Tiểu luận Chuẩn đoán virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) bằng kĩ thuật gen - Đỗ Phong Lưu

Chuẩn đoán virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) bằng kĩ thuật genSinh viên thực hiện :Đỗ Phong LưuGiáo viên hướng dẫn :PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Mục LụcHội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn IVirus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv)IIỨng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSKết luậnIIIIIIIVI. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS)I. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợnTrong cơ cấu kinh tế nông nghiệp ở nước Việt Nam, chăn nuôi chiếm hơn 21% giá trị sản xuất nông nghiệp, trong đó chăn nuôi heo chiếm 60% giá trị sản xuất toàn ngành.Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) là bệnh xảy ra trên lợn với đặc điểm gây sảy thai ở lợn nái và rối loạn đường hô hấp trên lợn sơ sinh và lợn choai.Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Bắc Mỹ vào khoảng năm 1987, sau này được tìm thấy ở Châu Âu (Albina, 1997), Pháp, Tây Ban Nha, Canada và ở Châu Á vào đầu những năm 1990Năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y quốc tế (OIE) khẳng định có PRRS lưu hànhI. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợnỞ Việt Nam Lần đầu tiên vào năm 1997, PRRS được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam. Đợt dịch đầu tiên: Bắt đầu vào ngày 12/3/2007, hàng loạt các đàn lợn tại Hải Dương có những biểu hiện ốm và chết khác thường. Đợt dịch thứ 2: Ngày 25/6/2007, dịch lại xuất hiện tại tỉnh Quảng Nam.TTTỉnhSố huyệnSố xãSố lợn mắc bệnhSố lợn chết và xử lýTổng số lợnLợn náiLợn conLợn thịtTổng số lợnLợn náiLợn conLợn thịt1Hải Dương533112691356577541383611715178811082Hưng Yên85654271104218121428162015101503Bắc Ninh32249071555299216482824Bắc Giang5215045165822461141291931985Thái Bình241738177133822312635616792236Hải Phòng144611292706250231987Quảng Ninh1629033761827700110113787391Tổng số251463175063551662984067296181241491580Tổng hợp tình hình dịch bệnh tai xanh tại các tỉnh phía Bắc trong đợt 1I. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợnTTTỉnhSố huyệnSố xãSố lợn mắc bệnhSố lợn chết và xử lýTổng sốLợn náiLợn conLợn thịtTổng sốLợn náiLợn conLợn thịt1Quảng Nam128930506910516376487563391986302413262Thừa ThiênHuế351575352107614732286218183Đà Nẵng212625178390571141387144Quảng Ngãi277278010354335281127Tổng số191133343397151794556227127216634561358Bảng tổng hợp tình hình dịch bệnh tai xanh tại các tỉnh miền Trung (từ 25/6-31/7/2007)I. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợnII. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv)II. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv)II.1. Tổng quát :Được phát hiện tại Mĩ vào năm 1987Thuộc giống Artervirus, họ Arteviridae, loài NidoviralesVirus này hiện diện trong dịch nước mũi, nước bọt, tinh dịch, phân... của heoII. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv)II.2. Các chủng virus PRRS và sự phân bố của chúng :Hiện có các dòng gây bệnh tại Mĩ và Châu Âu. Các nghiên cứu phân tử cho thấy giữa virus gây PRRS tại Châu Âu và Mĩ chỉ tương đồng 60% về nguyên liệu di truyền (bộ gene virus). Tùy theo ORF mà sự tương đồng về gene giữa 2 dòng PRRSV châu Mĩ và châu Âu dao động từ 52-81%II. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv)II.3.Đặc tính sinh học của virus Rất thích hợp với đại thực bào. Chủng virus Bắc Mỹ và các chủng virus châu Âu lại tạo ra các triệu chứng lâm sàng về hô hấp và sinh sản ở lợn rất giống nhau nhưng khác biệt về di truyền và kiểu hình. Lợn dễ dàng bị nhiễm khuẩn thứ phát. Tỷ lệ viêm phổi kế phát do vi khuẩn có sẵn trong đường hô hấp của lợn như: liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, vi khuẩn suyễn, vi khuẩn tụ huyết trùng.II. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv)II.4.Sức đề kháng của virusVirus ổn định trong thời gian dài (nhiều tháng đến nhiều năm) ở nhiệt độ -200C đến -700C . Virus tồn tại và ổn định ở môi trường có pH= 6,5-7,5. Virus sẽ bị diệt dưới ánh sáng mặt trời. Virus dễ dàng bị diệt trong dung môi hòa tan chất béo. Các thuốc thông thường đều có thể diệt được virus (Iodin; Cloramin B, T (Clorin) 2-3%; Dung dịch xút (NaOH) 3%; Formol 3%; Virkon 1%; Nước vôi 10%; Vôi bột)II. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv)II.5. Cấu trúc phân tử của virus PRRSII. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv)Hình : Tổ chức bộ gen của virus PRRSĐại thực bào với các "chân giả" Đại thực bào không còn các "chân giả"II.6. Cơ chế gây bệnhII. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv)II. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv)II.7. Bệnh tíchLợn nái :Sảy thaiTăng tỷ lệ thai chếtDa nhiều vùng có màu xanh tím Lợn con :Dịch thẩm xuất trong đường tiêu hóa và đường hô hấpPhù Thanh dịch trong xoang phúc mạc, xoang ngực, xoang phế mạc và tung cách mạc Sưng hạch bạch huyết II. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv)II.8. Đường truyền lâyTiếp xúc giữa lợn ốm và lợn khỏe là đường truyền lây chính của bệnh Tinh dịch lợn có khả năng nhiễm virus vì vậy bệnh có thể truyền qua đường sinh dục. Các chất bài tiết như phân, nước tiểu lợn bệnh cũng có khả năng có virus Virus cũng có thể từ lợn bệnh truyền sang lợn khỏe qua các dung cụ chăn nuôi. Virus có mặt trong hạch lâm ba, phổi với số lượng lớn hơn nhiều trong thịt và có khả năng giữa được độc lực trong điều kiện lạnh (khi giữa thức ăn)III. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSCó rất nhiều phương pháp để chuẩn đoán PRRS trong phòng thí nghiệm.Cụ thể như là :Chẩn đoán PRRSV trên môi trường nuôi cấy tế bào.Phương pháp kháng thể huỳnh quang (Fluorescent Antibody Staining - FA) và hoá mô miễn dịch (immunohistochemistry staining - IHC).Kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp(Immunoperoxidase Monolayer Asssay)Kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp (Indirect Immunoflourescence assay – IFA)Kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán PRRSV Chẩn đoán PRRSV trên môi trường nuôi cấy tế bàoP.P kháng thể huỳnh quangKỹ thuật huỳnh quang gián tiếpKỹ thuật RT-PCR chẩn đoán PRRSVKỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớpCác phương pháp để chuẩn đoán PRRS trong phòng thí nghiệmIII. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSKỹ thuật RT-PCR chẩn đoán PRRSVCác bước tiến hành phân tíchThu nhận và phân tích kết quảĐiện di sản phẩm PCRThực hiện phản ứng RT-PCRLy trích RNA từ huyết thanhChuẩn bị mẫuIII. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.1. Chuẩn bị mẫu Lấy huyết thanh, tế bào ở lách và phổiLy trích từ 4-6 tuần sau khi heo nhiễmKhông lấy mẫu từ heo con đã bú mẹBảo quản ở 40C trong tối đa 48 giờIII. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.2. Ly trích RNA từ huyết thanhQuy trình ly trích RNA theo bộ kit QIAamp Viral RNA Mini KitThu nhận Tế bào MARC-145 nhiễm PRRSV NVSL khi 70-80% tế bào đã nhiễm có biểu hiện nhiễm.Xử lý RNA từ các tế bào nhiễm với Trizol LS Reagent.RNA tổng số thu được từ MARC-145 nhiễm dùng làm khuônIII. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.3. Thực hiện phản ứng RT-PCRRT-PCR được thực hiện với nhiều cặp mồi khác nhau, cho phép phát hiện gene của các ORF7, ORF6 hay ORF1b của virus. Tiến hành trong 35 chu kỳ Phân tích sản phẩm bằng điện di trên gel agarose và chất nhuộm màu Ethidium Bromide III. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.3. Thực hiện phản ứng RT-PCR RT-PCR có thể được thực hiện với nhiều loại mẫu khác nhau : máu, huyết thanh, mô, tinh dịch, dịch phế quản, dịch phổitrên cơ thể thú sống hoặc thú chết. Đây là ưu điểm quan trọng của RT-PCR. Một vài cặp mồi sử dụng trong kỹ thuật RT-PCR : Rovira và cộng sự, 20025’ CCT CGT CAA GTA TCG CCG GTA 3’5’GAC TGT CAA ATT AGC TTG CAC CC 3’ Meritxel Donadeu, 19995’ CCA GCC AGT CAA TAC RCT GTG 3’5’ GCG AAT CAG GCG CAC WGT ATG 3’ III. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.4.Chẩn đoán PRRSV bằng RT-PCR với mẫu tinh dịchJane Christopher-Hennings, et al. ; Detection of PRRSV in Boar Semen by PCR ; Journal of Clinical Microbiology, July.1995, p1730-1734III. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.4.1 Chuẩn bị mẫu :Nuôi cấy virus PRRS trên PAMTiêm vào heo : 2 ml, nồng độ 106.5Tinh dịch được lấy 2 lần mỗi tuần trong suốt 8 tuần sau khi tiêm.III. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.4.2. Primers :Primer được thiết kế từ ORF 7 của chủng virus VR-2332Primer cho phản ứng outer : 5’-TCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGC- 3’5’-GCCATTCACCACACATTCTTCC- 3’Primer cho phản ứng nested :	5’-CCAGATGCTGGGTAAGATCATC-3’	5’-CAGTGTAACTTATCCTCCCTGA-3’III. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.4.2. Primers :Primer được thiết kế từ ORF 1b của chủng virus Lelystad (LV). Primer cho phản ứng outer :	5’-CCGTCACCAGTGTGTCCAA-3’	5’-CCGTTCTGAAACCCAGCAT-3’Primer cho phản ứng nested :	5’-ACATGGTATTGTCGGCCTT-3’	5’-CGTTCTGAAACCCAGCATC-3’III. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.4.3. Khuôn :Phiên mã ngược RNA của PRRS virus bằng bộ kit GeneAmp RNA PCR III. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.4.4. Tiến hành phản ứng :Phản ứng outer2mM MgCl2, 1X PCR buffer II, 0.15 µM primer outer, 2.5 U enzyme DNA Taq polymerase, 65.5 µl nước cất 40 chu kỳ : 950C/25 giây, 580C /5 giây và 740C/25 giâyIII. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.4.4. Tiến hành phản ứng :Phản ứng nested2 µl của sản phẩm outer PCR, 3mM MgCl2, 0.4mM/1 dNTP, 2.5 U enzyme DNA Taq polymerase, 2.4 µM pimer nested, 8 µl PCR II 10X, 19.5 µl nước cất 30 chu kỳIII. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.4.5. Điện di :9 µl sản phẩm 2 µl đệm 1XGel agarose 1% 1 µg ethidium bromide/2ml agaroseQuan sát sản phẩmORF7 : 484bp outer, 236bp nested ORF1b : 252bp outer, 200bp nested III. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.4.6. Kết quả :III. Ứng dụng kỹ thuật gen vào chuẩn đoán virus PRRSIII.4.6. Kết quả :IV. Kết LuậnIV. Kết LuậnTrong nền kinh tế thị trường đòi hỏi người sản xuất tạo ra nhiều sản phẩm. Việc nuôi heo thâm canh đã đáp ứng đòi hỏi của thị trường, chính vì thế đã tạo điều kiện thuận lợi cho chủng virus PRRS có cơ hội phát triển và đột biến tạo ra nhiều chủng mới có độc lực cao.Thông qua bài tiểu luận này ta phần nào hiểu rõ hơn về virus PRRS,nắm được cấu tạo và tác hại mà nó mang đến cho quá trình chăn nuôi IV. Kết LuậnVì vậy ,việc chọn ra một phương pháp hiệu quả để chuẩn đoán virus PRRS là rất cần thiết. Trong bài tiểu luận này em đã tập trung vào tìm hiểu phương pháp chuẩn đoán virus PRRS sử dụng kỹ thuật RT-PCR đây là một trong những phương thức chuẩn chính xác và nhanh chóngIV. Kết LuậnTuy nhiên bên cạnh những mặt tích cực của phương pháp ta cần kể đến một số hạn chế như chi phí để tiến hành còn cao do vật liệu và thiết bị sử dụng cho kỹ thuật này đa phần nhập từ nước ngoài .Bên cạnh đó do độ nhạy của phương pháp nay rất cao nên dễ dẫn đến hiện tượng dương tính giả gây ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm vì thế cần chú ý trong quá trình tiến hành và xem xét kỹ quy trình thực hiện để có được kết quả đáng tin cậy nhấtTài liệu tham khảo1. Nguyễn Thái Sơn ,Vai trò gây bệnh trên người của H.pylori luận án tiến sỹ y khoa , Hà Nội ,2002,13-15.2. Đỗ Ngọc Liêm ,miễn dịch học cơ sở , nhà xuất bản đại học quốc gia Hà Nội .3. Nguyễn Ngọc Lanh , Văn Đình Hoa ( chủ biên năm 2003 ) miễn dịch học xuất bản lần II nhà xuất bản y học Hà Nội .4. Vũ Triệu An , Jean claude Homberg (2001 )miễn dịch học in lần II có sủa chữa bổ sung , nhà xuất bản y học Hà Nội .5. Nguyễn Ngọc Hải (2007), Công nghệ sinh học trong thú y, Nhà xuất bản Nông Nghiệp.Tài liệu tham khảo6. Phan Văn Chinh, bài giảng môn học bệnh truyền nhiễm, Khoa chăn nuôi thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm.7. Hướng dẫn phòng trị bệnh ký sinh trùng,bệnh nội khoa và nhiễm độc ở bò sữa. PGS.TS Phạm Sỹ Lăng – PGS.TS Lê Văn Tạo. NXB Nông Nghiệp Hà Nội,2006.8. Đỗ Ngọc Liêm ,miễn dịch học cơ sở , nhà xuất bản đại học quốc gia Hà Nội .Tài liệu tham khảo9. CHO H.J., MCNAB B., DUBUC C., JORDAN L., AFSHAR A., MAGAR R., PRINS S. & EERNISSE K. (1997). Comparative study of serological methods for the detection of antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Can. J. Vet. Res., 61, 161–166.10. E. KOSINOVA, I. PSIKAL, Restriction fragment length polymorphism of ORF6 and ORF7 genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccine strains registered in the Czech Republic, Veterinarni Medicina, 51, 2006 (8): 414–422Thank You !