Tiểu luận Chẩn đoán virus dịch tả heo (Classical Swine Fever Virus) bằng kĩ thuật gen - Nguyễn Cao Lê Hiền

GVHD : Nguyễn Ngọc HảiSV : Nguyễn Cao Lê HiềnMSSV : 06126040Chẩn đoán virus dịch tả heo(Classical Swine Fever Virus) bằng kĩ thuật gen1I- Đặt vấn đềII- Nội dung 1- Virus dịch tả heo (DTH) 2- Chẩn đoán virus DTH bằng kĩ thuật gen a- kĩ thuật RT-PCR b- kĩ thuật RT-nested PCR c- kĩ thuật Real-time RT-PCRIII- Kết luậnTài liệu tham khảo2I- Đặt vấn đề DTH là bệnh rất dễ lây, sự lây lan chủ yếu là do sự tiếp xúc giữa những heo sống với nhau, với những sản phẩm của heo bệnh, hoặc những nguyên nhân khác Hiện nay, tình hình bệnh DTH ở một số quốc gia trên thế giới và Việt Nam tuy không còn xảy ra ồ ạt và mãnh liệt nhưng bệnh này vẫn luôn là mối đe dọa tiềm ẩn đối với ngành chăn nuôi heo. Do đó, chẩn đoán bệnh DTH bằng phương pháp gen là bước nghiên cứu cần thiết cho điều tra dịch tễ học để có những thông tin hữu ích, góp phần xây dựng kế hoạch, chương trình khống chế và thanh toán bệnh DTH- một trong 4 bệnh “đỏ” của ngành chăn nuôi Việt Nam.3II- Nội dung1. Virus DTHVirus CSF thuộc Họ Flaviviridae Giống Pestivirus Chỉ có một kiểu huyết thanh của virus Hình: cấu trúc bộ gen virus DTH4 2. Chẩn đoán virus DTH bằng kĩ thuật gen2.1. Kĩ thuật RT-PCR2.1.1. Nguyên tắc chung Về nguyên lý, kĩ thuật RT- PCR cũng giống như kĩ thuật PCR thông thường khuếch đại đoạn gen từ khuôn RNA Có hai giai đoạn khuếch đại: Quá trình tổng hợp sợi cDNA từ khuôn mẫu sợi RNA Quá trình tổng hợp đoạn DNA từ bản sao cDNA 562.1.2.Quy Trình thực hiện kỹ thuật RT-PCRBước 1: 50µl hỗn hợp phản ứng cho vào ống eppendorf gồm: ● 5 μl 10 x buffer ●12 μl MgCl2 (25 mM) ●2 μl dNTPs (10 mM) ● 0.25 μl mỗi primer (20 pmolμl-1) ● 1 μl Triton X-100 (10% stock) ● 0.5 μl Taq polymerase (2.5 U) ● 0.25 μl RNasin (10 U) ● 0.5 μl MMLV reverse transcriptase (100 U) ●Cuối cùng thêm 2µl RNA cùng với 50µl nước, phủ thêm một lớp dầu khoáng. Bắt đầu chu trình nhiệt. 7Bước 2: Đặt ống vào máy luân nhiệt và thực hiện chu trình nhiệt sau: Bước RT: 42ºC trong 30 phút, 95ºC trong 3 phút Bước PCR khuếch đại 20 chu trình: 94ºC trong 1 phút, 60ºC trong 1 phút, 72ºC trong 1phút, 72ºC trong 1 phút (5’NCR) hoặc 10 phút (E2)Bước 3: Phát hiện sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 2% (0,2 µg/ml) và đọc kết quả dưới đèn tia cực tím Chuẩn bị đối chứng dương và đối chứng âm cho mỗi lần thí nghiệm cùng với mẫu được kiểm tra.8 Các cặp mồi sử dụng trong RT-PCR để chẩn đoán virus DTH Paton et al., 2000 5’ AGR CCA GAC TGG TGG CCN TAY GA 3’ 5’ TTY ACC ACT TCT GTT CTC A 3’ Vilcek et al., 1996 5’ ATG CCC T/ATA GTA GGA CTA GCA 3’ 5’ TCA ACT CCA TGT GCC ATG TAC 3’9CSFV dòng SNUVR2345 105 TCID50 /100µlKết quả RT-PCR từ mẫu phổi của heo (58 ngày tuổi):1. đối chứng dương dòng SNUVR23452. đối chứng âm3. CSFV được phân tách từ heo 14. CSFV được phân tách từ heo 35. CSFV được phân tách từ heo 56. CSFV được phân tách từ heo 67. CSFV được phân tách từ heo 11M-thang 100bp102.2.Phương pháp RT-nested PCR Kĩ thuật nested-PCR là một PCR thứ hai, khi sản phẩm PCR thứ hai được dùng như DNA mẫu cho sự khuếch đại lần thứ hai với một cặp mồi được thiết kế nằm bên trong sản phẩm của PCR thứ nhất112.2.1. Quy trình thực hiện122.2.2. Primer sử dụng trong RT-nested PCR:  Primer V324 5’ AGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCG 3’ Primer V326 5’ CAACTCCATGTGCCATGTACAGCAG 3’ Primer A115’ ATGCCCWTAGTAGGACTAGCA 3’ Primer A145’ TCAACTCCATGTGCCATGTA 3’132.2.3.Qui trình thực hiện phản ứng RT-nested PCR (McGoldrick, 1999) Bước 1: chuẩn bị hỗn hợp nguyên liệu (master mix 1) cho nested PCR gồm có: ●Trehalo 22% : 5µl ● dNTPs (10m ) : 1µl ● Taq polymerase (5U/ µl) : 0,25 µl ●Primer V326 (20pmol/ µl) ) : 1µl Bước 2: chuẩn bị master mix 2 cho RT-PCR gồm có:● MgCl2 (25mM) : 12 µl● dNTPs (10mM) : 1µl●Triton X-100 (10%) : 1µl● Taq polymerase (5U/ µl) : 0,5 µl● MMLV_RT (200U/ µl) : 0,5 µl, RNAsin (40U/ µl): 0,25 µl H2O : 23,25 µl● RNA được chiết ở trên : 5µ● Primers A14 (20 pmol/ µl) :0,25 µl.14Bước 3: đặt ống PCR vào máy luân nhiệt và chạy chương trình nhiệt như sau cho RT-PCR ● Giai đoạn RT: 420C : 30 phút 950C : 5 phút ● Giai đoạn PCR (lặp lại 20 chu kì): 940C : 1 phút 600C : 1 phút 720C : 1 phút 40C :cho đến khi tiến hành bước tiếp sauBước 4: đặt ống PCR vào máy luân nhiệt và chạy chương trình nhiệt như sau cho nested PCR , lặp lại 30 chu kì 940C :1 phút 600C :1 phút 720C :1 phút (cho trình tự 5’UTR) 720C :10 phút ( cho trình tự E2) 40C :cho đến khi tiến hành bước tiếp sau15Bước 5: điện di sản phẩm RT-nested PCR trên gel agarose 2% ở 100V, 45 phút trong đệm TBE1X Kết quả: Cách đọc kết quả điện di sản phẩm RT-nPCR dưới đèn cực tím: Nếu xuất hiện một trong hai vạch sản phẩm 283 bp hay 211 bp Hoặc cả hai vạch sản phẩm này cùng một lúc thì kết luận dương tính virus DTH Nếu không xuất hiện vạch sản phẩm nào thì kết luận âm tính virus DTH 16Kết quả172.3.Kĩ thuật Real-time RT-PCR2.3.1. Nguyên tắc: Real-time PCR là phương pháp khuếch đại gen, trong đó cả hai quá trình khuếch đại đoạn gen và đọc kết quả được thực hiện đồng thời trong cùng một ống hay một giếng mẫu. Là kĩ thuật cho phép định lượng trực tiếp phản ứng PCR đang diễn ra thông qua đo lường và xác định hàm lượng tín hiệu huỳnh quang.182.3.2. Trình tự primer và probe: ● Forward primer, bắt đầu tại vị trí base 180: 5’CCCTGGGTGGTCTAAG (Risatti et al., 2003) ● Reverse primer, bắt đầu tại vị trí base 247: 5’CATGCCCTCGTCCAC (Risatti et al., 2003) ● Real-time probe, bắt đầu ở base 139:5’CCTGAGATCAGGACAGTCGTCAGTAGTT (Risatti et al., 2003)192.3.3. Qui trình thực hiện Giải trình tự nucleotide của CSFV bằng phần mềm giải trình tự BioEdit. Primer và probe phát huỳnh quang (Taqman ) được thiết kế cho vùng 5’UTR của bộ gen CSFV (GenBank accession number NC-000294.1)- phân tích RT-PCR một ống Chu trình nhiệt bao gồm: Tạo cDNA ở 60 °C trong 10 phút. Ngay sau đó, phản ứng PCR thực hiện với 45 chu kỳ gồm các bước 95 °C trong 2 giây, 60 °C trong 30 giây. 20 Phản ứng RT-PCR được thực hiện với thể tích 25 μl chứa: ● 5 mM Mn2 acetate ● 0,3M mỗi primer ● 0,1 mM dATP, dCTP hay dGTP ● 0,2M dUTP ● 0,1U/ μl của Tth DNA polymerase tái tổ hợp ● 0,1 μg/ μl albumin huyết thanh bò và 0,5 M trehalose ● Hỗn hợp cuối cùng được làm khô trong ống phản ứng (Fisher Scientific, Atlanta, Ga.): gồm 22.5 µl của 1xbuffer (ở trên) và 2.5 µl RNA mẫu.212.3.4. Kết quả223. Kết luận Các kĩ thuật PCR được phát triển để phát hiện RNA của virus CSFV trong các mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này không những có độ đặc hiệu và độ nhạy cao mà thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm cũng ngắn hơn so với phương pháp nuôi cấy tế bào. Vì thế nó được sử dụng khá rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện virus Hiện nay, kĩ thuật PCR được kết hợp thêm với lai phân tử (Hybridization) để làm tăng độ nhạy phát hiện của kỹ thuật PCR23 Tuy nhiên do những nghiên cứu còn hạn chế, kĩ thuật còn phức tạp, giá thành và chi phi cho những phương pháp và bộ kit còn khá cao và đòi hỏi phải có chuyên môn và kiến thức trong việc sử dụng Hi vọng rằng trong tương lai các kĩ thuật này sẽ được phát triển rộng rãi, hoàn thiện các qui trình để người sử dụng có thể dễ dàng thao tác, áp dụng trong thực tiễn cũng như trong nghiên cứu.24Tài liệu tham khảo● Nguyễn Ngọc Hải, công nghệ sinh học trong thú y, nhà xuất bản nông nghiệp.● Phạm Vũ Phong. Ứng dụng kĩ thuật RT-nPCR trong một ống để chẩn đoán bệnh dịch tả heo. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp.●Risatti, 1L. Holinka; 1 Z. Lu, 1 G. Kutish, 1 J.D. Callahan, 2 W.M. Nelson, 2 E. Brea Tio, 3 and M.V. Borcal *. Diagnotic Evaluation of a Real- Time Reverse Transcriptase PCR. Assay for Detection of Classical Swine Fever Virus, G; Plum Island Animal Diease Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Greenport, New York 1; Tetracore Inc., Gaithersburg, Maryland 2; and laboratorio Veterinario Central “LAVECEN”, Santo Domingo, Dominican Republic3.●  google.com.vn25Cảm ơn thầy giáo đã quan tâm đến bệnh DTH !26