Tiểu luận Ứng dụng kĩ thuật multiplex – PCR để phát hiện một số gen độc lực của nhóm E. coli sản sinh độc tố Shiga (STEC) phân lập được từ phân bò, heo tiêu chảy

và địa điểm thực hiện 
3.1.1. Thời gian 
Đề tài được thực hiện từ ngày 1/03/2005 đến ngày 30/07/2005. 
3.1.2. Địa điểm 
- Mẫu phân được lấy từ các hộ hoặc trại chăn nuôi ở Đồng Nai, TP. HCM và 
Tiền Giang. 
- Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại Phòng thực hành Kiểm nghiệm 
thú sản và Môi trường sức khỏe vật nuôi, Khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường Đại học 
Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 
- Xác định các gen độc lực của E. coli được thực hiện tại Trung tâm Phân tích 
Thí nghiệm Hóa sinh, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 
3.2. Nội dung thực hiện 
- Phân lập vi khuẩn E. coli trong phân bò, heo. 
- Li trích DNA của E. coli phân lập được. 
- Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện các gen eae, ehxA, stx1, stx2 
và uid của E. coli. 
3.3. Phương pháp thực hiện 
3.3.1. Vật liệu thí nghiệm cơ bản 
Dụng cụ lấy mẫu: tăm bông, đèn cồn, chai cồn, môi trường chuyên chở Carry Blair, ... 
Mẫu vi khuẩn đối chứng dương: EDL933. 
... 
 3.3.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu 
- Dùng muỗng vô trùng lấy phần giữa cục phân (khoảng 10 -12 g) mà bò, heo 
vừa mới thải ra, cho vào túi nylon vô trùng, buộc kỹ, bảo quản 4 - 80C và chuyển về 
 12
phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Phân tiêu chảy có thể được lấy bằng cách dùng 
tăm bông, cho vào môi trường chuyên chở Carry Blair, chuyển về phòng thí nghiệm. 
3.3.2. Nuôi cấy và phân lập E. coli 
3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy 
™ Môi trường tăng sinh 
Do số lượng E.coli nhóm STEC, đặc biệt là E. coli gây bệnh hiện diện trong 
thực phẩm rất ít, cho nên trước khi phân lập, sử dụng môi trường tăng sinh pepton đệm 
có bổ sung kháng sinh cefixime (0,0125mg/L) và vancomycin (8mg/L) (FDA, 2002) 
để ức chế các vi khuẩn gram dương và vi khuẩn sống hoại sinh khác. 
™ Môi trường phân lập 
Để xác định môi trường nào cho kết quả tốt khi phân lập E. coli nhóm STEC 
mang gen độc lực, ta sử dụng 3 loại môi trường MAC, SMAC và CT - SMAC. 
Môi trường phân lập là môi trường MacConkey (MAC), Sorbitol MacConkey 
(SMAC), và Sorbitol MacConkey (CT - SMAC) có bổ sung kháng sinh cefixime 
(0,05mg/L) và tellurite (2,5mg/L) (FDA, 2002). Khoảng 90% E. coli đều lên men 
đường lactose, trên môi trường MAC, E. coli điển hình có khuẩn lạc màu đỏ hồng. 
Trên môi trường SMAC và CT - SMAC, E. coli không lên men đường sorbitol nên 
cho khuẩn lạc màu trắng, những dòng E. coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu 
hồng. 
Việc tầm soát E. coli nhóm STEC trên phân, bệnh phẩm trên thạch SMAC, CT - 
SMAC là công cụ ban đầu phát hiện serotype O157 thuộc nhóm STEC. 
3.3.2.2. Qui trình phân lập, định tính 
 (1) Nuôi cấy và phân lập 
E. coli hiện diện trong phân với số lượng lớn, nên phân heo hoặc bò sau khi thu 
thập và chuyển về phòng thí nghiệm được tiến hành ria trực tiếp trên môi trường thạch 
đĩa MAC và SMAC, ủ 370C trong 18 - 24giờ, chọn và thu khuẩn lạc điển hình, giữ 
gốc. Li trích DNA rồi thực hiện multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực. 
 (2) Chọn khuẩn lạc E. coli 
Trên từng loại môi trường MAC, SMAC, CT - SMAC, chọn ngẫu nhiên 6 – 10 
khuẩn lạc rời rạc đại diện cho mỗi nhóm hình thái: 
o Khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC được kí hiệu HM. 
 13
o Khuẩn lạc hồng hoặc trắng trên môi trường SMAC được kí hiệu lần lượt là 
HS hoặc TS. 
o Khuẩn lạc trắng hoặc hồng trên môi trường CT - SMAC kí hiệu lần lượt là 
TCT hoặc HCT. 
Dùng que cấy chạm nhẹ trên từng khuẩn lạc rời rạc rồi chuyển vào từng ống NA 
riêng biệt để giữ gốc riêng lẻ. Thu phần khuẩn lạc còn lại của mỗi nhóm, gom chung 
vào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 – 0,5 ml nước cất khử ion vô trùng. 
(3) Thử sinh hóa 
Sử dụng nghiệm pháp IMViC (FAO, 1992) cho từng khuẩn lạc riêng lẻ thuộc 
nhóm đó để xác định E. coli . 
3.3.3. Li trích DNA 
Theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với ý kiến của Cerna (2003) và Botteldoorn 
(2003), việc ly trích DNA được thực hiện như sau: thu khoảng 6 -10 khuẩn lạc E. coli 
trên môi trường thạch (MAC hoặc SMAC hoặc CT - SMAC hoặc NA) cho vào eppendorf 
đựng sẵn 0,4 - 0,5 ml nước cất hai lần vô trùng, đun sôi 10 phút, lấy ra và chuyển vào 
tủ âm -700C giữ trong 10 phút. Sau khi rã đông hoàn toàn, ly tâm 13000 vòng trong 3 
phút. Để yên và hút phần dung dịch ở phía trên làm DNA khuôn mẫu (DNA xét 
nghiệm). 
 14
 Sơ đồ 3.1. Qui trình phân lập, định tính và phát hiện gen độc lực E. coli 
Chọn 6 - 10 khuẩn lạc đỏ hồng 
Thu tất cả phần còn lại của những khuẩn lạc đã 
chọn theo từng nhóm riêng và mỗi nhóm cho 
vào mỗi eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5 ml H2O 
cất khử ion 2 lần 
MAC 
(37oC/24h) 
Phân 
Mẫu 
(-) Ly trích DNA riêng theo từng ống 
NA 
Loại bỏ ống NA đã giữ gốc 
Multiplex- PCR 
Ly trích DNA (DNA nhóm khuẩn lạc) 
Multiplex - PCR (+)
)
Thử IMViC (+/-;+;-;-) 
Cấy từng khuẩn lạc được chọn vào từng ống thạch nghiêng NA (37oC/24h) 
 15
3.3.4. Qui trình multiplex – PCR 
(1) Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong multiplex – PCR 
Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng multiplex - PCR 
Mồi (primer) 
Trình tự oligonucleotide (5’3’) 
Kích cỡ DNA 
được khuếch 
đại (bp) 
Eae – F 
Eae – R 
ATTACCATCCACACAGACGGT 
ACAGCGTGGTTGGATCAACCT 
397 
EhxA – F 
EhxA –R 
GTTTATTCTGGGGCAGGCTC 
CTTCACGTCACCATACATAT 
158 
Stx1 - F 
Stx1 - R 
CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG 
CACCAGACAATGTAACCGCTG 
348 
Stx2 - F 
Stx2 - R 
ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG 
GCGTCATCGTATACACAGGAGC 
584 
Uid - F 
Uid - R 
GCGAAAACTGTGGAATTGGG 
TGATGCTCCATCACTTCCTG 
252 
(Feng và Monday, 2000) 
(2) Các thành phần của phản ứng PCR: (Feng và Monday, 2000) 
Mỗi phản ứng là 25 μl, gồm các thành phần sau: PCR buffer 1,1X; MgCl2 3mM; 
mỗi dNTP 200 μM; mỗi loại primer 7,5 pmol; Taq 2,5 μl; DNA 2 μl; và nước cất vừa 
đủ 25 μl. 
(3) Chu kỳ nhiệt (Feng và Monday, 2000) 
- Tiền biến tính 950C/5 phút 
- Biến tính 940C/1 phút 
- Ủ bắt cặp 610C/1 phút 25 chu kỳ 
- Kéo dài 720C/1 phút 
 16
- Kéo dài chuỗi 720C/7 phút 
3.3.5. Điện di, đọc kết quả 
Lấy 10 μl sản phẩm PCR cùng với 2 μl loading dye được điện di trên gel 
agarose 1,6% trong TBE. Thang chuẩn (ladder) cũng được điện di đồng thời. Thời 
gian điện di 30 – 35 phút ở 90 V và 250 mA. 
Sau khi điện di, gel được ngâm trong dung dịch ethidium bromide khoảng 30 
phút. Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UV bằng máy chụp gel (phần 
mềm Quality One 2000, Bio-Rad). Các sản phẩm PCR được xác định bằng cách so với 
các băng của đối chứng dương và thang ladder 100 bp. 
 17
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
4.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu 
chảy 
Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trong từng nhóm khuẩn lạc phân lập 
được từ phân bò tiêu chảy được ghi nhận ở bảng 4.1. 
Trong 10 mẫu phân bò tiêu chảy có 5/10 mẫu (50%) phát hiện E. coli mang gen 
độc lực thuộc nhóm stx. Gen ehxA được phát hiện với tỉ lệ cao nhất (100%); kế đến là 
stx2 (4/10 mẫu – 40%), stx1 (1/10 mẫu – 10%); và không phát hiện được gen uid và 
eae. Như vậy, phân bò tiêu chảy là nguồn lưu cữu STEC mang gen stx2. Theo Paton 
và Paton (1998) đã nhận định rằng những dòng STEC mang stx2 thì thường liên kết 
bệnh nặng hơn so với những dòng STEC chỉ mang stx1. 
Do kinh phí hạn chế, mỗi loại môi trường phân lập chúng tôi chỉ chọn 2 khuẩn 
lạc riêng lẻ nhưng có kiểu hình giống nhau để xác định gen độc lực (li trích DNA từ 
gốc khuẩn lạc riêng lẻ đã nhân và giữ gốc trên thạch NA), kết quả được trình bày ở 
bảng 4.2. 
Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy: 
(1) Ở mẫu số 1, chọn 2 khuẩn lạc hồng rời rạc (khuẩn lạc được đánh số thứ tự số 
6 – HM6 và khuẩn lạc số 8 – HM8 trong nhóm khuẩn lạc HM) trên thạch MAC, 
multiplex - PCR đều phát hiện được gen stx2. Tương tự, 2 khuẩn lạc hồng trên thạch 
SMAC và 2 khuẩn lạc trắng trên thạch SMAC cũng đều mang gen stx2. Tương tự, đối 
với gen ehxA đều hiện diện cho mỗi khuẩn lạc riêng lẻ này. 
(2) Ở mẫu số 2, chọn 2 khuẩn lạc hồng rời rạc trên thạch MAC, multiplex - PCR 
đều phát hiện được gen ehxA nhưng không phát hiện được gen stx. Tương tự, 2 khuẩn 
lạc trắng trên thạch SMAC chỉ phát hiện một mẫu mang gen ehxA lẫn stx2. 
(3) Đối với mẫu phân số 3, chọn 2 khuẩn lạc hồng rời rạc trên môi trường MAC, 
2 khuẩn lạc trắng trên SMAC, multiplex – PCR phát hiện 100% E. coli mang gen ehxA 
nhưng không có gen stx. 
Tóm lại, nhóm khuẩn lạc (gồm 6 – 10 khuẩn lạc) có mang gen độc lực thì chưa 
chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ đều mang gen độc lực đó. Cho nên chọn từng khuẩn lạc 
 18
để nghiên cứu là công việc cần thiết để xác định serotype của mỗi khuẩn lạc phân lập 
được. Nếu mục tiêu này không được đề cập thì việc thu hết các loại khuẩn lạc với các 
kiểu hình khác nhau để phát hiện sự hiện diện các gen độc lực của E. coli trong mẫu 
khảo sát là bước đi thích hợp. 
Bảng 4.1 Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trong từng nhóm khuẩn 
lạc (HM, TS, và HS) ở phân bò tiêu chảy 
Gen độc lực 
Mẫu 
Loại khuẩn lạc, 
môi trường eae ehxA stx1 stx2 uid 
HM _ + _ + _ 
HS _ + _ + _ 
1 
 TS _ + _ + _ 
HM _ + _ + _ 
HS _ + _ _ _ 
2 
 TS _ + _ + _ 
HM _ + _ + _ 
HS _ + _ _ _ 
3 
 TS _ + _ + _ 
HM _ + _ _ _ 
HS _ + _ _ _ 
4 
 HCT _ _ _ _ _ 
HM _ + _ _ _ 5 
 HS _ + _ _ _ 
HM _ + _ _ _ 6 
 HS _ + _ + _ 
7 HCT _ + _ _ _ 
8 HCT _ + + _ _ 
HM _ + _ _ _ 9 
 TS _ + _ _ _ 
HM _ + _ _ _ 
HS _ + _ _ _ 
10 
 TS _ + _ _ _ 
 19
 Bảng 4.2 Kết quả phát hiện gen độc lực E. coli từng khuẩn lạc riêng lẻ ở 
phân bò tiêu chảy 
Gen độc lực 
Mẫu 
Loại khuẩn lạc, 
môi trường eae ehxA stx1 stx2 uid 
HM6 _ + _ + _ 
HM8 _ + _ + _ 
HS4 _ + _ + _ 
HS6 _ + _ + _ 
TS4 _ + _ + _ 
 1 
TS5 _ + _ + _ 
HM1 _ + _ _ _ 
HM3 _ + _ _ _ 
TS1 _ _ _ _ _ 
2 
TS2 _ + _ + _ 
HM1 _ + _ _ _ 
HM3 _ + _ _ _ 
TS3 _ + _ _ _ 
3 
TS7 _ + _ _ _ 
4.2. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo con cai 
sữa tiêu chảy 
 Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli từ 9 mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy 
được trình bày ở bảng 4.3. 
Bảng 4.3 cho ta thấy có 4/9 mẫu (44,4%) mang gen stx, trong đó có ¼ mẫu 
mang gen stx1 (25%) và ¾ mẫu mang gen stx2 (75%), không có mẫu nào mang gen 
uid và eae, 9/9 mẫu (100%) mang gen ehxA. Blanco và ctv (1997) kết luận rằng gen 
stx1 thường hiện diện tỉ lệ thấp trên heo. 
Có 6/25 (24%) nhóm khuẩn lạc được phân lập từ 9 mẫu phân heo cai sữa tiêu 
chảy, cùng lúc mang 2 gen độc lực (ehxA và stx1 hoặc ehxA và stx2). Điều này sẽ làm 
tăng khả năng gây bệnh của E. coli đối với heo. Người ở mọi lứa tuổi đều có thể bị 
nhiễm STEC với những serotype khác nhau (Beutin và ctv, 1995). 
 20
 Bảng 4.3 Kết quả phát hiện gen độc lực của nhóm khuẩn lạc đại diện 
 cho E. coli trong phân heo cai sữa tiêu chảy 
Gen độc lực 
Mẫu 
Loại khuẩn lạc, 
môi trường eae ehxA stx1 stx2 uid 
HM _ + _ _ _ 
HS _ + _ _ _ 
1 
TS _ + _ _ _ 
HM _ + _ _ _ 
HS _ + + _ _ 
2 
TS _ + _ _ _ 
HS _ + _ _ _ 3 
 TS _ + _ _ _ 
HM _ + _ _ _ 
HS _ + _ _ _ 
4 
TS _ + _ + _ 
HS _ + _ + _ 5 
 TS _ + _ + _ 
HM _ + _ + _ 
HS _ + _ _ _ 
6 
TS _ + _ + _ 
HM _ _ _ _ _ 
HS _ + _ _ _ 
7 
TS _ + _ _ _ 
HM _ _ _ _ _ 
HS _ + _ _ _ 8 
TS _ + _ _ _ 
HM _ _ _ _ _ 
HS _ + _ _ _ 9 
TS _ + _ _ _ 
 21
4.3. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu 
chảy 
Ban đầu, đề tài chỉ tiến hành cấy ria trực tiếp mẫu phân heo hoặc bò lên hai loại 
môi trường MAC và SMAC để thu các nhóm khuẩn lạc và phát hiện gen. Hướng phân 
lập E. coli có sử dụng PVC và CT - SMAC chỉ để áp dụng đối với mẫu bề mặt thịt. 
Tuy nhiên, qua thực tế khảo sát (9 mẫu phân heo tiêu chảy và 10 mẫu phân bò tiêu 
chảy) cho thấy tần số phát hiện E. coli mang gen stx1 hiện diện với tỉ lệ thấp (10% ở 
bò tiêu chảy và 11,1% ở phân heo cai sữa tiêu chảy), và chưa có mẫu phân heo hay bò 
tiêu chảy nào được tìm thấy eae và uid. Theo Paton và Paton (1998) thì E. coli STEC 
dòng O157 ít hơn 1% trong quần thể E. coli. Mặt khác, ngoài E. coli, trong phân còn 
có sự hiện diện của nhiều loài vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella, 
Campylobacter, Staphylococcus aureus, Proteus ... Vì vậy, để tăng khả năng phát hiện 
những dòng E. coli STEC mang gen gây độc từ phân bê tiêu chảy, chúng tôi tiến hành 
phân lập theo hướng có sử dụng môi trường tăng sinh chọn lọc và môi trường thạch 
chọn lọc chuyên biệt CT - SMAC. Kết quả phát hiện gen độc lực được ghi nhận cụ thể 
ở bảng 4.4. 
 Trong 8 mẫu phân bê tiêu chảy, có 8/8 mẫu (100%) phát hiện được E. coli 
mang ít nhất 1 gen độc lực, có mẫu phát hiện E. coli mang 2 -3 gen độc lực. Gen ehxA 
được phát hiện với tỉ lệ cao nhất (8/8 mẫu – 100%), kế đến là gen stx1 (7/8 mẫu – 
87,5%), gen stx2 (1/8 mẫu – 12,5%) . Trong khi đó, không phát hiện được gen uid 
trong bất kì mẫu nào. Smith và Scotland (1988) và Gyles (1992) cho rằng nhiều loại 
gia súc mang STEC không có biểu hiện triệu chứng, một vài dòng STEC có khả năng 
gây tiêu chảy cho bò, đặc biệt là bê. Và 7/8 (87,5%) mẫu đều hiện diện cả gen ehxA và 
stx. Theo Barrett và ctv (1992), độc tố Stx là điều kiện cần chứ chưa phải là điều kiện 
đủ để gây bệnh tiêu chảy trên vật nuôi. Do đó, sự xuất hiện đồng thời các gen ehxA và 
stx có thể góp phần giải thích lý do tiêu chảy trên bê. Feng và Monday (2000) cho biết 
có trên 100 loại serotype STEC khác nhau có thể sản sinh các loại độc tố Stx1, Stx2, 
và nhiều biến chủng của Stx2. Trong đó, Stx1 và Stx2 là 2 độc tố chủ yếu gây ra bệnh 
ở người. 
 22
Bảng 4.4 Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trong từng 
nhóm khuẩn lạc ở phân bê tiêu chảy 
Gen độc lực 
Mẫu 
Loại khuẩn lạc, 
môi trường eae ehxA stx1 stx2 uid 
HM _ + _ _ _ 1 
 TS _ + _ _ _ 
HM _ _ _ _ _ 
HS _ + _ _ _ 
2 
HCT _ _ + _ _ 
HM _ _ _ _ _ 
HS _ + + _ _ 
3 
TCT _ _ _ _ _ 
HM _ + _ _ _ 
HS _ + + _ _ 
4 
HCT _ _ + _ _ 
HM _ _ _ _ _ 
HS _ + + _ _ 
5 
TCT _ _ _ _ _ 
HM _ + _ _ _ 
HS _ + + _ _ 
6 
HCT _ _ + _ _ 
7 HCT _ + + + _ 
HM _ + + _ _ 8 
 HS _ + + _ _ 
 23
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR 
T1: mẫu thịt số 1; P.B1: mẫu phân bò tiêu chảy số 1; Ladder: thang chuẩn; P.b7: mẫu 
phân bê tiêu chảy số 7; EDL933: đối chứng dương; P.h1: mẫu phân heo cai sữa tiêu 
chảy số 1. 
 24
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Lê Thị Mai Khanh, 2004. Phát hiện một số gen độc lực của Escherichia coli phân 
lập được từ phân và thịt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex - PCR. Luận văn Thạc 
sỹ Nông nghiệp Trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. 
2. Dogan H. B., Kluleasan H., Cakin I., và Hallemam A. K., 2003. Evaluation of 
increased incubation temperature và cefixime – telluride treatment for the 
isolation of Escherichia coli O157:H7 from minced beef. J. Food Microbiology. 
87: 29 -34. 
3. Donnenberg M. S., Tzipori S., McKee M. L., O’Brien A. D., Alroy J., and Kaper 
J. B., 1993. The role of the eae gen of enterohemorrhagic Escherichia coli in 
intimate attachment in vitro and in a porcine model. J. Clin. Invest. 92: 1418 - 
1424. 
4. Fujisawa T., Sata S., and Aikawa K., 2002. Evaluation of sorbitol-salicin 
MacConkey medium containing cefixime and tellurite (CT-SSMAC medium) 
for isolation of Escherichia coli O157:H7 from raw vegetables. J. Food Mic. 
74: 161 - 163. 
5. Gyles C. L. 1992. Escherichia coli cytotoxins and enterotoxins. Can. J. Microbiol. 38: 734 - 746. 
6. Keene W. E., McAnulty J. M., Hoesly L. P., Williams Jr., Hedberg K., Oxman G. 
L., Barrett T. J., Pfaller M. A., and Fleming D. W., 1994. A swimming-
associated outbreak of hemorrhagic colitis caused by Escherichia coli 
O157:H7 and Shigella sonnei. N. Engl. J. Med. 331: 579 - 584. 
 25
MỤC LỤC 
 TRANG 
1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 5 
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................... 5 
1.2. Mục tiêu – yêu cầu ...................................................................................... 5 
1.2.1. Mục tiêu ......................................................................................... 5 
1.2.2. Yêu cầu........................................................................................... 6 
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 7 
2.1. Vi khuẩn E. coli .......................................................................................... 7 
2.1.1 Đặc điểm sinh học .......................................................................... 7 
2.1.2. Phân loại E. coli ............................................................................. 7 
2.2. Shiga toxigenic E. coli (STEC) ................................................................... 8 
2.2.1. Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC.................. 8 
2.2.1.1. Độc tố Shiga (Stx) .............................................................. 8 
2.2.1.2. Enterohemolysin............................................................... 10 
2.2.1.3. Yếu tố bám dính ............................................................... 10 
2.3. Serotype O157:H7 .................................................................................... 11 
2.4. Kỹ thuật PCR........................................................................................... 12 
2.4.1. Khái niệm .................................................................................... 12 
2.4.2. Nguyên tắc................................................................................... 12 
2.4.3. Các thành phần cần thiết của phản ứng PCR .............................. 12 
2.4.4. Phân tích kết quả PCR................................................................. 13 
2.4.5 Multiplex – PCR........................................................................... 13 
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN ............................................ 14 
3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện................................................................. 14 
3.1.1. Thời gian....................................................................................... 14 
3.1.2. Địa điểm ....................................................................................... 14 
3.2. Nội dung thực hiện .................................................................................... 14 
3.3. Phương pháp thực hiện.............................................................................. 14 
3.3.1 Vật liệu thí nghiệm cơ bản . .......................................................... 14 
3.3.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu.................................................... 14 
 26
3.3.2. Nuôi cấy và phân lập E. coli ........................................................ 15 
3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy.......................................................... 15 
3.3.2.2. Qui trình phân lập, định tính ............................................. 15 
3.3.3. Ly trích DNA................................................................................ 16 
3.3.4. Qui trình multiplex – PCR............................................................ 18 
3.3.5. Điện di, đọc kết quả ..................................................................... 19 
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................ 20 
4.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu 
chảy........................................................................................................................... 20 
4.2. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo con cai 
sữa tiêu chảy ............................................................................................................. 22 
4.3. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu 
chảy........................................................................................................................... 24 
5. KẾT LUẬN ......................................................................................................... 25