Bài giảng Phát hiện virus Gumboro bằng phương pháp kết tủa trên thạch

PHÁT HIỆN VIRUS GUMBORO  BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA TRÊN THẠCH GVHD:TS.Nguyễn Ngọc Hải	SVTH :Phan Thị Phương ThanhNỘI DUNGI.ĐẶT VẤN ĐỀII.TỔNG QUANIII.PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BẰNG KỸ THUẬT KẾT TỦA TRÊN THẠCHIV.KẾT LUẬNV.TÀI LIỆU THAM KHẢOI.ĐẶT VẤN ĐỀBệnh Gumboro là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, gây thiệt hại rất lớn cho chăn nuôi gà, kể cả gà nuôi công nghiệp và gà chăn thả vườn. Tỷ lệ chết của gà khi bị nhiễm bệnh từ 3-20% nếu không ghép với các bệnh khác và từ 21-100% nếu nhiễm kèm với các bệnh khác gây ra bởi virút, vi khuẩn, ký sinh trùng.Việc áp dụng kỹ thuật phân tử vào việc phát hiện virus Gumboro trên gia cầm sẽ rút ngắn thời gian hơn do đó việc chữa trị và hạn chế sự lây lan mầm bệnh sẽ hiệu quả hơn. QUANII.1.Giới thiệu về bệnh GumboroII.2.Lịch sử phát hiệnII.3.Sơ lược về túi FabiciusII.4.Virus IBDVIII.Phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch để phát hiện virus GumboroIII.1.Nguyên lýIII.2.Các phản ứng kết tủa trong môi trường thạch agarIV.KẾT LUẬNII.1.Giới thiệu về bệnh GumboroGumboro là bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gà và gà tây được gây ra bởi Infectious bursal disease virus (IBDV),đặc trưng bởi sự phá huỷ túi Fabricius.Lứa tuổi gà mắc bệnh cao nhất là từ 3 - 6 tuần tuổi, gà nhỏ hơn có thể mắc bệnh ở thể tiềm ẩn, không biểu hiện triệu chứng, nhưng ảnh hưởng rất quan trọng vì nó làm ức chế miễn dịch, gà dễ mắc các bệnh nhiễm khuẩn khác. Trong những năm gần đây, nhiều dòng chủng IBDV (vvIBDV), nguyên nhân chính gây ra sự tử vong đồng loạt trên gà, đã xuất hiện ở châu Âu, Mỹ Latin, Đông Nam Á, châu Phi và Trung Đông Gumboro được coi là bệnh truyền nhiễm chính trên gà hiện nay. Gà ta nuôi theo phương thức bán công nghiệp cũng mắc bệnh, trên nhiều đàn tỷ lệ chết lên đến 20-25%.II.2.Lịch sử phát hiệnNăm 1962, Cosgrove đã phát hiện và mô tả một bệnh mới, xuất hiện ở thành phố Gumboro, vùng Dalaware ở Hoa Kỳ. Cuối năm 1962, Winterfield đã phân lập được từ phôi trứng tác nhân gây bệnh truyền nhiễm ở gà (bệnh tích ở túi Fabricius và thận). Năm 1986-1987, lần đầu tiên những dòng biến thể của IBDV được công bố. Năm 1987, sự nguy hiểm của IBDV lần đầu tiên được công bố tại Belgium và The Netherlands. Năm 1970, Hitchner đề nghị tên chính thức cho bệnh này là Infectious Bursal Disease (IBD) hay còn gọi là Gumboro. Virus gây bệnh là Infectious Bursal Disease Virus (IBDV). II.3.Sơ lược về túi Fabicius Là cơ quan dạng lympho trung ương, quá trình biệt hóa trong túi diễn ra không bị ảnh hưởng bởi kích thích kháng nguyên từ bên ngoài. Túi Fabricius nhỏ đi rất sớm.Chia túi ra thành các đơn vị cấu trúc gọi là các nang (Foliculum). Mỗi nang gồm có một vùng vỏ giàu lympho bào và một vùng tủy ít tế bào hơn nhưng có chứa tương bào. II.4.Virus IBDVII.4.1.Về cấu trúc sinh họcII.4.2.Về miễn dịch.II.4.3.Về sức đề kháng .II.4.5.Chất chứa mầm bệnhII.4.6.Đường xâm nhiễm và sự lây truyền của virus IBDVII.4.7.Cơ chế xâm nhiễmII.4.8.Triệu chứngII.4.9.Bệnh tíchII.4.1.Về cấu trúc sinh họcIBDV có dạng hình khối, nhiều gốc cạnh, khích thước: 55-65 nm, phân tử khối: 2.106 Dalton .IBDV là virus dạng trần, không có vỏ bọc ngoài. IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA cuộn tròn và được phân thành 2 đoạn riêng biệt, nó thuộc loài Avibirnavirus của họ Birnaviridae (Leong et al., 2000). Quanh nhân là vỏ protein (vỏ capsid). Lớp capsid này được hợp thành bởi 32 capsomer (đơn vị hình thái). Mỗi capsomer được tạo bởi 5 loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral Protein-VP). II.4.2.Về miễn dịch Serotype 1: gồm nhiều chủng gây bệnh cho gà .Những virus thuộc một trong những loại kháng nguyên phụ này thường được biết dưới dạng những biến thể, nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong trên gà từ 60-100%. Serotype 2: gồm có chủng virus gây bệnh cho gà tây. Về phương diện miễn dịch, giữa hai serotype không có khả năng miễn dịch chéo với nhau. II.4.3.Về sức đề kháng Chịu đựng được pH từ 2-12 .Ở 56oC, IBDV tồn tại trong 5h, ở 70oC thì bị tiêu diệt sau 30 phút, ở -50oC trong 18 tháng độc lực không suy giảm (Landgraf và cs, 1967). IBDV đề kháng hoàn toàn với ether, chloroform. Trong phenol 0.5% và timerosal 1.125% ở 50oC trong 1h, formalin 0.5% trong 6h, chloramin 0.5% trong 10 phút. Các hợp chất như: dẫn suất phenol, phức hợp iode, formol nồng độ cao, có thể diệt được IBDV. II.4.5.Chất chứa mầm bệnhThận và túi Fabricius, nơi chứa nhiều virus nhất. Ngoài ra, trong các chất tiết, thức ăn, nước uống, chất độn chuồng... cũng chứa virusII.4.6.Đường xâm nhiễm và sự lây truyền của virus GumboroVirus từ môi trường hoặc trong chuồng trại xâm nhập đường tiêu hóa vào cơ thể để gây bệnh.Gà giống có thể mang virus trong cơ thể nhưng không truyền qua trứng, do đó trong phôi không có virus Gumboro.Gà con từ 1 ngày tuổi có thể nhiễm virus Gumboro do virus bám vào vỏ trứng hoặc qua các dụng cụ chăn nuôi, chuồng trại không được sát trùng đúng mức.Tuổi mẫn cảm của gà đối với virus Gumboro từ 1 ngày tuổi đến 6 tuần tuổi, thường gà trên 9 tuần tuổi ít khi mắc bệnh.II.4.7.Cơ chế xâm nhiễm	II.4.8.Triệu chứngGà bị nhiễm virus sớm, trước 2 tuần tuổi sẽ mắc bệnh thể tiềm ẩn. Gà không có triệu chứng lâm sàng lộ ra ngoài nhưng túi Fabricius bị tổn thương nặng :viêm, phù, xuất huyết và sau đó bị teo. Gà nhiễm bệnh sau 2 - 3 tuần tuổi có biểu hiện lâm sàng rõ rệt. Bệnh thường phát ra đột ngột với thời gian ủ bệnh ngắn (1 - 2 ngày), tiến triển bệnh rất nhanh trong vòng 1 - 2 ngày, gần như đồng loạt 100%, tỷ lệ chết cao nhất vào những ngày thứ 3, thứ 4, sau đó giảm dần, đến ngày thứ 7, 8 gà hồi phục. Triệu chứng chủ yếu là bỏ ăn, gục đầu vào cánh, hay mổ hậu môn lẫn nhau, uống nhiều nước, có phân lỏng màu trắng hơi nhày, thường nằm úp, mệt mỏi. Gà gầy sút nhanh do bị mất nước.II.4.9.Bệnh tíchII.4.9.1.Bệnh tích đại thểII.4.9.2.Bệnh tích vi thểII.4.9.1.Bệnh tích đại thể -Lách sưng. -Thận sưng, biến đổi màu, ống niệu quản đầy muối urat. -Xuất huyết từng đám ở cơ ngực, cơ đùi. -Da chân khô tóp lại (cơ thể bị mất nước do tiêu chảy). -Dịch niêm mạc tăng. -Túi Fabricius không ngừng bị biến đổi: II.4.9.2.Bệnh tích vi thểCó hoại tử của các thành phần tế bào lympho như: ở túi Fabricius, ở van hồi manh tràng, lách. Các thành phần của tế bào lympho bị phá hủy, nhân tế bào bị teo rỗng. III.Phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch để phát hiện virus GumboroIII.1.Nguyên lýIII.2.Các phản ứng kết tủa trong môi trường thạch agar III.1.Nguyên lýSự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên hòa tan và kháng thể tương ứng xảy ra hình thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể, phức hợp kháng nguyên-kháng thể đạt được mức độ nhất định thì có sự bảo hòa, lúc này sẽ xảy ra hiện tượng kết tủa. Sự kết tủa này biểu hiện bằng chất cặn màu trắng xám trông rất rõ. Sự kết tủa này đòi hỏi điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp, có chất điện giải. III.2.Các phản ứng kết tủa trong môi trường thạch agarIII.2.1. Phản ứng kết tủa khuếch tán trong ống nghiệmIII.2.2Vật liệu để chẩn đoán bệnh Gumboro theo phương pháp kết tủa khuếch tán trên thạchIII.2.3.Ứng dụng III.2.1. Phản ứng kết tủa khuếch tán trong ống nghiệm+Phương pháp kết tủa khuếch tán trên thạch đơn giản của Oudin +Phương pháp kết tủa khuếch tán kép của Oúkeyfulthor+ Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thach trên phiến kính (phương pháp Ouchterlony)+Phương pháp kết tủa khuếch tán trên thạch đơn giản của Oudin Cho thạch và kháng thể trộn lẫn với nhau, rồi cho vào ông nghiệm. Sau đó cho kháng nguyên vào trên mặt thạch, kháng nguyên sẽ khuếch tán xuống dưới gặp kháng thể tương ứng, kết tủa sẽ xuất hiện ở vùng mà kháng nguyên-kháng thể có tỷ lệ tương ứng +Phương pháp kết tủa khuếch tán kép của OúkeyfulthorCho kháng thể vào ống nghiệm, rồi cho thạch vào, sau đó cho kháng nguyên lên trên thạch. Sẽ có sự khuếch tán lên của kháng thể và khuếch tán xuống của kháng nguyên, vùng kết tủa sẽ xuất hiện ở chổ kháng nguyên-kháng thể có tỷ lệ đồng đều tương ứng. + Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thach trên phiến kính (phương pháp Ouchterlony)III.2.2Vật liệu để chẩn đoán bệnh Gumboro theo phương pháp kết tủa khuếch tán trên thạch: Kháng nguyên: Thận, lách, túi fabricius của những con gà có triệu chứng bệnh, bệnh tích đặc trưng đem nghiền nhỏ pha với dung dịch PBS với tỷ lệ ½, xử lý kháng sinh, đông tan 3 lần. Huyết thanh: Sử dụng huyết thanh dương tính tự chế. III.2.3.Ứng dụng +Khảo sát mối quan hệ kháng nguyên, kháng thể. +Định lượng sơ bộ hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của xúc vật được gây miển dịch. Tiến hành thí nghiệm+Chuẩn bị vật liệu: * Agar Difco 1.5g. * NaCl 8.5g. * Phenol 0.5ml. * Nước cất vừa đủ 100ml. Cách làm Hòa muối và phenol trong nước cất, chỉnh pH=7.5, cho agar vào đun cách thủy cho tan, lọc qua vải gạc. Đổ thạch lên lam kính một lớp dày khoảng 3mm và để lam trong nhiệt độ 4-10oC/10 phút cho thạch đông lại. Dùng ống sắt có dường kính 3mm đục lổ, mỗi cụm 7 lổ, một lổ ở giữa và 6 lổ xung quanh :Lỗ giữa cho huyết thanh đã biết. Các lỗ xung quanh thì 2 lỗ cho kháng nguyên chuẩn dương ứng với huyết thanh đã biết để làm đối chứng dương, 2 lỗ tiếp cho kháng nguyên âm tính để làm đối chứng âm, 2 lỗ còn lại cho kháng nguyên cần chẩn đoán. Sau đó cho vào tủ ấm 37oC từ 6-24h, đem ra đọc kết quả. Nếu thấy giữa huyết thanh và kháng nguyên nghi xuất hiện vạch kết tủa giống như huyết thanh và kháng nguyên chuẩn thì kháng nguyên nghi tương ứng với kháng thể. IV.KẾT LUẬNBệnh Gumboro là một bệnh rất nguy hiểm ở gà và có khuynh hướng lây lan nhanh trong đàn gà công nghiệp gây thiệt hại về mặt kinh tế cho các hộ chăn nuôi.Phương pháp phát hiện virus Infectious bursal disease bằng kỹ thuật kết tủa trên thạch là phương pháp phù hợp để rút ngắn thời gian xét nghiệm.Do vậy việc chữa trị sẽ mang lại hiệu quả cao hơn,ít gây thiệt hại hơn về mặt kinh tế.Phương pháp kết tủa trên thạch là phương pháp đơn giản,nhanh chóng và tương đối rẻ tiền ,có thể áp dụng dễ dàng tại các phòng thí nghiệm.V.Tài liệu tham khảo	Nguyễn Ngọc Hải, 2007, Công Nghệ Sinh Học Trong Thú Y, NXB Nông Nghiệpệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử. ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC K29