Tiểu luận Phát hiện và định lượng Virus Aujeszky trên heo bằng kỹ thuật Nested PCR và Real-Time PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHBỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌCBài tiểu luậnPHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS AUJESZKY TRÊN HEO BẰNG KỸ THUẬT NESTED PCR VÀ REAL-TIME PCR.Giáo viên hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Ngọc HảiSinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Phương ThảoMã số sinh viên: 06126139Lớp: DH06SH1Mục lụcI. Đặt vấn đềII. Nội dung1. Bệnh Aujeszky2. Phát hiện và định lượng DNA của PrV2.1. Vật liệu2.2. Nested PCR phát hiện DNA PrV2.3. Real-time PCR định lượng DNA PrV2.4. Kết quảIII. Kết luận2I. Đặt vấn đềBệnh Aujeszky ảnh hưởng trực tiếp đến thành tích sinh sản và tăng trưởng của heo.Một số trường hợp ELISA dễ bỏ sót và phân biệt sai.Cấy chuyển và tiêm truyền (explantation and cocultivation) tốn nhiều thời gian và độ nhạy không cao. 3I. Đặt vấn đềNested PCR và real-time PCR đã xác định tần số thực tế và số lượng của sự lây nhiễm PrV nâng cao cả độ nhạy và độ chính xác (McFarlane và ctv, 1986; Lokensgard và ctv, 1991).  Áp dụng 2 kỹ thuật này trong việc phát hiện virus PrV tiềm ẩn trong heo ở Việt Nam.4II. Nội dung1. Bệnh AujeszkyAujeszky là một DNA virus.Họ Herpesviridase Suid Herpesvirus I (SHV I).Kích thước 180 nm.Hình 2.1. Diagram showing the virion structure, its different proteins (with the new nomenclature) and the DNA of the AD virus. (nguồn:www.sanidadanimal.info/.../images/9virus.gif )5Bệnh Aujeszky162 capsomeres, có vỏ bọc. ở heo, loài gặm nhấm và nhiều loài động vật khác. Không thấy bệnh lây trên người. Hình 2.2 Structure of the DNA of the Aujeszky´s virus.The genes of the proteins gE and gI are located in the Us fragment. www.sanidadanimal.info/.../images/9virus.gif6Hình 2.3. Dead pigs (and a cat), a result of pseudorabies www.thepigsite.com/pighealth/contents/aujesky Hình 2.4. Lesions on nose of piglet www.thepigsite.com/pighealth/contents/aujesky 72. Phát hiện và định lượng DNA của PrV2.1. Vật liệuTinh sạch DNA bộ gene PrV Tinh sạch DNA bộ gene từ mô thần kinh82.2. Phản ứng Nested PCR phát hiện DNA PrVThành phần phản ứng (25 µl):10 µl (500 ng) của DNA bộ gene 2.5 µM của mỗi primer 1.5 mM MgCl 2 0.05 U Taq Polymerase (Promega, USA) 0.2 mM dNTP 1X buffer Khuếch đại với máy Perkin-Elmer GenAmp PCR system 9600 (Perkin-Elmer, USA) 92.2. Phản ứng Nested PCR phát hiện DNA PrVGiai đoạn 1:1 Chu kì 95oC trong 10 phút.30 chu kì:Biến tính (94 oC, 45 giây) Bắt cặp (62 oC, 1 phút) Kéo dài (72 oC, 1 phút).Chu kì cuối cùng 10 phút ở 72 oC. 102.2. Phản ứng Nested PCR phát hiện DNA PrVGiai đoạn 2:Sử dụng 5 µl của sản phẩm PCR đầu tiên.Dưới những điều kiện giống nhau. 11Bảng 3. Trình tự của các cặp primer sử dụng trong nested PCR 12Những sản phẩm chuyên biệt của nested PCR được kiểm tra qua kỹ thuật cắt phân đoạn đa hình (RFLP) .sản phẩm được cắt với enzyme giới hạn HaeIII. Điện di trên gel 1.85% agarose. 2.2. Phản ứng nested PCR phát hiện DNA PrV132.3. Real-time PCR định lượng DNA PrV.Định lượng DNA PrV đặc hiệu cho gene gB và gE.Sử dụng mẫu dò huỳnh quang Chrome 4™ với máy dò huỳnh quang Real-Time Fluorescence Detection (USA). Dữ liệu được phân tích bằng cách dùng phần mềm Ver. 2.03 Supports Optical Monitor™.14Primer và mẫu dògene gB của PrV + forward primer là 5’-ACGGCACGGGCGTGATC-3’, + reverse primer là 5’-ACTCGCGGTCCTCCAG CA-3’	 (Balasch và ctv., 1998a). +Mẫu dò TaqMan, 5’-CTCG-GCGACCTCATCGAGCCCTGCAC-3’ gene gE của PrV+forward primer, 5’-TCGTGATGACGTGCG-TCGTCG-3’, reverse primer, 5’-CGCGGAACCA-GTCGTCGAAGC-3’, 	(McCaw và ctv., 1997). Mẫu dò TaqMan là 5’-CTACGAGGGGCCG-ACGCGAGCCTGGA-3’15* Hỗn hợp phản ứng (25 µl): 5 µl (500 ng) của DNA bộ gene 12,5 µl của hỗn hợp pha sẵn TaqMan PCR 2X2,5 µl của 900 nM dung dịch của mỗi primer 2,5 µl của 250 nM mẫu dò đã đánh dấu huỳnh quang * Chương trình nhiệt : 50 chu kì ở 94 oC trong 1 phút, 60 oC trong 30 giây, và 72 oC trong 1 phút. 2.3. Real-time PCR định lượng DNA PrV162.4. Kết quả2.4.1. Nested PCR trong phát hiện PrV Nested PCR đã phát hiện được DNA của PrVNhiều sản phẩm nested PCR cắt thì phù hợp với nhiều kết quả mong đợi. Sản phẩm khuếch đại của gene đích qua nested PCR cũng được phát hiện sau tạo dòng.17Hình 2.5. Sản phẩm khuếch đại của nested PCR được tạo ra từ ba gene (gB, gE, và gG) của PrV và kiểm tra bằng enzyme HaeIII.18Nested PCR đã xác định cho các gene gB, gE, và gG của PrV. 192.4.2. Real-time PCR định lượng DNA của PrVSố lượng DNA PrV tiềm ẩn chọn lọc từ những mô thần kinh đã được đánh giá qua kỹ thuật real-time PCR. Với gene gB và gE của PrV tạo ra số lượng bản copy của DNA PrV tiềm ẩn trong khoảng 100.1 và 107.2 (1-1.58×107) copy qua 1 µg của DNA bộ gene.20Hình 2.6. Sự định lượng DNA PrV tiềm ẩn trong mô thần kinh của nhiều heo qua kỹ thuật real-time PCR 21Real-time PCR từ gene gE PrV cho màu thuốc nhuộm huỳnh quang trên các cấp độ ngưỡng. Tần số thực tế cao ở những gene gB (100% cho BS, 92% cho OB, và 85% cho TG). Một số lượng nhỏ những mẫu OB (67%) và TG (74%) của gene gE được kiểm tra dương tính trong real-time PCR.Đa số heo lớn lên ở những nông trại Hàn Quốc thì lây nhiễm tiềm ẩn với chủng PrV địa phương.2.4.2. Real-time PCR định lượng DNA của PrV22III. Kết luận Trong nghiên cứu này, tần số thực tế và số lượng về sự lây nhiễm của virus PrV tiềm ẩn ở mô thần kinh của heo đã được xác định qua nested PCR và Real time PCR. Nested PCR biểu hiện kết quả dương tính ở tất cả mẫu BS, còn gene gE hoặc gene gG cho băng dương tính ở lượng nhỏ những mô thần kinh .Real-time PCR cho gene gE PrV đưa ra tín hiệu huỳnh quang ở cấp độ trên ngưỡng, bằng cách đó chỉ ra một tần số thực tế đã được quan sát ở nested PCR. Real-time PCR chứng tỏ rằng những cấp độ của sự lây nhiễm tiềm ẩn PrV biến đổi đáng kể từ một con thú đến những con tiếp theo. 23Tài liệu tham khảoTiếng việt1. Nguyễn Ngọc Hải.2007.Công nghệ sinh học trong thú y. Nhà xuất bản nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh.2.Trần Thanh Phong.1996.Bệnh truyền nhiễm do virus trên heo. Tủ sách trường đại học Nông Lâm. Trang 29-46.3. Lê Anh Phụng.2002.Bệnh truyền nhiễm trâu bò. Khoa chăn nuôi thú y, trường đại học Nông Lâm. Trang 43-44.4. Lăng Văn Đức.2009.Ứng dụng phương pháp nested RT-PCR để phát hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) trên heo. Luận văn tốt nghiệp.Tiếng anh5. Abi George Aleyas, Hyun A Yoon , Seong Kug Eo , Seong Ok Park, John Hwa Lee, Joon Seok Chae, Jeong Gon Cho and Hee Jong Song.2005. Molecular Survey of Latent Pseudorabies Virus Infection in Nervous Tissues of Slaughtered Pigs by Nested and Real-time PCR. Laboratory of Microbiology, College of Veterinary Medicine and Bio-Safety Research Institute, Chonbuk National University, Jeonju 561-756, Republic of Korea.6. Andrew K. Cheung.1994. Detection of the large latency transcript of pseudorabies virus byRNA-PCR and its potential in diagnosis. From the Virology Swine Research Unit, National Animal Diseaenter, USDA, Agricultural Research Service, PO Box 70, AmeA 50010.7. K. M. Tham, M. X. J. Motha, G. W. Homer, and J. C. Ralston.1993. Polymerase chain reaction amplification of latent Aujeszky's disease virus in dexamethasone treated pigs . Virology Section, Central Animal Health Laboratory, MAF Quality Management, Upper Hutt, New Zealand.Tài liệu internet8. www.sanidadanimal.info/.../images/9virus.gif 9. www.thepigsite.com/pighealth/contents/aujesky 10. www.google.com.24CẢM ƠN SỰ THEO DÕI CỦA THẦY VÀ CÁC BẠN 25