Bài giảng Các phương pháp phân tích sắc ký - Nguyễn Ngọc Vinh

BÀI GIẢNG
CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ
Dr. Nguyen Ngoc Vinh
Sample Mobile phase
t0 t1 t2 t3 t4
t0 t1 t2 t3 t4
D
et
ec
to
r
si
gn
al
s
Time
Detector
D
et
ec
to
r
si
gn
al
s
Khoa Công Nghệ Hóa Học– Bộ môn Hóa Phân Tích
ĐH Công Nghiệp – TP.HCM
Chƣơng 4: 
phƣơng pháp GC/MS và GC/IR
4.1. Sắc ký khí ghép khối phổ
1. Nguyên tắc
2. Điều kiện kỹ thuật
3. Phân tích sắc ký ghép khối phổ
4.2. Sắc ký ghép hồng ngoại
1. Nguyên tắc
2. Điều kiện kỹ thuật
3. Phân tích định tính và định lƣợng
 Phƣơng pháp phổ khối lƣợng (Mass Spectrometry - MS) là một
phƣơng pháp phân tích công cụ quan trọng trong phân tích
thành phần, cấu trúc chất
 Bắt đầu từ cuối thế kỷ XIX, Goldstein (1886) và Wein (1898) thấy
rằng một chùm tia ion dƣơng có thể tách ra khỏi nhau dƣới tác
dụng của một điện trƣờng và từ trƣờng
 1913, Thomson thấy khí neon tự nhiên gầm 2 loại có khối lƣợng
nguyên tử khác nhau (isotope) là 20 và 22 (g/mol), ông cũng sử
dụng máy phổ khối lƣợng trong phân tích hóa học, xác định khối
lƣợng phân tử và nguyên tử
 1940 MS đƣợc sử dụng trong phát hiện dầu mỏ và trong phân
tích hormon/steroid (1950). Sự kết hợp GC/MS thực hiện năm
1960 và LC/MS năm 1970. Sau đó nhiếu kỹ thuật mới trong MS
nhanh chóng phát triển nhƣ FAB, TS, tứ cực, TOF, MALDI
 Có phạm vi ứng dụng rất rộng lớn trong các ngành hóa hữu cơ,
hóa sinh, vô cơ và nguyên tố đồng vị
1. Sắc ký khí ghép khối phổ
 Cơ sở của phƣơng pháp MS đối với các hợp chất hữu cơ là sự
bắn phá các phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện
tích dƣơng, hoặc phá vỡ các mảnh ion, các gốc theo sơ đồ sau
bằng các phần tử mang năng lƣợng cao:
 Năng lƣợng bắn phá phân tử thành ion phân tử khoảng 10eV, sự
phá vỡ này phụ thuộc cấu tạo chất, phƣơng pháp và năng lƣợng
bắn phá  quá trình ion hóa. Ion phân tử có số khối (m/e) ký hiệu
là M+ Có nhiều phƣơng pháp ion hóa khác nhau nhƣ va chạm
electron, va chạm electron, ion hóa photon, ion hóa trƣờng, bắn
phá ion, bắn phá nguyên tử nhanh
 Phƣơng pháp khối phổ chính là phƣơng pháp nghiên cứu các
chất bằng cách đo chính xác khối lƣợng chất đó
1.1. Nguyên tắc chung
ABCD + e
ABCD-
ABCD2+ + 3e
ABCD+ + 2e > 95%
 Thiết bị khối phổ đầu tiên đƣợc J. Thomson (Anh) chế tạo năm
1912 và đƣợc hoàn thiện hơn vào năm 1932. Sơ đồ chung:
1. Nạp mẫu và hóa khí mẫu:
Mẫu nạp vào máy có thể ở dạng khí, lỏng, rắn
 Mẫu sau khi biến thành dạng khí đi qua sang buồng ion hóa qua
giao diện interface.
2. Cơ sở kỹ thuật của MS
Hóa khí 
mẫu
Bơm hút
Xử lý số 
liệu
Ion hóa detctorPhân tích 
ion theo 
số khối
Nạp mẫu
2. Ion hóa:
các phân tử ở dạng khí phải đƣợc ion hóa bằng các pp thích hợp.
Phƣơng pháp va chạm electron (Electron impact - EI): Phƣơng pháp phổ
biến, dòng khí của mẫu đi vào buồng ion hóa, va chạm với dòng electron
từ một sợi đốt (catod) chuyển động vuông góc với dòng phân tử mẫu. Áp
suất buồng ion hóa đạt 0,005 torr, to 200  0,25oC.
Các e va chạm với pt trung
hoà tạo các mảnh ion, mảnh
gốc hay pt trung hòa nhỏ. Sau
đó các ion đi qua một điện
trƣờng 400 – 4000V để tăng
tốc, vận tốc ion tỷ lệ với khối
lƣợng của chúng.
Phƣơng pháp ion hóa hóa học (chemical ionization - CI): Ion hóa hóa học
là cho dòng phân tử khí va chạm với một dòng ion dƣơng hoặc âm để
biến pt trung hòa thành ion phân tử hay ion mảnh. Dòng ion này đƣợc
hình thành từ pt dạng khí H2, CH4, H2O, CH3OH, NH3 qua sự ion hóa nhƣ
bắn phá chúng bằng dòng electron mang năng lƣợng cao. Mỗi phân tử
dạng khí có thể tạo ra các ion dƣơng khác nhau làm tác nhân trong ion
hóa hóa học (bảng dƣới đây)
Phân tử khí Tác nhân ion dƣơng
H2
CH4
H2O
CH3OH
i-C4H10
NH3
(CH3)2CO
H3
+
CH4
+, CH3
+, CH5
+, C2H5
+, C3H7
+
H+, (H2O)n
H+, (CH3OH)n
C4H9
+, C3H3
+
H+, (NH3)n
(CH3)2CO
+
Ion hóa bằng ion dƣơng xảy ra theo các bƣớc sau:
Bƣớc 1: pt trung hòa (CH4) va chạm với dòng electron mang năng lƣợng
cao trở thành nguồn ion
CH4 + e  CH4
+ + 2e
CH4
+ + CH4  CH5
+ + CH3
+
CH4
+  CH3
+ + H
CH4
+ CH2
+ + H2
CH3
+ + CH4  C2H5
+ + H2
CH2
+ + CH4  C2H4
+ + H2
CH2
+ + CH4  C2H3
+ + H2 + H
C2H3
+ + CH4  C3H5
+ + H2
Bƣớc 2: các ion dƣơng này va chạm với pt mẫu dạng khí
CH5
+ + MH  CH4 + MH2
+ (MH là mẫu chất)
CH3
+ + MH  CH4 + M
+
CH4
+ + MH  CH4 + MH
+
Phƣơng pháp ion hóa trƣờng (field ionization):
 sử dụng điện trƣờng mạnh để làm bật ra e từ phân tử. Với bề mặt KL
anod có hình nhọn hay sợi mỏng và dƣới chân không cao (10-6 torr) sẽ
phát sinh lực tĩnh điện đủ làm bật e ra khỏi phân tử mà không đòi hỏi
năng lƣợng quá dƣ.
 Trong pp ion hóa trƣờng, nguồn ion đƣợc tạo ra nhờ một kim nhỏ có d
= vài µm làm anod gắn ngay trƣớc khe vào buồng ion hóa, khe vào
chính là catod, còn có khe hội tụ để tập trung nguồn ion
Phƣơng pháp ion hóa photon:
 Nhiều quá trình ion hóa đòi hỏi năng lƣợng từ 10eV tƣơng ứng với các
photon có bƣớc sóng khoảng 83 – 155nm nằm trong vùng tử ngoại
chân không do đó có thể thực hiện quá trình va chạm photon.
 khối phổ đạt đƣợc cũng tƣơng tự pp va chạm electron. Do năng lƣợng
nhỏ hơn nên phổ này chủ yếu cho ion phân tử và một số mảnh có số
khối lớn tƣơng tự pp ion hóa trƣờng.
 Ngƣời ta cũng sử dụng nguồn laser làm nguồn ion hóa, đó là nguồn
đơn sắc (laser rubi) mang năng lƣợng cao.
3. Tách các Ion theo số khối:
Các ion hình thành có khối lƣợng m và điện tích e , tỷ số z = m/e gọi là số
khối. Chúng sẽ đƣợc tách ra khỏi nhau nhờ một nam châm có từ trƣờng
Ho hoặc kèm theo một điện trƣờng nữa. Các loại thiết bị tách gồm có:
 Thiết bị khối phổ hội tụ đơn hoặc còn gọi là khối phổ hình quạt hay lệch
từ. (single-focusing magnetic deffection hay sector mass analyser)
 Thông thƣờng nhất là dùng thiết bị từ trƣờng hình quạt (sector-
field spectrometer) để tách các ion theo khối lƣợng
 Các ion trƣớc khi ra khỏi buồng ion hóa đã đƣợc tăng tốc nhờ
một điện trƣờng có thế U, đi qua nam châm hình ống có từ
trƣờng H. Các ion sẽ chuyển động theo hình vòng cung bán kính
r trong từ trƣờng này. Với r:
 Vậy với giá trị U và H nhất định thì số khối m/e tỷ lệ với bán kính r.
Từ biểu thức trên nhận thấy các ion có m/e khác nhau sẽ đƣợc
tách ra khỏi nhau do r của vòng cung chuyển động của chúng
khác nhau. Máy hội tụ đơn có độ phân giải thấp (1000 – 5000)
 Thiết bị khối phổ hội tụ kép (double-focusing sector spectrometer): để
máy có độ phân giải cao (10.000 – 100.000) ngƣời ta chế tạo bộ tách ion
gồm 1 điện trƣờng và một từ trƣờng đặt cạnh nhau. Các ion trƣớc khi
qua từ trƣờng hình quạt, sẽ đi qua 1 điện trƣờng tĩnh điện để tách biệt
nhau một lần nữa
 Sơ đồ tandem sector instrument với EBEb ion optic (Jeol HX110, với hệ
khối phổ hội tụ 4 lần).
 Thiết bị khối phổ tứ cực (quadrupole): khối phổ tứ cực sử dụng
4 thanh tròn đặt song song nhau thành 1 bó. Từng cặp đối diện
điện tích âm hay dƣơng của nguồn điện 1 chiều (DC). Ngoài ra
thế điện xoay chiều đƣợc sử dụng cho cả hai cặp.
 Cả 2 trƣờng đều không làm tăng tốc dòng điện tích dƣơng từ
nguồn đi ra nhƣng làm chúng dao động quanh trục trung tâm
khi chuyển động và chỉ các ion có số khối nhất định mới đến bộ
phận thu góp. Tần số và thế thay đổi  các ion có số khối khác
nhau lần lƣợt đến bộ phận thu góp.
 Các ion đi vào trƣờng tứ cực theo hƣớng trục z đồng thời dao động
theo hƣớng trục x, y dƣới ảnh hƣởng của một trƣờng điện tần số
cao. Chỉ các dao động của các ion có m/e đặc biệt không tăng lên
theo biên độ dao động và có thể đi qua tâm tứ cực dọc theo trục.
Các ion khác có biên độ dao động tăng sẽ va đập vào thành các
điện cực trƣớc khi có thể vƣợt qua các điện cực đi vào detector.
Phƣơng trình tổng quát của phổ tứ cực nhƣ sau:
 Trong đó K: hằng số,
V: điện áp tần số cao,
r: khoảng cách 2 điện
cực đối nhau, f: tần
số dao động ion
 Độ phân
giải phổ kế
tứ cực
thông
thƣờng đạt
từ 500 –
1000, muốn
nâng cao
Rs, nối 2 –
3 bộ tứ cực
với nhau
nhƣ hình
dƣới (Rs có
thể đạt tới
20.000):
4. Detector:
Sau khi ion hình thành và tách khỏi nhau theo số khối, chúng cần
đƣợc phát hiện và ghi nhận  nhiệm vụ của detector. Các loại
detector trong MS gồm có cốc Faraday, nhân electron thứ cấp, tấm
kính ảnh nhạy ion, hệ thống đếm ion.
5. Độ phân giải của MS:
Độ phân giải là khả năng tách 2 số khối liền nhau m và m + m. Độ
phân giải R của MS đƣợc tính theo:
Các máy có R 10.000 là
có độ phân giải cao
 Các mẫu chất trong phân tích MS phải nằm ở dạng hơi do đó hỗn
hợp khí mang và mẫu chất từ GC có thể đƣa vào buồng ion hóa
của MS nhƣng phải giảm tốc độ khí mang từ cột đi ra khoảng <
2ml/min
 Do thế ion hóa của He là 24,58 eV, nên để tăng độ nhạy của máy
thông qua việc tăng thế ion hóa của buồng ion hóa lên 70eV,
ngƣời ta phải tách He ra khỏi dòng khí trƣớc khi vào buồng ion
hóa.
 Cấu tạo của GC/MS gồm 2 phần là thiết bị GC và MS đƣợc ghép
với nhau thông qua bộ kết nối (interface). Nhằm mục đích loại
bớt He, N2 để giảm áp suất dòng khí mang và phân tử mẫu chất
đi vào buồng ion hóa, phần GC dùng cột mao quản và phần MS
sử dụng buồng ion hóa EI hay CI với bộ tách tứ cực và detector
khối phổ
3. Sắc ký khí ghép MS
Rotary pump
Turbo
pump
Phƣơng pháp HPLC đƣợc dùng để tách các chất lỏng khó bay hơi,
không thể tách đƣợc bằng GC. Sự kết hợp giữa LC và MS cũng
cho những thuận lợi tƣơng tự GC/MS. Tuy nhiên interface ở đây
đóng vai trò quan trọng và gồm nhiều loại khác nhau.
 Bộ kết nối nạp chất lỏng trực tiếp (direct liquid insertion, DLI)
 Bộ kết nối băng chuyền (moving belt interface)
 Bộ kết nối phun nhiệt (thermospray)
 Bộ kết nối bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FBA,
Continuous Flow Fast Atom Bombardment)
 Bộ kết nối phun điện
4. Sắc ký lỏng hiệu quả cao ghép MS