Bài giảng Chuẩn đoán virus Viêm Não Nhật Bản bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

Chuẩn đoán virus Viêm Não Nhật Bản bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bàoGiáo viên hướng dẫn:Nguyễn Ngọc Hải1Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hoa Thùy – MSSV 06126151ĐẶT VẤN ĐỀ2Mùa hè là mùa dễ phát sinh nhiều loại bệnh như dịch tả, thương hàn, sốt xuất huyết, và đặc biệt một bệnh rất nguy hiểm là bệnh viêm não Nhật bản, hay gặp ở trẻ dưới 15 tuổi và nhóm có nguy cơ cao nhất là trẻ từ 2 – 6 tuổi (chiếm 75% tổng số trẻ mắc bệnh).Theo thông báo của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, mỗi năm có khoảng 3000 trẻ em mắc bệnh viêm não, trong đó có 30 – 40% bị bệnh viêm não Nhật bản. Bệnh viêm não Nhật Bản có tỷ lệ tử vong cao (10-20%) và để lại những di chứng nặng nề như động kinh, giảm học lực, đần độn, liệt, thất ngôn. Những di chứng này thường chiếm 50% người mắc bệnh, thường gây tàn phế, mất khả năng lao động để lại gánh nặng cho gia đình, xã hội.Ở chuyên đề này, tôi xin trình bày kỹ hơn về virus và bệnh viêm não Nhật Bản, đặc biệt là phương pháp chuẩn đoán virus này bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào.3NỘI DUNG4I-Bệnh viêm não Nhật Bản1. Khái niệm:Viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh truyền nhiễm trùng cấp tính gây ra bởi một loại siêu vi trùng thuộc nhóm Arbovirus có ái tính với tế bào thần kinh, có tên là Japanese Encephalitis Virus (JE Virus). Virus lây truyền qua người nhờ trung gian là muỗi Culex tritaeniorhynchus và Culex vishnui.Tùy theo mức độ và vị trí tổn thương tại hệ thần kinh trung ương (HTKTW), lâm sàng sẽ có biểu hiện triệu chứng của nơi bị xâm phạm như : viêm não, viêm màng não, viêm sừng trước tủy sống hoặc bệnh cảnh phối hợp: viêm não màng não, viêm não màng não tủy sống.52. Dịch tễ họcKhái quát lịch sử:VNNB là bệnh dẫn đầu trong số các bệnh viêm não do virus ở Châu Á. Hằng năm vào khoảng 50000 trường hợp mới mắc trên thế giới với con số tử vong ước chừng 10000(1988).Bệnh đã được biết tới vào 1871 nhưng mãi đến năm 1924 mới biết rõ về lâm sàng qua trận dịch lớn với 6000 trường hợp, và tỷ lệ tử vong vào khoảng 60% (ở Nhật Bản), bệnh được gọi là “ viêm não mùa hè”. Năm 1935 người ta phân lập được virus từ não của một bệnh nhân tử vong tại Tokyo, và cung cấp được chủng Nakayama nguyên mẫu. Virus này được gọi là virus VNNB B có liên quan đến viêm não mùa hè tại Nhật Bản.61952, virus VNNB đầu tiên được phân lập từ một lính viễn chinh Pháp tại miền Bắc Việt Nam, tiếp theo đó năm 1953 có 98 trường hợp VNNB trong quân đội viễn chinh Pháp.Trong thập kỉ 1960 có nhiều trận dịch viêm não siêu vi được gọi là hội chứng viêm não cấp tính gọi tắt là hội chứng não cấp (HCNC), xảy ra tại hầu hết các địa phương ở miền Bắc, có nơi tỷ lệ mắc bệnh hằng năm lên tới 6-10/100000 dân với tỷ lệ tử vong từ 5,7% - 28,5% và siêu vi VNNB là tác nhân gây ra 50% - 70% HCNC.Tại miền Nam viêm não siêu vi xảy ra rải rác quanh năm, số mắc cao nhất vào năm 1980 với tỷ lệ 4,95/100000 dân và tỷ lệ tử vong 27,46% thường tập trung nhiều ở đồng bằng sông Cửu Long, nơi có thói quen nuôi heo gần nhà. 7Về mặt dịch tễ học bệnh VNNB có đặc điểm: a. Nguồn lâyCác loài chim hoang dã như cò, diệc, cò quặm, liếu điếu và các loài chim khác sống gần các vùng đầm lầy là những vật chủ quan trọng mang mầm bệnh virus VNNB. heo là nguồn nhiễm virus huyết quan trọng truyền cho muỗi vì những lý do sau:- Heo đẻ được nhiều lứa, tạo ra số lượng một quần thể heo cảm nhiễm virus mới- Luân chuyển thường xuyên mỗi 6-8 tháng- Chỉ số heo nhiễm virus trong tự nhiên cao hơn tất cả gia súc khác- Nhiễm virus máu ở heo thường cao nên dễ truyền virus qua muỗi8 b. Trung gian truyền bệnh:Muỗi là con vật trung gian truyền bệnh quan trọng.Hiện nay có 30 loài muỗi khác nhau thuộc 5 họ Culex, Anopheles, Aedes, Mansoni và Amergeres là trung gian truyền bệnh VNNB do virus, trong đó có 2 loại C.tritae, C.vishui là vật chủ trung gian có khả năng truyền bệnh cao nhất. Muỗi hút máu động vật trong thời kỳ nhiễm virus huyết, virus nhân lên trong muỗi với hiệu quả cao, sau đó có khả năng truyền bệnh suốt đời và có thể truyền virus sang thế hệ sau qua trứng. Muỗi truyền mầm bệnh virus từ chim sang lợn và người khi đốt, muỗi cũng có thể truyền mầm bệnh virus từ lợn sang người.910c. Chu trình lây truyền virus VNNB:Virus VNNB được truyền sinh học từ động vật có xương sống này sang động vật có xương sống khác qua trung gian côn trùng hút máu là muỗi.Heo là vật chủ quan trọng nhất có khả năng làm lan rộng virus VNNB. Người được coi là vật chủ cuối cùng đối với virus VNNB và có vai trò rất quan trọng trong dịch tễ học bệnh này.Virus VNNB trong máu người tồn tại trong thời gian ngắn với nồng độ thấp, nên không thể lây bệnh từ người này sang người khác qua muỗi đốt.111213 d. Phân bố bệnhPhân bố theo mùa:Ở vùng ôn hòa, virus VNNB lan truyền vào mùa hè và đầu mùa thu. Ở vùng cận nhiệt và nhiệt đới, sự lan truyền virus theo mùa có liên quan đến sự thừa thải trung gian truyền bệnh là muỗi và vật chủ lan truyền có xươngMô hình dịch tễ học lại khác nhau giữa các vùng miền, cụ thể là ở 2 miền Nam Bắc Việt Nam. Tại miền Bắc bệnh giảm nhiều vào những tháng lạnh, tăng vào những tháng hè và đỉnh cao vào tháng 5-6-7. Tại miền Nam, thời tiết nóng bệnh rải rác quanh năm.1415Mô hình dịch tễ học lại khác nhau giữa các vùng miền, cụ thể là ở 2 miền Nam Bắc Việt Nam. Tại miền Bắc bệnh giảm nhiều vào những tháng lạnh, tăng vào những tháng hè và đỉnh cao vào tháng 5-6-7. Tại miền Nam, thời tiết nóng bệnh rải rác quanh năm.Phân bố theo tuổi và giới tính :Tất cả mọi lứa tuổi chưa có miễn dịch đều có thể mắc bệnh. Tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ cao thường từ 2-10 tuổi, phần đông ở thể không triệu chứng lâm sàng, số lượng trẻ có kháng thể đặc hiệu tăng theo tuổi nên tỷ lệ mắc bệnh giảm ở trẻ lớn và người lớn. Bệnh không liên quan tới giới tính tuy nhiên trong thực tế số bệnh nam thường nhiều hơn nữ.163. Cách sinh bệnhKhi bị muỗi đốt, virus từ nước bọt của muỗi qua da. Giai đoạn đầu virus nhân lên tại chỗ và ở hạch lympho vùng.Từ máu virus đi đến các tổ chức và nội tạng khác như tổ chức lympho, mô liên kết, cơ vân, cơ tim, tuyến nội và ngoại tiết.Virus tiếp tục nhân lên tại tổ chức ngoài thần kinh đưa đến virus huyết lần nữa kéo dài 3-5 ngày, thường với nồng độ thấp ở người. Nếu kháng thể trung hòa tăng kịp thì xảy ra hiện tượng virus huyết ngưng.Khi hàng rào mạch máu não bị tổn thương trong giai đoạn tiềm ẩn dễ tạo cơ hội cho virus xâm nhập thần kinh, như mắc bệnh VNNB trong trường hợp có sẵn bệnh cysticercosis não, hoặc sau chấn thương sọ não.17Những biến đổi bệnh lý trong quá trình phát triển của virus trong hệ thần kinh trung ương:Trong giai đoạn cấp tính, màng não bình thường hoặc thoáng mờ, não bị xung huyết , phù nề, xuất hiện điểm xuất huyết hoặc chảy máu tại chất xám, hoại tử ở đồi thị, nhân xám nền sọ, não giữa, tiểu não, nhân xám thân não, chất xám của võ não. Sừng trước tủy sống bị tổn thương giống như trong sốt bại liệt.Về mặt vi thể, tế bào thần kinh đệm thực bào thần kinh chết tạo ra những nốt điển hình, khi bệnh kéo dài tế bào viêm bao quanh huyết quản tạo thành những hình ảnh vỏ ngoại quản, cuối cùng xuất hiện những ổ hoại tử khan hiếm tế bào do những tế bào thần kinh bị thoái hóa, tiêu hủy tạo ra, đôi khi có chất vôi ứ đọng bên trong.184. Đặc trưng bệnhThời kì ủ bệnh từ 5-15 ngày. Bệnh nhân có triệu chứng giống như cảm cúm.Sau đó là một số triệu chứng như nhức đầu, khó chịu, nôn mửa...,có thể rối loạn tâm lý. Trẻ em thường kém ăn.Trong trường hợp nặng có thể suy nhược, liệt nhẹ, co giật, sốt cao 39-41oC, có thể dẫn đến hôn mê và tử vong.Ở trẻ có tình trạng rối loạn ý thức, nôn mửa, cứng gáy, sảng, ảo giác, co giật, động kinh và lâm vào tình trạng rối loạn nhịp thở, hôn mê.5. Điều trịChủ yếu điều trị triệu chứng, nâng đỡ bệnh nhân trong các đơn vị hồi sức cấp cứu (chống sốt, chống co giật, chống phù não, trợ tim mạch, hô hấp, chống rối loạn thần kinh thực vật, chăm sóc tích cực, dinh dưỡng tốt...).19II. Virus viêm não Nhật Bản và phương pháp chuẩn đoán virus đó bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào1.Virus viêm não Nhật Bản a) Giới thiệu chungVirus viêm não Nhật Bản thuộc họ Flaviridae, có quan hệ gần gũi với West Nile virus và ST.Louis encephalitis virus. Virus viêm não Nhật Bản hình cầu, nhân chứa RNA mạch đơn, kích thước 45-50nm, bao quanh bởi cấu trúc hình khối gọi là capsid, phần vỏ giàu chất lipid.Nó dễ mất hoạt lực ở nhiệt độ 56oC trong nửa giờ hoặc trong formalin 0,2%, ether, natrideoxycholate và cũng bị bất hoạt nhanh bởi tia tử ngoại.Virus này có thể được nuôi cấy trên tế bào thận heo, thận chuột Hamster, trên não chuột bạch sơ sinh, chuột bạch trưởng thành hay trên tế bào của tổ chức côn trùng như muỗi.20Virus viêm não Nhật Bản có 3 loại protein kháng nguyên: protein màng M, protein lõi C, protein vỏ E.2122b) Bộ gen virus VNNBBộ máy di truyền của virus viêm não Nhật Bản là 1 RNA mạch đơn232. Chuẩn đoán virus VNNB bằng kỹ thuật Shell vial culture (SVC)Shell vial culture (SVC) là sự biến đổi của công nghệ nuôi cấy tế bào thông thường cho phát hiện nhanh virus trong ống nghiệm. Kỹ thuật này gồm có sự tiêm nhiễm mẫu lâm sàng vào tế bào một lớp phát triển trên một lá kính đậy (lamen) trong ống nuôi cấy SVC, sau đó đem đi ly tâm ở tốc độ chậm rồi ủ.Hệ thống này làm việc trên nguyên lý ly tâm tốc độ chậm làm tăng tính nhiễm virus vào những tế bào nhạy cảm. Người ta nghĩ rằng chấn thương nhỏ trên bề mặt tế bào đưa đến kết quả của việc ly tâm tốc độ chậm làm gia tăng lực cho virus vào trong tế bào, việc này làm giảm tổng thời gian mà virus xâm nhiễm vào tế bào. 24SVC được dùng để chuẩn đoán nhanh nhiều loại virus khác nhau như cytomegalovirus, Herpes Zoster, Mumps (quai bị), Measles (bệnh sởi) và virus hợp bào hệ hô hấp.Trong tất cả các nghiên cứu, kỹ thuật SVC gia tăng tốc độ phân lập virus mà không làm giảm độ nhạy. Kỹ thuật SVC làm giảm thời gian so với kỹ thuật nuôi cấy tế bào thông thường. Kỹ thuật SVC tốn khoảng 36 giờ trong khi kỹ thuật nuôi cấy thông thường cần đến 3-7 ngày cho chuẩn đoán một mẫu quan trọng.Nguyên liệu và phương phápMẫu: Dịch não-tủy được lấy từ việc tiêm chích vào thắt lưng 50 bệnh nhân, bao gồm 46 bệnh nhân khoa nhi từ 18 tháng tuổi đến 12 tuổi và 4 người trưởng thành từ 13 đến 40 tuổi.25Dòng tế bào: Tế bào thận lợn (PS-Porcine Kidney) lấy từ trung tâm quốc tế về khoa học tế bào được sử dụng trong nghiên cứu. Tế bào phát triển trong bình nuôi cấy mô plastic và bình Roux ở 37oC.Dung môi: L-glutamine (3%), NaHCO3, vitamine, glucose (10%), huyết thanh bào thai bò (10%) và hỗn hợp kháng sinh (Penicillin 100U/ml, Gentamicin 4 mg/ml, Streptomycin 100µg/ml, Ciprofloxacin 2mg/ml và Amphoterincin-B5 mg/ml) được thêm vào sau khi Eagle’s modified MEM được hấp.Shell vials: hình trụ phần đáy được dát mỏng và tiệt trùng (4.5 cm x 1.5 cm), với lamen đường kính 13mm lấy từ Flow Laboratories, Scotland.26Phương thức của thử nghiệm Shell vial1ml tế bào thận (4 x 105 tế bào/ml) trong dung môi phát triển được thêm vào mỗi shell vial và ủ ở 37oC cho tới khi tế bào một lớp hợp dòng được tạo thành.Dung môi phát triển của virus được lấy ra. 300 µl mẫu xét nghiệm được tiêm nhiễm vào shell vial và nhuộm màu bằng kỹ thuật miễm dịch huỳnh quang trực tiếp.Shell vial được đem đi ly tâm 1000 rpm trong 45 phút tại nhiệt độ phòng sau đó thêm 1 ml dung môi bảo quản vào shell vial rồi đem ủ ở 37oC trong vòng 36h. Dung môi bảo quản được lấy ra cẩn thận khỏi shell vial và loại bỏ.27Tế bào một lớp được rửa với PBS (pH 7.2) 3 – 4 lần sấy khô và cố định bằng acetone trong 30 phút. Lamen được nhuộm bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang trục tiếp. Vết trải trên bàn kính sẽ được quan sát dưới kính hiển vi quang học, nếu có sẽ cho huỳnh quang tế bào chất màu xanh (apple green fluorescence).28Shell vial culture positiveKẾT LUẬN29Hiện tại các nhà khoa học trên khắp thế giới vẫn đang nghiên cứu về chủng virus viêm não Nhật Bản.Đối với phương pháp chuẩn đoán virus Viêm não Nhật Bản bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thì thường dùng phương pháp Shell vial culture. Đây là phương pháp chuyên dùng để chuẩn đoán các virus thuộc nhóm Flavivirus như Japanese Encephalitis Virus (JEV), West Nile Virus, Dengue-2 viral encephalitis virus,.Nó có những ưu điểm vượt trội hơn so với chuẩn đoán bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và phương pháp nuôi cấy tế bào thông thường.Ở Việt Nam phương pháp này chưa thật sự phổ biêns. Hy vọng trong tương lai sắp tới, phương pháp này sẽ được ứng dụng rộng rãi ở nước ta để chuẩn đoán nhanh và chính xác virus viêm não Nhật Bản phục vụ cho công tác điều trị bệnh này.30Cảm ơn thầy cùng các bạn đã theo dõi bài báo cáo của em!!!31