Tiểu luận Chẩn đoán virus cúm gia cầm (Avian influenza hoặc bird flu) bằng kỹ thuật gen

n, tuy nhiên nếu dùng các phương 
pháp nuôi cấy rất nguy hiểm vì dễ gây phát tán virus. Hiện nay đê phát hiện virus H5N1 trong mẫu 
cần khoảng 5-7 tiếng. Các nghiên cứu hiện nay đa số tìm cách giảm thời gian này. 
một phương pháp cải tiến là dùng một số đoạn AND mồi đặc hiệu. 
 Real time RT-PCR 
-Đích: M gene 
-Probe IA Taqman 
-Độ nhạy: 10 copies 
-Chứng nội tại 
(EAV) 
-Bản định lượng.
RT-PCR đặc hiệu 
với: 
- H5N1 
- H3, N1 
Real time PCR 
-đặc hiệu với H5 
-Taqman độ nhạy 10 
copies 
Vi 
trung 
hoà 
Phân 
lập 
Loại trừ cúm A 
huyết thanh 2 lần 
phết họng và mũi 
 11
A.1. Phản ứng chuỗi polime sao chép ngược (RT-PCR) 
 Phản ứng chuỗi pôlime sao chép ngược (RT-PCR) là một kỹ thuật đầy tiềm năng để định loại 
kiểu gien của virus cúm. Kiểu gien của virut (gồm có chuỗi đơn RNA) trước hết phải được tách ra. 
Sau đó, trong sao chép ngược, các bản sao DNA của RNA nguyên gốc (cDNA) được tổng hợp nhờ 
một men sao chép ngược (RT). Trong bước tiếp theo, cDNA sử dụng polyme để khuyếch đại thành 
số lượng lớn các bản sao (sản phẩm PCR). Cuối cùng, các sản phẩm cDNA hình thành qua việc 
khuyếch đại được phát hiện nhờ những kỹ thuật khác nhau và có thể được tiếp tục phân tích bằng 
các phương pháp di truyền học phân tử như sắp xếp chuỗi. 
 Trong RT-PCR thường quy, sản phẩm được phát hiện vào lúc cuối của quá trình phản ứng. 
Với RT-PCR hiện thời, sản phẩm được phát hiện khi việc khuyếch đại vẫn đang diễn ra, nên có thể 
định lượng được. Phân tích RT-PCR thường quy vẫn được sử dụng rộng rãi, nhưng ngày càng có 
nhiều phòng thí nghiệm chuyển sang các phương pháp RT-PCR hiện thời khi chi phí giảm đi 
 Với cả hai phương pháp, quy trình khuyếch đại đòi hỏi phải có cặp primơ oligonucleotide. 
Những cặp primơ này được thiết kế trên cơ sở của những chuỗi đã biết trong các gien khác nhau của 
virut cúm (gien ngưng kết hồng cầu (HA) và gien neuraminidaza (NA) thường được dùng nhiều 
nhất) với những chủng con của virut cúm được quan tâm, và do đó sẽ phát hiện được một cách rõ 
ràng RNA của chỉ 1 chủng con. Những primơ khác được định hướng vào những gien tương đối ổn 
định của tất cả mọi virut cúm A (ví dụ như gien ma trận). Do virut H5 vẫn đang tiếp tục tiến hoá, sự 
đa dạng hoá di truyền của các chủng H5N1 trong 2 năm qua đã đưa ra khuyến cáo về thách thứcđối 
với những bộ primơ cụ thể. Nhóm tác nghiệp của TCYTTG (Phụ lục C) đã được thành lập để chuẩn 
bị quy trình mẫu về các primơ RT-PCR thường quy và hiện thời để phát hiện những chủng virut cúm 
gia cầm đang lưu hành. cần có những điều kiện cận lâm sàng nói chung về an toàn sinh học, đảm bảo 
chất lượng, và năng lực chẩn đoán được mô tả trong tài liệu này, các phòng thí nghiệm sử dụng RT-
PCR để phát hiện và chẩn đoán nhiễm cúm gia cầm cần cân nhắc: Bao phủ tất cả mọi chủng H5N1 
đang lưu hành gây nhiễm cho người ở tất cả mọi khu vực, quy tắc xét nghiệm, những thực hành cận 
cận lâm sàng tốt, chuẩn định, đảm bảo chất lượng, đào tạo nhân lực, cơ sở vật chất và khu vực xử lý, 
trang thiết bị, diễn giải kết quả. Những vấn đề này có thể có tác động sâu sắc đến khả năng nhận 
được kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả. 
 A.1.1 Phân tích RT-PCR thường quy 
QUY TRÌNH RT-PCR thường quy 1
17
Các quy trình và primơ dùng để thực hiện PCR và điện di thạch thường quy trên các sản phẩm để 
phát hiện virut cúm gia cầm A(H5N1) trong bệnh phẩm thu thập từ người được nêu dưới đây. Những 
quy trình này đã tỏ ra rất có hiệu quả để định loại các chủng 1, 2 và 3 của virut H5N1 khi được áp 
dụg với những thuốc thử và primơ được chỉ định. Các phòng thí nghiệm có quan tâm đến việc xác 
định những chủng đang lưu hành nên liên hệ với một trong số các thành viên của Uỷ ban chuyên gia 
về PCR trong Cúm gia cầm của TCYTTG (Phụ lục C) hoặc một trong số các Phòng thí nghiệm H5 
chuẩn thức của TCYTTG để được hỗ trợ trong việc tìm ra primơ tốt nhất. 
 Vật liệu cần có 
 • Bộ xét nghiệm nhỏ tìm RNA virut QIAamp® (QIAGEN® Cat#51104) 
 • Bộ xét nghiệm RT-PCR một bước (QIAGEN®, Cat#210212) 
 • Chất ức chế RNA 20U/μl (Hệ thống sinh học ứng dụng Cat# N808-0119) 
 • Nước không chứa RNA 
 • Ethanol (96–100%) 
 • Máy siêu ly tâm (điều chỉnh được, đến 13.000 vòng/phút) 
 • Pipét điều chỉnh được (10, 20, 200, 100 μl) 
 • Đầu pipét không chứa RNA vô khuẩn có màng khí 
 • Máy quay 
 12
 • Ống nghiệm dùng cho máy siêu ly tâm (0,2 và 1,5ml 
 • Điều chỉnh nhiệt độ 
 • Bộ primơ 
 • Chứng dương (có thể đặt từ một Phòng thí nghiệm H5 chuẩn thức của TCYTTG
18
) 
Primơ 
Gien :H5 
Chủng :1, 2, 3 
Chuỗi primơ :H5-1: GCC ATT CCA CAA CAT ACA C
 : H5-3: CTC CCC TGC TCA TTG CTA T
 kích cỡ mong đợi của sản phẩm 219 bp 
 Nguồn tham khảo chỉnh sửa theo Juen và CS. 1998 
 Gen M 
 Chủng 1, 2, 3 
 chuỗi primer M30F: TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG 
 M264G2: ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG 
 kích cỡ mong đợi của sản phẩm 234 bp 
 nguồn tham khảo NIID19 
 Gen N1 
 Chủng 
 chuỗi primer N1-1: TTG CTT GGT CGG CAA GTGC 
 N1-2: CCA GTC CAC CCA TTT GGA TCC 
 kích cỡ mong đợi của sản phẩm 616 bp 
 nguòn tham khảo: Wright và CS. 1995 
Quy trình 
 1. Tách chiết RNA virut từ bệnh phẩm lâm sàng bằng Bộ xét nghiệm nhỏ tìm RNA virut 
QIAamp® hoặc bộ công cụ tách chiết tương đương theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 
 2. Thực hiện RT-PCR một bước. 
 Đối với các gien H5 hoặc N1 
 a. Chuẩn bị hỗn hợp chính cho RT-PCR như sau: 
 5x đệm QIAGEN® RT-PCR 10 μl 
hỗn hợp dNTP 2 μl 
5x dung dịch Q 10 μl 
Primơ chuyển tiếp (5 μM) 6 μl 
Primơ đảo ngược (5 μM) 6 μl 
Hỗn hợp men 2 μl 
Chất ức chế RNA (20U/μl) 0,5 μl 
Nước (Độ phân tử) 9 μl 
 13
Tổng cộng 45 μl 
 b. Thêm 5μl RNA virut 
 Đối với gien M 
 a. Chuẩn bị hỗn hợp chính cho RT-PCR như sau: 
5x đệm RT-PCR QIAGEN® 10μl 
Hỗn hợp dNTP 2 μl 
Primơ chuyển tiếp (5 μM) 6 μl 
Primơ đảo ngược (5 μM) 6 μl 
 Hỗn hợp men 2μl 
Chất ức chế RNA (20U/μl) 0,5μl 
Nước (Độ phân tử) 19μl 
Tổng cộng 45μl 
 b. Thêm 5 μl RNA virut 
 3. Điều kiện quay nhiệt PCR 
 H5, N1 
 Sao chép ngược 30 phút 50°C 
 Hoạt hoá PCR ban đầu 15 phút 95°C 
 quay 3 bước 
 làm biến chất 30 giây 
 luyện 30 giây 55oC 
 mở rộng 30 giây 72oC 
 số vòng 40 
 mở rộng vòng cuối 2 phút 72oC 
 M 
 Sao chép ngược 30 phút 50°C 
 Hoạt hoá PCR ban đầu 15 phút 95°C 
 làm biến chất 30 giây 
 luyện 30 giây 94oC 
 mở rộng 30 giây 50oC 
 số vòng 40 
 mở rộng vòng cuối 2 phút 72oC 
 4. Điện di thạch aga sản phẩm RT-PCR 
Chuẩn bị thạch aga, sản phẩm PCR và cân điện tử, và vận hành theo quy trình chuẩn thức. Theo dõi 
màn hình cân dưới ánh sáng tia cực tím. Ví dụ về quy trình được nêu dưới đây. 
 Vật liệu cần có 
 • Khay đúc thạch aga và buồng điện di 
 • Nguồn điện và điện cực 
 14
 • Hộp tia cực tím (302 nm) 
 • Máy ảnh và phim chống nắng hoặc máy tính kết nối với máy ảnh 
 • Pipét điều chỉnh được 
 • Thạch aga 2% trong 1× TAE 
 • Đệm 1× TAE 
 • Brômua ethidium (10 mg/ml) 
 • 6 x đệm nâng thạch (GLB) 
 • Cân điện tử 
 Quy trình 
Đúc thạch aga 
1) Đặt khay đúc thạch lên nền đúc thạch. Đưa khung vào và nâng nền lên. 
2) Chuẩn bị thạch 2% bằng cách cân 4 g bột thạch và hoà tan trong 200ml đệm 1× TAE. Hoà tan 
thạch bằng cách làm nóng trong lò viba. 
3) Làm nguội nước thạch đến khoảng 60°C, sau đó thêm 10 μl brômua ethidium. 
4) Rưới nước thạch vào khay đúc thạch. 
5) Để thạch đông lại ở nhiệt độ trong phòng. 
6) Rút khung khỏi khuôn. 
7) Đặt khay vào buồng điện di có các giếng ở phía điện cực âm. 
8) Đổ 1× TAE vào buồng đệm đến mức có thể phủ kín bề mặt thạch. 
Nạp bệnh phẩm 
1) Thêm 5 μl đệm nâng thạch vào mỗi ống nghiệm PCR. 
2) Gắn cân điện tử vào giếng thạch aga đầu tiên. 
3) Nhỏ 15 μl sản phẩm PCR/GLB lên thạch. 
4) Đóng nắp buồng và gắn điện cực. Quay thạch ở vận tốc 100V trong 30–35 phút. 
5) Theo dõi màn hình cân và dải sản phẩm PCR dưới ánh sáng tia cực tím. 
6) Chụp hình ảnh thạch. 
5. Diễn giải kết quả 
Cần so sánh kích cỡ của sản phẩm PCR thu được với kích cỡ mong đợi của sản phẩm (nêu trong các 
bảng trên). Nếu xét nghiệm được tiến hành mà không có chứng dương, sản phẩm phải được khẳng 
định bằng cách sắp xếp chuỗi và so sánh với những chuỗi sẵn có. 
 A.1.2. Phân tích RT-PCR hiện thời 
 RT-PCR hiện thời đặt ra những thách thức khác với RT-PCR thường quy. Ngoài những 
điều kiện liên quan đến RT-PCR nêu trên, những điều kiện cụ thể liên quan đến RT-PCR hiện thời 
bao gồm: 
 • Đảm bảo việc sử dụng và xử lý đúng những trang thiết bị, phần mềm, và thuốc thử có 
huỳnh quang thích hợp. 
 15
 • Đảm bảo đào tạo nhân lực một cách thích hợp về diễn giải kết quả (kinh nghiệm trong 
việc nhận biết dương tính thật, giải thích các giá trị của chứng và huỳnh quang khác thường, v.v..., 
có vai trò rất quan trọng). 
 • Việc chuẩn định trong phòng thí nghiệm và tối ưu hoá các phản ứng là thiết yếu để 
thực hiện định lượng. 
 • Ít có khả năng xảy ra nhiễm bẩn khi huỷ bỏ các phản ứng sau xét nghiệm. Tuy nhiên, 
nhiều phòng thí nghiệm vẫn tiếp tục làm phân tích sau phản ứng (ví dụ như phân tích hiện tượng 
nhiều hình thái có chiều dài đứt quãng hạn chế có sử dụng thạch, sắp xếp chuỗi) qua đó có thể tái 
nhiễm bẩn. 
 QUY TRÌNH RT-PCR hiện thời 1
21
 Tách chiết RNA virut từ bệnh phẩm lâm sàng theo cách mô tả trong Phần A.1.1. Phân tích RT-
PCR thường quy đã nêu ở trên. 
 Vật liệu cần có 
 Sao chép ngược 
10X đệm PCR I với 15 mM MgCl2 (Hệ thống sinh học ứng dụng) 
Hexamer ngẫu nhiên 50 μM (Hệ thống sinh học ứng dụng) 
Men sao chép ngược MuLV 50 U/μl (Hệ thống sinh học ứng dụng) 
Chất ức chế RNA 20 U/μl (Hệ thống sinh học ứng dụng). 
 PCR hiện thời 
Bộ công cụ LightCycler ® – FastStart™ DNA Master HybProbes (Roche) 
Primơ và hỗn hợp thuốc thử: Thêm một lượng bằng nhau những thành phần sau để chuẩn bị primơ 
và hỗn hợp thuốc thử cho H5 và M. 
 Primơ và thuốc thử 
 Gen H5 
 chủng 1; 2; 3 
Chuỗi primơ : H5-266F: 5’- TGCCGGAATGGTCTTACATAGTG -3’ (5 μM) 
 H5-1615F: 5’- GTGGCGAGCTCCCTAGCA -3’ (5 μM) 
 H5-347R: 5’- TCTTCATAGTCATTGAAATCCCCTG -3 (5 μM) 
 H5-1695R: 5’- TCTGCATTGTAACGACCCATTG -3’ (5 μM) 
 H5-290P: 5’-(FAM)-AGAAGGCCAATCCAGTCAATGACCTCTGTTA- 
(TAMRA)-3’ (2,5 μM) 
 H5-1634P: 5’-(FAM)-TGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGG-
(TAMRA)-3’ (2,5 μM) 
Gien M 
Chủng 1, 2, 3 
Chuỗi pri FLUAM-1F: 5’-AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA
(10 μM) 
 FLUA-2F: 5’-CATTGGGATCTTGCACTTGATAT
(10 μM) 
 16
 FLUAM-1R: 5’-CAA AGCGTCTACGCTGCAGT
3’ (10 μM) 
 FLUAM-2R: 5’-
AAACCGTATTTAAGGCGACGATAA-3’ (10 μM) 
 FLUA-1P: 5’-(FAM)-
TTTGTGTTCACGCTCACCGT-(TAMRA)-3’ 
(5 μM) 
 FLUA-2P: 5’-(FAM)-
TGGATTCTTGATCGTCTTTTCTTCAAATGCA- 
(TAMRA)-3’ (5 μM) 
Thực hiện RT 
Thuốc thử Thể tích (μl) / phản
10X PCR buffer I with 15 mM Mg2 
Thêm 25mM MgCl2 2,8 
2,5mM dNTPs 8 
Hexamer ngẫu nhiên 50μM 1 
Chất ức chế RNA 20U/μl 1 
Men sao chép ngược 50 U/μl 1 
RNA đã tách chiết 4,2 
(1) Quay và ly tâm sơ bộ ống nghiệm có chứa hỗn hợp. (2) Đặt ống nghiệm ở nhiệt độ trong phòng 
trong 10 phút, sau đó ủ ở 42°C trong vòng ít nhất 15 phút. 
(3) Ủ ống nghiệm ở 95°C trong 5 phút, sau đó làm lạnh trong nước đá. 
Thực hiện PCR hiện thời 
(1) Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng “Khởi động nóng” bằng cách dùng pipét nhẹ nhàng bơm 60 μl 
Thuốc thử Hỗn hợp phản ứng LC-FastStart™ (lọ 1b) vào men LC-FastStart™ (lọ 1a). 
(2) Với mỗi bệnh phẩm xét nghiệm và các chứng dương và âm, chuẩn bị hỗn hợp thuốc thử với 
primơ và hỗn hợp thuốc thử theo nội dung sau: 
Thuốc thử Thể tích (μl) 
H
2
O PCR grade 7,6 
MgCl2 (25 mM) 2,4 
Primơ và hỗn hợp thuốc thử (H5 hoặc M) 3 
Hỗn hợp phản ứng “Khởi động nóng” 2 
 17
Tổng cộng 15 
Mỗi phản ứng: 
Hỗn hợp chính 15 
cDNA 5 
Điều kiện quay nhiệt PCR 
Nhiệt độ Thời gian (phút : g Số vòng 
95 10:00 1 
95 0:10 
56 0:15 
72 0:10 
} 50 
40 0:30 1 
 B.Phân lập virus 
 Phân lập virus bằng cách nuôi cấy là một kỹ thuật nhậy cảm với ưu điểm là sau đó sẽ có được 
loại virus này để định loại và tiếp tục mô tả các đặc điểm di truyền và kháng nguyên học, xét nghiệm 
tính nhậy cảm với thuốc, và chuẩn bị văcxin. Môi trường tốt nhất để virus cúm mọc bao gồm các tế 
bào MDCK hoặc trứng gà có phôi. Không giống như các chủng virut cúm A khác, cúm A(H5N1) 
cũng sẽ mọc trong những dòng tế bào chung khác như Hep-2 và RD. Để tăng trưởng, virut cúm 
A(H5N1) ở người không đòi hỏi phải có thêm tripxin ngoại sinh. Sau đó có thể tiến hành định loại 
và kiểu hình của virut cúm được nuôi cấy bằng các thử nghiệm PCR, miễn dịch huỳnh quang (IFA) 
sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu, hoặc ngưng kết ức chế hồng cầu (HA) và phân tích kháng 
nguyên (xác định kiểu phụ) bằng thử nghiệm ngăn ngưng kết ức chế hồng cầu (HI) có sử dụng các 
kháng nguyên tham chiếu chọn lọc. Chỉ nên nuôi cấy virut khi đảm bảo có cơ sở vật chất đạt mức độ 
BSL-3, và cần thực hiện các biện pháp phòng ngừa an toàn sinh học khi xử lý nuôi cấy tế bào có thể 
chứa cúm gia cầm có độc tính cao. 
Vật liệu cần có 
 • Các tế bào thận Madin-Darby Canine (MDCK), ATCC CCL34 
 • Bộ thuốc thử xét nghiệm bệnh cúm của TCYTTG để định loại virut cúm A(H5). Thuốc thử 
để định loại virut cúm A(H5N1) trong nuôi cấy tế bào bao gồm: 
 o kháng nguyên kiểm soát virut cúm A(H5N1): virut bất hoạt 
 o huyết thanh dê cho A/Tern/South Africa/61/H5 
 o huyết thanh hỗn hợp của gà cho A/Goose/Hong Kong/437-4/99 
 • Bộ thuốc thử xét nghiệm bệnh cúm của TCYTTG (phân phối hàng năm) − các kháng 
nguyên tham chiếu A(H1N1) và A(H3N2) 
 • Men phá huỷ thụ cảm (RDE). 
 18
 • Các tế bào hồng cầu (gà, gà tây, người týp O, hoặc tế bào hồng cầu chuột lang) trong 
dung dịch Alsever. 
 Quy trình 
 Cần tuân thủ các quy trình chuẩn thức nuôi cấy tế bào trong phòng thí nghiệm trong các khâu nhân 
giống nuôi cấy tế bào, tiêm bệnh phẩm, và gặt tế bào bị nhiễm để làm IFA 
 hoặc nước nổi nuôi cấy cho xét nghiệm HA và HI (Lennette & Schmidt, 1995; WHO, 2002
24
), 
RT-PCR, hoặc phân tích chuỗi. 
Cần tuân thủ các quy trình chuẩn thức về HA và HI, đảm bảo có đủ tất cả mọi chứng được khuyến 
cáo. Chi tiết cụ thể về những quy trình này được nêu trong tài liệu của TCYTTG về chẩn đoán và 
giám sát bệnh cúm ở động vật
25
. 
 Diễn giải kết quả 
Độ pha loãng cao nhất của virut cho phép ngưng kết ức chế hồng cầu hoàn toàn là điểm kết thúc 
trong xác định hiệu giá HA. Độ pha loãng cuối cùng của kháng huyết thanh cho phép ngăn ngưng 
kết ức chế hồng cầu hoàn toàn là điểm kết thúc của HI. HIệu giá được biểu diễn ở dạng tỷ số của độ 
pha loãng cuối cùng. 
Định loại phân lập từ thực địa được tiến hành bằng cách so sánh kết quả của phân lập không rõ với 
các chứng kháng nguyên. Một phân lập được xác định là một chủng con đặc hiệu của virut cúm A 
nếu hiệu giá kháng thể HI đặc hiệu với chủng con của virut cúm A là 4 lần hoặc cao hơn so với hiệu 
giá thu được từ kháng huyết thanh khác. 
Ngưng kết tố không đặc hiệu có thể xuất hiện trong huyết thanh và dẫn đến các phản ứng giả âm 
tính; tương tự như vậy, một số phân lập có thể rất nhậy cảm với chất ức chế không đặc hiệu trong 
huyết thanh, dẫn đến các phản ứng giả dương tính. 
 3. Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang 
 Có thể dùng thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang (IFA) để định loại virut cúm trong nuôi cấy 
tế bào. Thực hiện IFA trên nuôi cấy tế bào được tiêm nhiễm rất hữu ích cho việc xét nghiệm bệnh 
phẩm lâm sàng vì nó cho phép khuyếch đại mọi virut hiện diện ở đó. 
Vật liệu cần có 
 • Bộ thuốc thử xét nghiệm bệnh cúm của TCYTTG để định loại virut cúm A(H5N1) (phiên bản 
1997–98, 2003 hoặc 2004). Thuốc thử trong bộ này dùng cho thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang 
bao gồm: 
 o hỗn hợp kháng thể đơn dòng đặc hiệu với virut cúm týp A(H5) 
 o hỗn hợp kháng thể đơn dòng đặc hiệu với virut cúm týp A và týp B 
 o kháng thể đơn dòng đặc hiệu với virut cúm A(H1) và A(H3) 
 • Tiếp hợp IgG FITC kháng chuột 
 • Phim cho kính hiển vi 
 • Nắp đậy, 24 x 60 mm 
 • Hồ dán 
 • Axeton 
 • Kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang. 
Quy trình 
Cần thực hiện xét nghiệm này một cách phù hợp với những hướng dẫn nêu trong Bộ thuốc thử xét 
nghiệm bệnh cúm của TCYTTG. Làm sạch tế bào biểu mô khỏi chất nhầy nhiễm bẩn bằng cách 
 19
quay ly tâm, cố định, và hãm màu với kháng thể đơn dòng đặc hiệu. Tế bào biểu mô hô hấp nhiễm 
bệnh trong bệnh phẩm lâm sàng rất không ổn định và dễ bị phá huỷ; do đó cần giữ chúng lạnh trên 
nước đá trong quá trình xử lý và không ly tâm trên 500g. Cần có cả phim chứng có tế bào bị nhiễm 
virut cúm A(H3) và A(H1) (và, nếu có, tế bào bị nhiễm virut H5), và tế bào không bị nhiễm để cho 
phép kiểm soát thích hợp kháng thể đơn dòng và liên hợp, và để giúp diễn giải việc hãm màu cụ thể. 
 Diễn giải kết quả 
Cần hãm mãu cụ thể bằng huỳnh quang màu xanh táo nội bào mạnh. Có thể quan sát được huỳnh 
quang tế bào chất hoặc hạt nhân. Điều quan trọng là đảm bảo rằng mật độ tế bào đủ cao. Có thể coi 
là có kết quả dương tính nếu một hoặc nhiều tế bào nguyên vẹn thể hiện có huỳnh quang nội bào cụ 
thể. 
Vì những kháng thể đơn dòng thương mại sẵn có để định kiểu phụ của virut cúm A(H1) đã tỏ ra có 
tương tác chéo với các chủng con của virut cúm A(H5), trong đó có các chủng của năm 2004, nên 
với xét nghiệm khẳng định cần sử dụng kháng thể đơn dòng có trong bộ xét nghiệm của TCYTTG. 
 V. Kết luận 
 Quy trình RT-PCR, phân lập virus,thử nghiệm miên dịch huỳnh quang dụng đều cho phép phát 
hiện được RNA của virus cúm gia cầm. Trong đó phương pháp RT-PCR là cho kết quả tốt nhất lại 
nhanh chóng đơn giản tiết kiệm thời gian,chính xác và chi phí thấp. 
 Phụ lục B 
 Tài liệu tham khảo 
 google.com.vn 
 Khuyến cáo và quy trình xét nghiệm để phát hiện virus cúm gia cầm A( H5N1) trong bệnh 
phẩm thu thập từ các ca nghi nhiễm bệnh ở người của “ World Health Oganization” 
 Chẩn đoán và xử lý sớm bệnh do virus cúm A /H5N1) của Ts.Bs Trần TỊnh Hiền 
 Nguyễn Ngoc Hải “công nghệ sinh học trong thú y” nhà xuất bản nông nghiệp 
 www.vcn.vnn.vn 
 • Lennette EH, Schmidt NJ, eds (1979). Diagnostic procedures for viral, rickettsial and 
chlamydial infections, 5th ed. Washington, DC, American Public Health Association 
 • WHO (2002). WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. 
 • WHO (2004). WHO Laboratory Biosafety Manual - Third Edition, 
 • WHO (2005). WHO global influenza preparedness plan, 2005. 
ml 
 • WHO (2005). WHO guidelines for the storage and transport of human and animal specimens 
for laboratory diagnosis of suspected avian influenza A infection January 2005. 
 • WHO (2005). WHO laboratory biosafety guidelines for handling specimens suspected of 
containing avian influenza A virus January 2005. 
 • WHO (2006). Collecting, preserving and shipping specimens for the diagnosis of avian 
influenza A(H5N1) virus infection. Guide for field operations October 2006. 
x.html 
 20
 • WHO (2007). The role of National Influenza Centres (NICs) during interpandemic, pandemic 
alert and pandemic periods, Interim document, May 2007. 
 • WHO (2006). WHO case definitions for human infections with influenza A(H5N1) virus 
August, 2006. 
l 
 • WHO (2007). WHO guidelines for investigation of human cases of avian influenza A(H5N1) 
January, 2007. 
ml 
 • WHO (2007). WHO H5 Reference Laboratories: 
 • WHO (2007). WHO National Influenza Centres 
 21
Phụ lục số trang 
\ 
. Đặt vấn đề 2 
II. Virus cúm gia cầm 
 1. Giới thiệu về virus cúm gia cầm 2 
 2. Những đại dịch cúm trong lịch sử loài người 3 
 3. Cấu tạo của virus cúm A 4 
 4. Cấu trúc di truyền và các typ lien quan 5 
 5. Các tính chất của virus 7 
 6. Khả năng gây bệnh của virus 8 
 a. Sự lan truyền của virus trong cơ thể 
 b. Hình ảnh lâm sang 
 c. Dịch tễ học 
 d. Xét nghiệm 
III. Phương pháp chẩn đoán bệnh 
 1. Các xét nghiệm chẩn đoán 10 
 2. Để xét nghiệm phát hiện virus H5N1 , cần lấy bệnh phẩm gì 10 
 3. Quy trình xét nghiệm để chẩn đoán 11 
 A. Xét nghiệm phân tử 
 A.1. Phản ứng chuỗi polime sao chép ngược (RT-PCR) 11 
 A.1.1. Phân tích RT-PCR thường quy 12 
 A.1.1. Phân tích RT-PCR hiện thời 15 
 B. Phân lập virus 18 
 C. Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang 19 
VI. Kết luận 20 
Tài liệu tham khảo 20 
 22
 23
 24
 25
 26