Bài giảng Nguyên lý phương pháp chọn giống cây trồng - Chương 5: Phương pháp tạo biến dị di truyền trong chọn giống cây trồng

nhƣng những chất thay thế này 
không phù hợp xử lý một số lƣợng lớn. 
5.4.4. Ứng dụng của đơn bội và đơn bội kép trong cải tiến giống cây 
trồng 
Phƣơng pháp phát triển dòng thuần truyền thống bằng thụ phấn cƣỡng 
bức của chính cây đó (tự phối) qua 8 - 10 thế hệ thu đƣợc dòng thuần, tuy 
nhiên không thể tạo đồng hợp hoàn toàn. 
Tỉ lệ đồng hợp tăng qua các thế hệ tự thụ phấn. Giả sử lai 2 bố mẹ đồng 
hợp AA x aa thu đƣợc con lai F1 (Aa), bắt đầu từ F1 cho thụ phấn hoàn toàn 
tỉ lệ đồng hợp và dị hợp thu đƣợc qua các thế hệ nhƣ sau: 
Bảng 5.6. Tỉ lệ đồng hợp qua các thể hệ tự thụ phấn 
Thế hệ tự thụ phấn 
Tỉ lệ (%) 
Đồng hợp Dị hợp 
F1 100 
F2 50 50 
F3 75 25 
F4 87,5 12,5 
F5 93,75 6,25 
F6 96,88 3,12 
F7 98,44 1,56 
F8 99,32 0,78 
5.5. TẠO BIẾN DỊ BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO 
Nuôi cấy mô tế bào tạo ra một lƣợng lớn biến dị di truyền ở các 
loài thực vật, những biến dị di truyền này có thể sử dụng trong các 
chƣơng trình chọn tạo giống cây trồng. 
Bằng chọn lọc in vitro các đột biến về đặc điểm nông sinh học có 
lợi, chống chịu mặn, hạn và chống chịu sâu bệnh có thể phân lập 
đƣợc trong một thời gian ngắn. 
Biến dị soma tạo thành giống mới thành công ở một số cây trồng 
nhƣ cải, lúa và cây trồng khác (S. Mohan Jain, 2001). 
7/18/15 
12 
5.5.1. Những thay đổi di truyền xảy ra trƣớc khi nuôi cấy mô in vitro 
Trong quá trình phát triển cá thể, phân hoá và già hoá của mô và tế 
bào, một số thay đổi di truyền xảy ra và đƣợc tích luỹ trong các tế 
bào soma. 
Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô, cây đƣợc tái sinh từ tế bào soma sẽ là 
các đột biến. 
Nguyên nhân gây đột biến có thể do cấu trúc bình thƣờng của hạt 
và tế bào bị phá vỡ - các enzym tiếp xúc với các chất và tạo ra sản 
phẩm đột biến. 
Tuỳ theo phƣơng thức nuôi cấy tế bào soma, ngƣời ta phân biệt các 
loại biến dị dƣới đây: 
Biến dị dòng tế bào mô sẹo (calusoclonal variation): khi cây biến dị 
tái sinh từ mô sẹo (calus). 
Biến dị dòng tế bào trần (protoclonal variation) - khi cây biến dị tái 
sinh từ tế bào trần. 
Những biến dị di truyền xảy ra và đƣợc phát hiện trong quá trình 
nuôi cấy in vitro gọi chung là đột biến dòng tế bào. 
5.5.2. Những thay đổi di truyền xảy ra trong quá trình in vitro 
Auxin gây ra đa bội hoá bên trong tế bào nuôi cấy. 
Mức độ đột biến tế bào soma lớn đến mức tần số đột biến do các 
chất đột biến gây ra. 
Có thay đổi số lƣợng, cấu trúc nhiễm sắc thể, đột biến gen. 
Thay đổi di truyền phổ biến nhất xảy ra trong tế bào nuôi cấy là đa 
bội thể. 
Đột biến tế bào soma xảy ra ở các gen trong tế bào chất (ty thể và 
lục lạp). 
Đột biến tế bào soma đã ứng dụng vào chọn giống hiệu quả ở nhiều 
cây trồng nhƣ mía, khoai tây, cà chua, thuốc lá, lúa và lúa mì. 
5.5.3. Ứng dụng của biến dị tế bào soma 
Biến dị và chọn lọc các đột biến tế bào soma xảy ra trong nuôi cấy 
in vitro cung cấp một số lƣợng lớn biến dị và có thể ứng dụng rất đa 
dạng: 
Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt 
tính sinh học với năng suất cao (xem công nghệ bioreactor) 
Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý, 
Ví dụ, các nhà khoa học ở Đài Loan đã chọn tạo đƣợc giống chuối 
thấp cây, chống chịu bệnh thối rũ do nấm Fusarium gây ra. 
Ở nƣớc ta, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã tạo đƣợc 
giống lúa mới DR2 có khả năng chịu hạn, chịu lạnh bằng phƣơng 
pháp chọn lọc các biến dị tế bào soma in vitro kết hợp xử lý các điều 
kiện cực đoan từ một giống lúa không có khả năng chống chịu. 
5.6. TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN DỰA TRÊN CÔNG NGHỆ GEN 
Ứng dụng công nghệ gen tạo biến dị di truyền ở mức phân tử ADN, 
locus tính trạng số lƣợng (QTL) hay từng gen, sau đây gọi chung là 
kỹ nghệ di truyền. 
Chuyển gen là một kỹ nghệ di truyền và là một công cụ mới bổ 
sung cho chọn tạo giống truyền thống và có thể giúp cho việc mở 
rộng các nguồn gen có lợi từ các loài khác chuyển sang các loài 
cây trồng mong muốn. 
Kỹ nghệ di truyền chuyển gen có lợi thế là có thể chuyển một gen, 
một số gen hay một QTL mà phƣơng pháp truyền thống rất khó 
thực hiện. 
Khái niệm cây trồng chuyển gen theo J. Machex (1997): “Cây 
trồng chuyển gen là cây đƣợc chuyển một hay nhiều gen mới từ đó 
ta thu đƣợc thêm một hay nhiều đặc điểm mới. Các gen đƣợc 
chuyển vào cây không phải bằng con đƣờng lai hữu tính giữa hai 
bố mẹ mà đƣợc chuyển bằng kỹ thuật di truyền”. 
5.6.1. Chuyển gen trực tiếp 
Là phƣơng pháp chuyển trực tiếp các gen đã đƣợc thiết kế trong plasmid 
vào tế bào thực vật có sự trợ giúp của yếu tố hoá học, vật lý và tác nhân cơ 
giới. 
Chuyển gen trực tiếp sử dụng một số kỹ thuật sau: 
a) Chuyển gen bằng xung điện 
Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trƣờng cực mạnh. 
Khi các tế bào trần (protoplast) trong điện trƣờng, sự dẫn điện và tính 
thấm của màng nguyên sinh bị thay đổi. 
Sự thay đổi này kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng hình 
thành lỗ hổng. 
Một loạt các lỗ hổng đƣợc hình thành, ADN đƣợc chuyển qua lỗ hổng vào tế 
bào gắn vào bộ máy di truyền. 
Tế bào chuyển gen đƣợc nuối cấy tạo calus, tái sinh cây và đánh giá cây 
chuyển gen. 
Một tế bào thực vật có thể tiếp thụ ADN nhờ xung điện mà không cần xử lý 
trƣớc nhƣ tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì. 
b) Chuyển gen nhờ phân tử PEG (polyethylene glycon) 
PEG là một phân tử lớn có phân cực, lợi dụng tính chất này ngƣời 
ta tách gen cần chuyển, đƣa vào dung môi cùng với phân tử PEG và 
tế bào trần. 
Các ADN bị hút vào các đầu phân tử PEG có điện cực trái dấu, sau 
đó PEG bị tế bào trần hút về phía nó. 
Các ADN trên đầu PEG đi vào tế bào trần theo cơ chế nuốt amip. 
Thuốc lá và hoa mào gà là hai đối tƣợng đầu tiên đƣợc sử dụng cho 
chuyển gen trực tiếp nhờ tác động của PEG. 
Nhƣợc điểm lớn nhất khi sử dụng phƣơng pháp chuyển gen bằng 
xung điện và nhờ xử lý PEG là việc tái sinh cây hữu thụ tốn rất nhiều 
thời gian, công sức mà kết quả phụ thuộc vào kiểu gen của loài cây 
trồng. 
Ngoài ra, vấn đề về các biến dị soma, có nhiều bản sao gắn trong 
hệ gen, tái sinh cây bạch tạng là những trở ngại cho việc chuyển 
gen khi sử dụng hai phƣơng pháp này ở cây hoà thảo (cây lúa). 
7/18/15 
13 
c) Chuyển gen bằng vi tiêm 
Ngƣời ta sử dụng vi kim và kính hiển vi để tiêm một lƣợng nhỏ ADN 
vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào trần hay tế bào nguyên. 
Phƣơng pháp này có ƣu điểm là ADN đƣợc đƣa vào tế bào một cách 
chính xác. 
Phƣơng pháp này cần thao tác khéo léo, yêu cầu trang thiết bị. 
Vật liệu chuyển gen là tế bào trần, hoặc qua ống phấn. 
Khi hạt phấn rơi trên đầu nhuỵ (quá trình thụ phấn), hạt phấn sẽ 
nảy mầm và hình thành ống phấn. Lúc này tiêm ADN mong muốn đã 
tách đi theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái, 
ADN cần chuyển kết hợp hình thành hợp tử có mang gen cần chuyển. 
Phƣơng pháp này khá thành công trên cây lúa và cây bông, tuy 
nhiên hạn chế của phƣơng pháp là kỹ thuật cao và tốn kém. 
d) Chuyển gen bằng bắn gen 
Lịch sử và thành tựu chuyển gen bằng bắn gen: 
Phƣơng pháp chuyển gen bằng bắn gen đƣợc Klein T.M., Wolf E.D. 
và Sanford J.C công bố lần đầu tiên năm 1987 với tiêu đề vi đạn tốc 
độ cao đƣa nucleic axít vào tế bào sống đăng trên tạp chí Nature số 
327. 
Các nhà khoa học sử dụng hạt tungsten có kích thƣớc nhỏ, khối 
lƣợng phân tử lớn, bay với vận tốc nhanh khi xuyên qua thành và 
màng tế bào không gây chết tế bào sống. 
Các tác giả cho rằng phƣơng pháp này có thể khắc phục những 
khó khăn của phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium 
tumefaciens vì phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn bị hạn chế 
phạm vi ký chủ. 
Nguyên lý chung chuyển gen bằng bắn gen: 
Thiết kế vector mang ADN cần chuyển, kết tủa ADN lên bề mặt vi 
đạn, sử dụng áp lực khí He (helium) bắn vi đạn bay đi xuyên qua mô 
tế bào. 
Các ADN trên bề mặt vi đạn đƣợc giữ lại trong mô tế bào và gắn 
vào bộ máy di truyền, tái sinh cây và đánh giá tế bào và cây chuyển 
gen. 
Vi đạn là các loại vi đạn là vàng, tungsten (Wolfram). 
Vật liệu sử dụng chuyển gen bằng bắn gen: Vật liệu sử dụng bắn 
chuyển gen có thể là mô tế bào, phôi, mô hạt, calus tế bào huyền 
phù trong nuôi cấy mô tế bào. 
Các bƣớc chuyển gen bằng bắn gen gồm: chọn kiểu gen, tách mô, 
thiết kế vector chuyển gen, xử lý mô, thiết kế quá trình bắn gen (kết 
tủa ADN trên bề mặt vi đạn, nuôi cấy tạo mô chuyển gen, nạp đạn 
và vi đạn), tái sinh cây, đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen. 
Hình 5.21. Sơ đồ các bƣớc bắn gen vào mô thực vật 
Bƣớc 1: Chọn kiểu gen và tách mô 
Kiểu gen sử dụng chuyển gen là dòng, giống ƣu tú cần cải tiến một 
hoặc một số tính trạng nào đó. 
Tách mô và khử trùng đƣa vào nuôi cấy in vitro tạo vật liệu chuyển 
gen. 
Ví dụ, chuyển gen CBF3 biểu hiện tăng cƣờng tính chịu lạnh, chịu 
mặn và chịu hạn ở cây Arabidopsis, thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) 
và lúa mỳ (Triticum aestivum L.) vào ngô bằng hạt cho nảy mầm trên 
môi trƣờng MS + vitamin B5 bổ sung thêm 9 µmol L
–1 2,4-D (2,4-
dichlorophenoxyacetic acid, Sigma, St. Louis, MO) trong 3 đến 4 
ngày. 
Bƣớc 2: Chuẩn bị vector chuyển gen 
Cấu trúc mang gen có nhiều loại khác nhau gọi là vector chuyển 
gen. 
Vector chuyển gen là plamid một phân tử ADN mạch đôi dạng vòng 
có kích thƣớc 1 đến hơn 400 kilobase pairs (kbp). 
Ví dụ: vector chuyển gen vào mô hạt ngô của Diaa Al-Abed và cs. 
năm 2007. Plasmid pC1301 mang vùng không phiên mã intron ß-
glucuronuridase (GUS) của Australia (Black Mountain, ACT, 
Australia). The GUS intron sử dụng để kiểm tra nhanh và xác định 
điều kiện biểu hiện trong bao mầm và mô phân sinh chồi. 
ADN cần chuyển đƣợc gắn vào vector trƣớc khi kết tủa lên bề mặt 
vi đạn. 
Mỗi loài cây trồng, vật liệu chuyển gen thiết kế vector chuyển gen 
phù hợp có ý nghĩa quan trọng để bắn gen thành công. 
7/18/15 
14 
Bƣớc 4: Chọn lọc và tái sinh cây 
Xác định kết quả chuyển gen đối với vector gắn GUS có thể nhận 
biết mô chuyển gen thành công nhờ sử dụng nhuộm màu trong 
dung dịch X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid) 
sau bắn gen 48 giờ và quan sát trên kính hiển vi. 
Các mô xác định chuyển gen thành công chuyển vào môi trƣờng 
nuôi cấy để tái sinh cây. 
Môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy tùy thuộc loài cây trồng. 
Ví dụ đối với nuôi cấy mô ngô chuyển gen trên môi trƣờng MSI 
trong 4 ngày, nhiệt độ 26oC và điều kiện ánh sáng 16/8 giờ 
sáng/tối, tiếp theo chuyển sang môi trƣờng MSI chọn lọc bổ sung 
thêm 25 mg/l hygromycin, thay môi trƣờng sạch hai tuần một lần 
trƣớc khi chuyển sang môi trƣờng tạo rễ là môi trƣờng MS có chứa 
3,2 μmol/ L NAA (1-naphthaleneacetic acid), bổ sung thêm 10 mg/ l 
hygromycin trƣớc khi chuyển ra ngoài giá thể và ngoài đất. 
Bƣớc 3: Bắn gen 
Thiết kế bắn gen cần quan tâm đến các điều kiện nâng cao hiệu 
quả của bắn gen nhƣ: áp lực khí He 
Theo nghiên cứu của Diaa Al-Abed và cs. (2007) áp lực khí He là 
10,69 MPa hiệu quả nhất 
Theo Elina Helenius và cs. (1996) kết quả tối ƣu nhất với 
Arabidopsis là 75psi, nhƣng tối ƣu với thuốc lá và bạch dƣơng là 
200psi. Kích thƣớc vi đạn vàng tối ƣu là 0,6µm và lƣợng ADN trên vi 
đạn là 1 µg tối ƣu cho cả 3 cây. Khoảng cách từ súng bắn gen đến 
mô từ 6 – 9cm là phù hợp. 
Bƣớc 5: Trồng đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen 
Cây chuyển gen đƣợc chuyển ra giá thể tiếp nhận, khi cây khỏe 
mạnh chuyển ra ngoài đất trong nhà kính, nhà lƣới, nhân cây và 
đánh giá. 
Trên cơ sở gen chuyển để thiết kế thí nghiệm đánh giá. Thí nghiệm 
đánh giá cây chuyển gen kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo, 
chống chịu bất thuận bằng gây bất thuận nhân tạo... Ngày nay nhờ 
marker phân tử, có thể đánh giá và nhận biết cây chuyển gen nhanh 
và chính xác hơn. 
Một số hạn chế của phƣơng pháp là các mô bị phá huỷ dẫn tới khả 
năng phục hồi và khả năng tái sinh thấp, khả năng tái sinh ra những 
cây không hoàn chỉnh, nhiều bản sao đƣợc chuyển vào trong tế bào 
gây khó khăn cho việc phân tích, hiệu quả chuyển gen thấp. 
5.6.2. Chuyển gen gián tiếp 
Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp là gen đƣợc chuyển vào tế bào 
thực vật qua một sinh vật trung gian, thƣờng là vi khuẩn hoặc virus. 
* Chuyển gen nhờ virus: 
Virus cũng đƣợc coi là một vectơ trong chuyển gen thực vật. Tiêu 
chuẩn để virus làm vectơ chuyển gen: 
Có cấu trúc ADN 
Không gây hại hoặc có độ gây hại thấp 
Có phổ ký chủ rộng 
Có khả năng mang gen 
Có khả năng di chuyển qua các lỗ tế bào. 
Có hai loại virus đảm nhận vai trò làm vectơ chuyển gen là: 
Caulifower Mosaic Virus (CaMV): virus hại cây họ cải 
Geninivirus: nhóm virus này gây hại trên phổ ký chủ rộng (cây 1 lá mầm và 
cây 2 lá mầm). 
* Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium: 
Hai chủng đƣợc sử dụng phổ biến để chuyển gen là A. tumefaciens 
và A. rhizogenes. 
Những nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium vào 
cây Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. đầu tiên của các nhà nghiên An, 
G. và cs. (1986), Lloyd, A. và cs. (1986), Sheikholeslam, S. N. & 
Weeks, D. P. (1987). 
Đến nay phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn thành công ở hầu 
hết các loài cây trồng nhƣ lúa, ngô, đậu tƣơng 
Nguyên lý của phƣơng pháp: dựa trên hiện tƣợng nhóm vi khuẩn 
Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật gọi là Ti-plasmid 
nhƣ mô tả trong hình 5.23. 
Ghi chú:(a) Ti- plamid chứa T-DNA ở vai phải (RB) và vai trái (LB), trong vùng phiên mã 
của virulence (vir); (b) Các T-DNA khoảng 25bp lặp lại và cung cấp điểm tiếp hợp để 
cắt DNA của endonuclease VirD2–VirD1. Nó cắt giữa nucleotides thứ ba và thứ tƣ của 
trình tự hai vai; (c) Bản sao của T-DNA phóng thích phân tử DNA sợi đơn (T-strand) có 
phân tử VirD2 gắn ở đầu 5’. Chuỗi còn lại của T- DNA có chức năng sinh học không dài, 
thƣờng sử dụng nhƣ điểm định hƣớng và toàn vẹn của T-DNA trong tế bào thực vật; T-
DNA tổ hợp vào bộ genome của ký chủ; (d) độ dài đầy đủ của sợi đơn; (e) phân tử T-
DNA bị cắt; (f) nhân bản phân tử T-DNA. 
 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/
7/18/15 
15 
Cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thƣơng tạo thành khối 
u, khối u tiếp tục phát triển khi không có mặt của vi khuẩn do 
nó đã truyền một đoạn ADN của Ti-plasmid (T-ADN) vào bộ gen 
của cây. 
Ti-plasmid là ADN mạch vòng kép có cấu trúc đƣợc chia thành 
bốn vùng chính gồm hai vùng tác động trực tiếp đến sự hình 
thành khối u là vùng T-ADN và vùng vir, hai vùng còn lại có 
chức năng của quá trình tiếp hợp và tái bản Ti-plasmid của vi 
khuẩn. 
Trong đoạn T-ADN gắn vào bộ gen có chứa ít nhất 3 gen tổng 
hợp các phytohormon auxin và cytokinin nên liên quan đến việc 
sản sinh hay duy trì sự phân chia tế bào liên tục tạo thành các 
khối u ở cây trồng. 
Quá trình vi khuẩn chuyển gen vào tế bào trải qua 10 bƣớc là: 
Bƣớc 1: vi khuẩn tiếp xúc với thực vật; 
Bƣớc 2 và 3: kích thích sự biểu hiện của vùng vir bằng tín hiệu đặc thù của 
ký chủ; 
Bƣớc 4: tạo phân tử ADN sợi đơn (T- strand), tổ hợp hoạt động của protein 
VirD1 và VirD2; 
Bƣớc 5: tế bào vi khuẩn tồn tại T-DNA nhƣ một phức hợp protein ADN với 
một phân tử VirD2 gắn ở đầu 5’ của T-strand và có một số protein vir khác 
chuyển vào tế bào ký chủ bằng hệ thống VirB/D4, mỗi bƣớc yêu cầu có 
tƣơng tác của T-pilus với 1 protein đặc thù của ký chủ; 
Bƣớc 6: bên trong tế bào chất của tế bào ký chủ T-DNA tồn tại một chút T-
complex thành thục, phân tử T-strand có độ dài hoàn chỉnh với vỏ là một số 
phân tử VirE2. Những phân tử này là T-DNA cấu trúc và protein cần thiết cho 
vận chuyển nhân đến nhân tế bào ký chủ, đây là bƣớc chính trong quá trình 
biến nạp di truyền; 
Bƣớc 7: thâm nhập vào nhân; 
Bƣớc 8: vận chuyển trong nhân; 
Bƣớc 9: T- DNA không vỏ bọc; 
Bƣớc 10: hòa hợp với di truyền ký chủ. 
Chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens phụ thuộc vào 
một số yếu tố liên quan đến vi khuẩn và thực vật. 
Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm: 
Chủng vi khuẩn, 
Mật độ vi khuẩn, 
Thời gian lây nhiễm, 
Hoạt tính của gen vir, 
Khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vectơ. 
Các yếu tố liên quan đến thực vật gồm: 
Loại cây, kiểu gen, 
Dạng mẫu mô, 
Khả năng phân bào của các tế bào đích và TP môi trƣờng 
Các bƣớc chuyển gen nhờ vi khuẩn 
Bƣớc 1: Tách và nhân vi khuẩn 
Vi khuẩn A. tumefaciens là vi khuẩn gram âm trong đất (hình 
5.24), phân lập và nuôi cây nhân vi khuẩn là bƣớc đầu tiên phục vụ 
công việc chuyển gen. 
Nuôi cấy, nhân vi khuẩn thông thƣờng trên môi trƣờng L-broth 
(LB), trong điều kiện 28oC, máy lắc 200 vòng phút, bổ sung kháng 
sinh phù hợp từ 8-12 giờ. 
Kháng sinh bổ sung trong nuôi nhân vi khuẩn, thƣờng là 
kanamycin nồng độ 50 mg/ml, carbenicillin nồng độ 50 hoặc 100 
mg/ml, và tetracycline nồng độ 2 mg/ml. 
Sau khi nhân tách dịch khuẩn bằng ly tâm và nhân vi khuẩn để sử 
dụng chuyển gen. 
Hình 5.24. Vi khuẩn A.tumefaciens 
Bƣớc 2: Gắn ADN cần chuyển vào Ti - plamid của vi khuẩn 
Các kỹ thuật chủ yếu của bƣớc này là tách ADN cần chuyển bằng 
ezime, tách Ti - plamid của vi khuẩn và cắt đoạn ADN tƣơng ứng 
tại vị trí nhân gen của plamid (Multiple cloning site - MCS). 
Đƣa DNA và Ti - plamid đã cắt đoạn tƣơng ứng và enzyme T4 - 
Ligase vào môi trƣờng đệm T4 để nối ghép DNA với Ti - plamid 
trong điều kiện nhiệt độ thấp qua đêm, kết quả thu đƣợc Ti - 
plamid đã gắn gen DNA cần chuyển dạng vòng. 
Bƣớc tiếp theo kiểm tra Ti - plamid trên E.coli xác định các Ti - 
plamid chuẩn đƣợc tách chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens, bƣớc 
tiếp theo lây nhiễm vào mô, tế bào thực vật chuyển gen. 
 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/
7/18/15 
16 
Hình 5.25. Vị trí nhân gen của Ti-plamid vi khuẩn A. tumefaciens 
Bước 3: Tách mô chuyển gen 
Vật liệu chuyển gen nhờ vị khuẩn có thể bằng đĩa lá, mô, calus, mô 
hạt được tách từ kiểu gen mong muốn cần chuyển gen, khử trùng, 
đưa lên môi trường nuôi cấy in vitro. 
Chuyển gen vào mô hạt khá phổ biến ở nhiều loài cây trồng như lúa, 
ngô, cây họ thập tự. 
Bước 4: Lây nhiễm vi khuẩn đã gắn plamid vào mô tế bào 
Lây nhiễm để chuyển gen bằng trộn vi khuẩn với vật liệu nuôi cấy 
trên môi trường chọn lọc, môi trường chọn lọc là môi trường có 
kháng sinh. 
Những tế bào nhận gen chuyển đồng thời nhận được cả promoter 
và gen kháng kháng sinh sẽ sống sót các tế bào khác bị chết trên 
môi trường chọn lọc. 
Những tế bào nhận gen sống sót phát triển thành calus và đưa sang 
môi trường tái sinh cây. 
Bƣớc 5: Tái sinh cây chuyển gen 
Môi trƣờng tái sinh cây là môi trƣờng cơ bản MS, có cải tiến đặc 
thù với mỗi loài cây trồng bổ sung thêm các chất điều tiết sinh 
trƣởng, vitamin và các hợp chất hữu cơ khác. 
Sau khi tái sinh cây in vitro chuyển cây ra giá thể tiếp nhận hoặc 
ngoài đất, nhân cây và đánh giá cây chuyển gen. 
Bảng 5.7. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy sử dụng 
trong thí nghiệm chuyển gen nhờ 
A. tumafaciens (Theo Sambrook và cs., 1989; Frame và cs., 2002) 
Thành phần LBa IM CCM ReM SeM RM 
N6/MS - N6 N6 N6 N6 MS 
Sucrose (g/l) - 30 20 20 20 20 
Glucose (g/l) - 60 10 10 10 
L-proline (g/l) - 0,7 0,7 0,7 
MES (g/l) - 0,5 0,5 
2,4-D (mg/l) - 2 2 1 
pH 7,0 5,2 5,8 5,8 5,8 5,8 
Phytagel (g/l) - 3 3 3 3 
AgNO3 (1mg/l) - 0,85 0,85 0,85 
AS (mM) - 200 200 
Cefotaxime 
(mg/l) 
- 250 250 250 
Myo-inositol 
(g/l) 
- 1 
Paromycin 
(mg/l) 
- 100 100 
Hóa chất khác Cao nấm men: 5g; Trypton: 10g; NaCl: 10g; Agar 15g 
Bước 6: Đánh giá cây chuyển gen 
Đánh giá cây chuyển gen thực hiện bằng các thí nghiệm đồng 
ruộng, thí nghiệm đánh giá trong nhà kính, nhà lưới. 
Thí nghiệm đánh giá kiểu hình kết hợp với marker phân tử để đánh 
giá nhanh và chính xác hơn. 
Cây trồng biến đổi gen trước khi đưa ra sản xuất đại trà cần được 
đánh giá rủi ro về an toàn sinh học, an toàn với sức khoẻ con người 
và an toàn với môi trường. 
 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/