Tính đa hình T6235C của gen CYP1A1 và nguy cơ với bệnh ung thư phổi
Tóm tắt Tính đa hình T6235C của gen CYP1A1 và nguy cơ với bệnh ung thư phổi: ... sau đĩ điện di trên gel agarose 2,5% với điện thế 80V, trong 90 phút và chụp ảnh bằng hệ thống máy EC3 Imaging system. Khi enzym MspI cắt đoạn gen sẽ tạo ra các đoạn DNA cĩ kích thước 340 bp (kiểu gen T/T); 200 bp và 140 bp (kiểu gen C/C); 340bp, 200 bp và 140 bp (kiểu gen T/C). - K/ ... (hình 3). TCNCYH 94 (2) - 2015 5 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 Hình 3. Hình ảnh giải trình tự sản phẩm PCR mang đoạn gen T6235C của gen CYP1A1 tương ứng với kiểu gen T/T; T/C; C/C 3. Mối tương quan giữa tính đa hình T6235C của gen CYP1A1 ở bệnh nhân ung thư phổi và người bình thường ...hĩm chứng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Kết quả này tương tự với các nghiên cứu của C. M. Wright năm 2010 [2], nghiên cứu của Nan Song năm 2001 [11]. Theo kết quả nghiên cứu tại bảng 3, sự phân bố theo giải phẫu bệnh học của kiểu gen T/T và các kiểu gen T/C, C/C ...
TCNCYH 94 (2) - 2015 1 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 ðịa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ mơn Hĩa sinh, Trường ðại học Y Hà Nội Email: huythinhda@yahoo.com Ngày nhận: 25/3/2015 Ngày được chấp thuận: 31/5/2015 TÍNH ðA HÌNH T6235C CỦA GEN CYP1A1 VÀ NGUY CƠ VỚI BỆNH UNG THƯ PHỔI Lê Hồng Cơng, Trần Vân Khánh, Lê Hồng Bích Nga, Nguyễn Trọng Tuệ, Nguyễn ðức Hinh, Tạ Thành Văn, Trần Huy Thịnh Trường ðại học Y Hà Nội Tính đa hình T6235C gen CYP1A1 là yếu tố nguy cơ cao gây ung thư phổi trên các đối tượng người Châu Á. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định tính đa hình T6235C của gen CYP1A1 ở nhĩm bệnh nhân ung thư phổi so với nhĩm đối chứng. 139 mẫu bệnh nhân ung thư phổi và 100 người khơng mắc bệnh ung thư được lựa chọn vào nghiên cứu. Kỹ thuật PCR - RFLP (PCR - Restriction fragment length polymorphism) được lựa chọn để xác định tính đa hình T6235C. Kết quả cho thấy, tần số alen T và C ở nhĩm bệnh nhân ung thư phổi là 75% và 25%, cĩ sự khác b iệt so với tần số alen T và C của nhĩm đối chứng là 84% và 16%, với p < 0,05; tần số genotype T/T và T/C - C/C ở nhĩm ung thư phổi là 0,288 và 0,712, khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm chứng là 0,36 và 0,64, với p < 0,05. Kết luận cho thấy bước đầu thấy được sự tương quan giữa đa hình thái T6235C của gen CYP1A1 với nguy cơ ung thư phổi ở người Việt Nam. Từ khĩa: Ung thư phổi, đa hình T6235C, gen CYP1A1 I. ðẶT VẤN ðỀ Ung thư phổi là loại ung thư thường gặp nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở nhiều nước trên Thế giới [1]. Hút thuốc lá được cho là nguyên nhân chính gây ung thư phổi, 85- 90% bệnh nhân ung thư phổi là do hút thuốc lá. Tuy nhiên, dưới 20% số người hút thuốc lá bị ung thư phổi, điều này cho thấy các yếu tố khác bao gồm các biến thể di truyền đĩng một vai trị quan trọng trong cơ chế gây bệnh ung thư phổi [2]. Sự phát sinh, phát triển bệnh ung thư phổi diễn ra qua nhiều giai đoạn dưới tác động của các yếu tố nguy cơ, sự mẫn cảm của gen và quá trình tích lũy đột biến xảy ra trên các gen gây ung thư. Các yếu tố nguy cơ bao gồm hút thuốc lá, nhiễm virus human papillomavirus (HPV), mơi trường, nghề nghiệp và các đột biến gen di truyền qua những thế hệ khác nhau. Cytochrome P450 (CYPs) là một liên họ lớn chứa các hemoprotein xúc tác rất nhiều phản ứng enzym khác nhau để chuyển hĩa các chất nội sinh và ngoại sinh. Trong hệ thống cytochrome P450, cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) là enzym chính hoạt hĩa các chất và là chìa khĩa để k ích hoạt quá trình trao đổi chất giữa các Hydrocacbons cĩ nhân thơm, các amin dị vịng dẫn đến hình thành các phân tử DNA bất thường từ đĩ khởi đầu cho quá trình ung thư [3]. Kết quả của các nghiên mới được cơng bố gần đây cho thấy cĩ mối liên quan chặt chẽ giữa ung thư phổi với đa hình gen CYP1A1; trong đĩ, đa hình T6235C của gen CYP1A1 được chỉ ra là yếu tố nguy cơ cao gây bệnh ung thư phổi trên các đối tượng người Châu Á [4; 5]. ðể gĩp phần hiểu rõ hơn về mối liên quan giữa đa hình T6235C của gen CYP1A1 với nguy cơ ung thư phổi, nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu: 2 TCNCYH 94 (2) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 1. Xác định tính đa hình T6235C của gen CYP1A1 ở bệnh nhân ung thư phổi và người bình thường. 2. ðánh giá mối tương quan giữa tính đa hình T6235C của gen CYP1A1 ở bệnh nhân ung thư phổi và người bình thường. II. ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. ðối tượng Nhĩm bệnh: gồm 139 bệnh nhân ung thư phổi được điều trị ở bệnh viện Bạch Mai trong đĩ cĩ 88 nam và 51 nữ với tuổi trung bình 59,1 ± 9,6. Bệnh nhân ung thư phổi được thăm khám lâm sàng, làm các xét nghiệm cận lâm sàng và giải phẫu bệnh để chẩn đốn xác định ung thư phổi. Nhĩm chứng: 100 người trong chương trình quản lý tăng huyết áp và đái tháo đường, gồm 61 nam và 39 nữ, tuổi trung bình 55,6 ± 8,9. ðược kiểm tra định kỳ bằng X - quang để loại trừ ung thư phổi. Bệnh nhân và nhĩm chứng được lấy 2 ml máu chống đơng trong EDTA. 2. Phương pháp - Tách chi(t DNA: DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu máu theo phương pháp sử dụng enzym protein K và phenol: chloroform: isoamyl alcohol. - K/ thu1t PCR-RFLP (PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism): PCR được sử dụng để khuếch đại vùng gen đa hình T6235C của gen CYP1A1 với cặp mồi: Mồi xuơi: 5’- TAG GAG TCT TGT CTC ATG CCT -3’. Mồi ngược: 5’- CAG TGA AGA GGT GTA GCC GCT -3’. + Thành phần phản ứng PCR (thể tích 10.2µl) gồm: 4.7 µl Taq polymerase, 0.3µl mồi xuơi, 0.3µl mồi ngược, 1.2µl DNA và 3.7µl H2O. + Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC/5 phút, 35 chu kỳ [94oC/40 giây, 54oC/30 giây, 72oC/45 giây], 72oC/7 phút. Bảo quản mẫu ở 15oC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, với điện thế 95 V, trong 25 phút. Xác đFnh đa hình T6235C cLa gen CYP1A1 bPng k/ thu1t cRt enzym giTi hUn: + Thành phần phản ứng: 5µl H20, 1.5µl Buffer 10x, 0.5µl enzym MspI, 8µl sản phẩm PCR. Phản ứng cắt được ủ ở nhiệt độ 37oc qua đêm, sau đĩ điện di trên gel agarose 2,5% với điện thế 80V, trong 90 phút và chụp ảnh bằng hệ thống máy EC3 Imaging system. Khi enzym MspI cắt đoạn gen sẽ tạo ra các đoạn DNA cĩ kích thước 340 bp (kiểu gen T/T); 200 bp và 140 bp (kiểu gen C/C); 340bp, 200 bp và 140 bp (kiểu gen T/C). - K/ thu1t giVi trình tW gen: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng T6235C của gen CYP1A1 được kiểm tra lại bằng kỹ thuật giải trình tự gen theo quy trình thường quy của Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein. 3. ðạo đức nghiên cứu ðề tài đã được thơng qua hội đồng đạo đức của Trường ðại học Y Hà Nội, bản chấp thuận số 161/Hððð-ðHYHN ngày 15/10/2014. Bệnh nhân hồn tồn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân cĩ quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi khơng đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Các thơng tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật. TCNCYH 94 (2) - 2015 3 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 III. KẾT QUẢ 1. ðặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu Bảng 1. ðặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu Các đặc điểm Ung thư phổi n (%) Nhĩm chứng n (%) p Giới Nam Nữ 88 (63%) 51 (37%) 61 (61%) 39 (39%) > 0,05 Tuổi Trung bình (M) ðộ lệch (SD) 59,1 9,6 55,6 8,9 > 0,05 Hút thuốc lá Khơng Cĩ < 20 bao/năm > 20 bao/năm 81(58%) 58(42%) 21 (36%) 37 (64%) Giải phẫu bệnh K biểu mơ tuyến 65 (47%) K khơng tế bào nhỏ 6 (4%) K tế bào nhỏ 12 (7%) Chưa xác định 56 (42%) Bảng 1 cho thấy tỷ lệ nam cao hơn nữ ở cả 2 nhĩm nghiên cứu và độ tuổi trung bình là 59,1 ở nhĩm ung thư phổi và 55,6 ở nhĩm đối chứng. Ở nhĩm bệnh nhân ung thư phổi, tỷ lệ bệnh nhân khơng hút thuốc cao hơn nhĩm bệnh nhân cĩ hút thuốc và hút > 20 năm chiếm tỷ lệ cao hơn hút < 20 năm. Ở nhĩm bệnh nhân ung thư phổi đã được xác định giải phẫu bệnh, ung thư biểu mơ tuyến chiếm tỉ lệ cao nhất (47%). 2. Xác định tính đa hình T6235C của gen CYP1A1 ở bệnh nhân ung thư phổi và nhĩm chứng K(t quV khu(ch đUi vùng T6235C cLa gen CYP1A1 Sản phẩm PCR thu được cĩ chất lượng tốt, gồm một băng đặc hiệu cĩ kích thước đúng như tính tốn là 340 bp (hình 1). 4 TCNCYH 94 (2) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn gen chứa T6235C của gen CYP1A Bệnh nhân ung thư phổi (1 - 6) và đối chứng (7 - 11); M: thang chuẩn 100bp. K(t quV xác đFnh đa hình T6235C cLa gen CYP1A1 bPng PCR – RFLP Hình 2. Sản phẩm cắt enzym vùng T6235C của gen CYP1A1 bằng enzym MspI Bệnh nhân ung thư phổi (1 - 6) và đối chứng (7 - 11); M: thang chuẩn 100 bp; 1, 8, 10 kiểu gen đồng hợp tử T/T; 3, 4, 5, 7, 9 kiểu gen đồng hợp tử C/C; 2, 6, 11 kiểu gen dị hợp tử T/C. Sản phẩm cắt đoạn vùng T6235C trên gen CYP1A1 bằng enzym MspI trên các mẫu bệnh nhân ung thư phổi và nhĩm chứng cĩ kích thước khác nhau phù hợp với tính tốn lý thuyết. Mẫu mang kiểu gen T/T gồm một băng DNA cĩ k ích thước 340 bp (giếng 1, 8, 10). Mẫu mang kiểu gen T/C gồm 3 băng DNA cĩ kích thước 340 bp, 200 bp, 140 bp (giếng 3, 4, 5, 7, 9). Mẫu mang kiểu gen CC gồm 2 băng DNA cĩ kích thước 200 bp và 140 bp (giếng 2, 6, 11). K(t quV giVi trình tW ki^m tra đ_ đ`c hiau cLa sVn phbm PCR Kết quả cắt enzym giới hạn được kiểm tra lại bằng kỹ thuật giải trình tự gen Kết quả giải t rình tự DNA của bệnh nhân cho thấy hồn tồn phù hợp với kết quả cắt enzym giới hạn (hình 3). TCNCYH 94 (2) - 2015 5 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 Hình 3. Hình ảnh giải trình tự sản phẩm PCR mang đoạn gen T6235C của gen CYP1A1 tương ứng với kiểu gen T/T; T/C; C/C 3. Mối tương quan giữa tính đa hình T6235C của gen CYP1A1 ở bệnh nhân ung thư phổi và người bình thường Bảng 2. Tỷ lệ kiểu gen và alen của T6235C trên gen CYP1A1 Kiểu gen và alen Ung thư phổi n (%) Nhĩm chứng n (%) p T/T 40 (28,8%) 36 (36%) < 0,05 T/C – C/C 99 (71,2%) 64 (64%) T 105 (75%) 84 (84%) < 0,05 C 34 (25%) 16 (16%) Tổng 139 100 Bảng 2 cho thấy sự phân bố kiểu gen, alen và sự khác biệt giữa các kiểu gen, alen ở hai nhĩm bệnh nhân ung thư phổi và nhĩm chứng. Ở nhĩm chứng, sự phân bố kiểu alen T, C là 84/100 (84%) và 16/100 (16%) so với nhĩm bệnh nhân ung thư phổi lần lượt là 105/139 (75%) và 34/139 (25%) với p < 0,05. Ở nhĩm chứng, sự phân bổ kiểu gen T/T, T/C - C/C là 36 (36%) và 64 (64%) so với nhĩm ung thư phổi lần lượt là 40 (28,8%) và 99 (71,2%) với p < 0,05. Bảng 3. Phân bố kiểu gen theo phân loại giải phẫu bệnh của ung thư phổi Giải phẫu bệnh T/T n (%) T/C - C/C n (%) p Ung thư biểu mơ tuyến 15 (23%) 50 (77%) < 0,005 K khơng tế bào nhỏ 2 4 K tế bào nhỏ 3 9 < 0,05 Khơng xác định 38 (67%) 18 (33%) < 0,005 Kiểu gen Bảng 3 chỉ ra sự phân bố kiểu gen theo phân loại giải phẫu bệnh và sự khác nhau giữa các 6 TCNCYH 94 (2) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC kiểu gen này ở nhĩm ung thư phổi. Ở nhĩm bệnh nhân ung thư biểu mơ tuyến sự phân bố kiểu gen T/T là 15 (23%) so với kiểu gen T/C-C/C là 50 (77%) và cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê với p < 0,005. IV. BÀN LUẬN Trong cộng đồng người Châu Á, các đa hình thái của gen CYP1A1 đã được xác định làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi so với cộng đồng người Châu Âu và Châu Mỹ [6; 7]. Một nghiên cứu đối với người dân Nhật Bản của tác giả Nakachi và cộng sự 1993; Hayashi và cộng sự 1992 cũng chỉ ra mối liên quan giữa kiểu gen CYP1A1 và nguy cơ ung thư phổi, đặc biệt ở ung thư phổi tế bào nhỏ [4; 5]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về mối liên quan giữa đa hình gen CYP1A1 và nguy cơ mắc ung thư phổi cịn hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện để hiểu rõ hơn về mối liên quan giữa các kiểu gen của đa hình T6235C trên gen CYP1A1 với ung thư phổi. Năm 1990, Kawajiri và cộng sự lần đầu tiên cơng bố mối liên quan giữa kiểu gen CYP1A1 với ung thư phổi trong một quần thể người Châu Âu [8]. Năm 1993, nghiên cứu của Cosma và cộng sự cho thấy kiểu gen T6235C của gen CYP1A1 ở cộng đồng người Châu Á cĩ tương quan với nguy cơ mắc ung thư phổi cao hơn so với cộng đồng người da trắng và Châu Mỹ [6]. Năm 2011, nghiên cứu mới nhất của Chen và cộng sự cũng cho thấy cĩ mối liên quan chặt chẽ giữ nguy cơ ung thư phổi với kiểu gen CYP1A1 T6235C và CYP1A1 A4889G [9]. Kết quả nghiên cứu ở bảng 2 cho thấy sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê đối với sự phân bố alen của đa hình T6235C trên gen CYP1A1 giữa nhĩm bệnh nhân ung thư phổi và nhĩm chứng với p < 0,05 điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu về đa hình T6235C trên gen CYP1A1 của C. M. Wright cùng cộng sự năm 2010 [2] và Sheikh M Shaffi cùng cộng sự năm 2009 [10]. Với kết quả nghiên cứu tại bảng 2 cho thấy, tỷ lệ các kiểu gen của đa hình T6235C ở hai nhĩm ung thư phổi và nhĩm chứng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Kết quả này tương tự với các nghiên cứu của C. M. Wright năm 2010 [2], nghiên cứu của Nan Song năm 2001 [11]. Theo kết quả nghiên cứu tại bảng 3, sự phân bố theo giải phẫu bệnh học của kiểu gen T/T và các kiểu gen T/C, C/C cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa thống kê với p < 0,05 và đặc biệt ở nhĩm bệnh nhân ung thư phổi dạng biểu mơ tuyến. ðiều này hồn tồn phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả đối với quần thể người Châu Á [2; 4; 11; 12]. Tuy nhiên, kết quả này khác biệt với kết quả nghiên cứu của Paula Mota và cộng sự năm 2010 trên quần thể người Châu Âu và da trắng [13]. V. KẾT LUẬN ðã xác định được đa hình T6235C trên gen CYP1A1 ở nhĩm ung thư phổi và nhĩm chứng. Tỷ lệ alen T và C của đa hình T6235C trên gen CYP1A1 ở nhĩm ung thư phổi và nhĩm chứng là khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê; Sự phân bố giữa các kiểu gen T/T với kiểu gen T/C và C/C của đa hình T6235C gen CYP1A1 ở hai nhĩm ung thư phổi và nhĩm chứng là khác biệt cĩ ý nghĩa, đặc biệt ở nhĩm ung thư phổi biểu mơ tuyến. Lời cảm ơn ðề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài nhánh cấp nhà nước “ðánh giá TCNCYH 94 (2) - 2015 7 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2015 sự phân bố kiểu gen của một số gen liên quan đến ung thư phổi và ung thư gan” thuộc đề tài nhiệm vụ Quỹ gen “ðánh giá đặc điểm di truyền người Việt Nam”. Nhĩm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Trung tâm Hơ hấp, Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu - bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình thực hiện nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Walser T, Cui X, Yanagawa J et al (2008). Smoking and lung cancer, Proc. Am. Thorac, 5, 811 - 815. 2. Wright C M, Larsen J E, Colosimo M L et al (2010). Genetic association study of CYP1A1 polymorphisms identifies risk hapto- types in nonsmall cell lung cancer. Thoracic oncology, 7, 152 - 159. 3. Vineis P, Alavanja M, Buffler P et al (2004). Tobacco an cancer: recent epidemiol- ogical evidence. J. Natl. Cancer. Inst, 96, 99 - 106. 4. Nakachi K, Imai K, Hayashi S, Kawajiri K (1993). Polymorphisms of the CYP1A1 and glutathione S-transferase genes associated with susceptibility to lung cancer in relation to cicagette dose in a Japanes population. Cancer Res, 53, 2994 - 2999. 5. Hayashi S, Watanabe J, Kawajiri K. (1992). Hight susceptibility to lung cancer ana- lysed in term of combined genotypes of CYP1A1 and Mu - class glutathione S - transferase genes. Jpn J cancer Res, 83, 866 - 870. 6. Cosma G, Crofts F, Currie D et al (1993). The relationship between genotype and function of the human CYP1A1 gene. J Toxicol Environ Health, 40, 309 - 316. 7. Garte S (1998). The role of ethnicity in cancer susceptibility gene polymorphisms: the axample of CYP1A1. Carcinogenesis, 19, 1329 - 1332. 8. Kawajiri K, Nakachi K, Imai K et al (1990). Identification of genetically high risk individuals to lung cancer by DNA polymor- phisms of cytochrome P4501A1 gene. FEBS let, 263, 131 - 133. 9. Chen Z (2011). The effect of CYP1A1 polymorphisms on the risk of lung cancer: a global meta-analysis based on 71 casecontrol studies. Mutagenesis, 26, 437 - 446. 10. Sheikh M Shaffi, Mohd Amin Shah, Imtiyaz Ahmad Bhat et al (2009). CYP1A1 polymorphisms and risk of lung cancer in Eth- mic Kashmiri Popolation. Research communi- cation, 5, 651 - 656. 11. Nan Song, Wen Tan, Deyin Xing, Dongxin Lin (2001). CYP1A1 polymorphisms and risk of lung cancer in relation to tobacco smoking: a case - control study in China. Carcinogenesis, 22, 11 - 16 12. Tsunehiro Oyama, Norio Kagawa, Yong-Dea Kim et al (2003). Lung cancer and CYP1A1 or GSTM1 polymorphisms. Environ- mental Health and Preventive Medicine, 7, 230 - 234. 13. Paula Mota, David Silva Moura, Maria Graca Vale et al (2010). CYP1A1 m1, m2 polymorphisms: genetic susceptibility to lung cancer. Artigo Original, 9, 89 - 98. Summary T6235 CYP1A1 POLYMORPHISM AND RISK OF LUNG CANCER The polymorphism T6235C of CYP1A1 gene has been shown to cause high risk factor for lung cancer in Asian subjects. In this study, the polymorphism T6235C of CYP1A1 gene in 139 lung 8 TCNCYH 94 (2) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC cancer patients is compared with 100 control samples by PCR - RFLP method (PCR - Restriction fragment length polymorphism). Results show that the frequency of T and C allele in lung cancer patients (75%, 25%) are different from that of the control group (84%, 16%) with p < 0.05; the difference between the frequencies of T/T genotype; T/C - C/C in the lung cancer group (0.288, 0.712) and the frequencies of T/T genotype; T/C - C/C in the control group (0.36; 0.64) with p < 0.05 level is statistically significant. In conclusion, we observed the correlation between poly- morphism T6235C of CYP1A1 gene with lung cancer risk in Vietnam. Keywords: lung cancer, polymorphism T6235C, CYP1A1 gene
File đính kèm:
- tinh_da_hinh_t6235c_cua_gen_cyp1a1_va_nguy_co_voi_benh_ung_t.pdf