	Mỗi phản ứng gồm 25 µl các thành phần sau: 12,5 µl PCR master mix (Epicentre, Canada); 2,5 mM cặp mồi OMPCF-OMPCR và ctxB2-ctxB3 (Promega, Mỹ), 3 µl DNA mẫu. Chu trình nhiệt như sau 950C/2’; 30 chu kỳ: 950C/1', 570C/1’, 720C/2'; một chu kỳ 720C/7', giữ ở 40C3.2. Độ đặc hiệu của PCR đa mồi	- Pha lần lượt các chủng Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp, chủng E. coli ATCC 11775, 5 chủng E. coli gây tiêu chảy vào 1 ml nước cất để có độ đục Macfarland 4 (tương đương với 109 vi khuẩn/ml).	- Các huyền dịch chứa 109 vi khuẩn/ml được pha loãng 10 lần để có các nồng độ từ 109, 108 đến 101, 100 vi khuẩn/ml.	- Trộn 1 ml từng huyền dịch vi khuẩn trên với 200 mg phân đã được xác định không có Salmonella.	- Tách chiết DNA theo qui trình ở trên.	- Tiến hành kỹ thuật PCR đa mồi với DNA thu được sau khi tách chiết.3.3. Đánh giá chất lượng sản phẩm PCR	Bảng 1. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng sản phẩm PCR4. Xử lý số liệu	Các số liệu được quản lý và phân tích bằng chương trình SPSS 12.0IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU	1. Xác định độ nhạy của PCR đa mồi2. Xác định độ đặc hiệu của PCR đa mồiV. BÀN LUẬN1. Độ nhạy của PCR đa mồi2. Xác định độ đặc hiệu của hệ thống PCR đa mồiVI. KẾT LUẬN- Độ nhạy của hệ thống PCR đa mồi xác định Salmonella là 106 CFU/ml, độ lặp lại của thử nghiệm là 100%.- Độ đặc hiệu của hệ thống PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân là 100%. VII. Tài liệu tham khảo	- Wikipedia tiếng Việt	- google.com.vn	- Làm thế nào Vi khuẩn Salmonella gây Tiêu chảy Trong Máy chủ của họ ScienceDaily (Ngày 17 Tháng 10 2009)	- Phát triển và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy từ phân Nguyễn Vũ Trung, Lê Huy Chính, Lê Văn Phủng _ google.com.vn	- Hai mươi bốn giờ phát hiện salmonella spp. trong thực phẩm bằng phương pháp  pcr Phẩm Minh Thu, Phan Thu Dòng, Trương Xuân Liên.Viện Pasteur Tp. Hồ Chi Minh 	- Nguyễn Tiến Dũng, Phát hiện phân biệt Salmonella spp. và S.enterica I bằng PCR và khảo sát tần số xuất hiện tương đối của S.enterica I trong thủy sản, nước tự nhiện. Luận văn thạc sĩ khoa học-Trường ĐHKHTN TP.Hồ Chí Minh 2002.    	- Nguyễn Văn Hòa. Nghiên cứu ứng dụng phương pháp PCR để phát hiện Salmonella spp. trong thủy sản. Luận văn thạc sĩ khoa học-Trường ĐHKHTN TP.Hồ Chí Minh 1999.