Bài giảng Thực hành vi sinh vật thực phẩm - Nguyễn Trường Thành

1BỐ CỤC CHƯƠNG TRÌNHBài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong một mẫu thực phẩm Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của VSVBài 3: Xác định khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật2THỰC HÀNH VI SINH VẬT THỰC PHẨM Cán bộ phụ trách: ThS. NGUYỄN TRƯỜNG THÀNH	 Tel: 0989658724 . Email: thanhcntp@gmail.com KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨMBỘ MÔN THỰC PHẨM DINH DƯỠNG 3Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩmI. Khái quát chung về công tác xác định số lượng VSVMục tiêu: 	giúp cho người nghiên cứu biết được mật độ vi sinh vật có trong mẫu thực phẩm là bao nhiêu, phục vụ cho công tác nghiên cứu (tỷ lệ tiếp giống), hoặc cho công tác công bố chất lượng thực phẩm .Các phương pháp xác định:	+ Phương pháp xác định trực tiếp 	+ Phương pháp xác định gián tiếp4Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩmII. Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật1. Nguyên tắc- Sử dụng khung đếm (buồng đếm) Goriaep. Đây là phiến kính dày, phần giữa phiến kính có khắc 1 lưới các ô vuông với diện tích là 1mm2. - Lưới khắc chia thành 25 ô vuông lớn  diện tích 1 ô vuông lớn là 1/25 mm2	Mỗi ô vuông lớn lại chia thành 16 ô vuông nhỏ  Số ô vuông nhỏ trên lưới khắc là 400 ô  diện tích hình vuông nhỏ là 1/400 mm2- Chiều sâu của mỗi ô là 0,1mm  mỗi ô vuông nhỏ có thể tích là 1/4000 mm3 hay tương đương là 1/4000000ml (vì 1ml = 1000 mm3 )5Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩmII. Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật2. Cách tiến hành- Pha loãng mẫu đến nồng độ 1/10000 - Nhỏ một giọt dịch huyền phù có vi sinh vật vào giữa khung đếm và đậy kín bằng lá kính, di chuyển nhẹ khung đếm làm dịch chiếm đầy các khoang. - Đặt khung đếm vào bàn kẹp tiêu bản của kính hiển vi, chọn vật kính 10x hoặc 40x rồi từ từ dùng ốc chỉnh thô đưa bàn kẹp tiêu bản lên trên để buồng đếm gần chạm vào vật kính. - Dùng ốc vi chỉnh từ từ đưa tiêu bản xuống dưới để tìm ảnh và lấy nét. Tiến hành đếm số tế bào trong 10 ô vuông lớn hoặc 20 ô vuông nhỏ.6Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩmII. Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật3. Tính kết quả:- N = 1000. a. n/h.s - Trong đó N: số tế bào trong 1 ml dịch huyền phù; a là số tế bào trung bình trong 1 hình vuông của lưới, h là chiều sâu của khung đếm; n là độ pha loãng dịch huyền phù; s là diện tích một hình vuông của lưới7Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩmIII. Xác định số lượng vi sinh vật (nấm men) của một mẫu thực phẩm bằng phương pháp gián tiếp thông qua phương pháp đếm khuẩn lạcNguyên tắc:Mẫu được đồng nhất và được pha loãng đến nồng độ thích hợp rồi cấy trên môi trường thạch chọn lọc cho từng nhóm, loài VSV. Xác định số lượng khuẩn lạc trên bề mặt thạch sau thời gian nuôi trong tủ ấm.Cách đếm: lấy bút chì kẻ 2 đường vuông góc ở đáy hộp petri. Đếm số khuẩn lạc trong từng góc theo thứ tự từ trái qua phải, từ trên xuống dưới. 8Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩmIII. Xác định số lượng vi sinh vật (nấm men) của một mẫu thực phẩm bằng phương pháp gián tiếp thông qua phương pháp đếm khuẩn lạc2. Cách tiến hành:Pha loãng mẫu đến nồng độ 1/1000000 - 1/100000000Cấy 1ml dịch mẫu vào đĩa petri (3 đĩa/1 nồng độ)Chuẩn bị môi trường nuôi hansen, đợi môi trường giảm nhiệt độ xuống 50 độ, đổ vào các đĩa petri đã cấy mẫu (chiều dày lớp môi trường từ 2 – 3mmXoay đĩa 4 vòng theo chiều kim đồng hồ và 4 vòng ngược chiều kim đồng hồ để mẫu và môi trường hòa đều với nhau. Đợi môi trường đông lại, ủ trong tủ ấm. Xác định số khuẩn lạc sau 48h nuôi.9Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩmIII. Xác định số lượng vi sinh vật (nấm men) của một mẫu thực phẩm bằng phương pháp gián tiếp thông qua phương pháp đếm khuẩn lạc3. Tính kết quả:A (CFU/g hoặc CFU/ml) = M.a.f.N hoặc A = M/ n1.v1f1 + .......+ nivifiTrong đó A là mật độ tế bào trên 1 đơn vị thể tích mẫuM là số khuẩn lạc trung bình trong 1 đĩa petriN1: số đĩa, V1: thể tích = 1ml, f1: nồng độa là thể tích mẫu đem cấy ( = 1ml)N hệ số tính theo khối lượng khô tuyệt đối của mẫu nghiên cứu10Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩmIV. Đặt thí nghiệm cho quá trình lên men rượu, lactic, axeticThí nghiệm lên men rượu: Chuẩn bị 100ml dung dịch đường saccharose10% cho vào bình tam giác 250ml, thêm 0.1 – 0.2g nấm men Saccharomyces cerevisiae đã được hòa trong 10ml dịch đường 10% trước đó 1h.2. Thí nghiệm lên men lactic:Chuẩn bị 100ml sữa tươi vào bình tam giác 250ml. Thêm vào 10g sữa chua. Đặt trong tủ ấm 40độ C.3. Đặt thí nghiệm lên men axetic:100ml bia + 1ml rượu + 10ml axetic 1N. Nuôi 30độ C.11Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩmIV. Đặt thí nghiệm cho quá trình lên men rượu, lactic, axetic4. Thí nghiệm thử khả năng sinh tổng hợp enzyme của VSV- Chuẩn bị môi trường với thành phần:NaNO3: 3g/l; K2HPO4: 1g/l; KCl: 0,5g/l; MgSO4.7H20: 0,5g/l; FeSO4: 0,1g/l; Tinh bột tan: 15g/l; Agar: 20g/l; Nước: 1000mlChú ý: Tinh bột tan hòa trong nước ấm cho tan thành dạng hồ rồi mới đổ vào môi trườngCấy nấm mốc Aspergillus và Penecillium (8 đĩa, 1 mốc 4 đĩa)Môi trường Hansen: Glucoo: 50g, Pepton: 10g, K2HPO4 : 3g, MgSO4.7H2O: 2 g/l Nước : 1000ml, Agar: 20g12Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của vi sinh vật Quá trình lên men lactic : Quan sát hiện tượng, xác định lượng axit lactic tạo thành, định làm tiêu bản quan sát hình thái các chủng vi khuẩn lactic.... 1ml NaOH 0.1N = 0,009g lactic Quá trình lên men axetic : Quan sát hiện tượng, xác định lượng axit axetic tạo thành, làm tiêu bản quan sát hình thái các chủng vi khuẩn axetic.... 1ml NaOH 0.1N = 0,006g Đặt thí nghiệm thử khả năng tổng hợp emzym amilaza và proteaza13Bài 3: Xác định khả năng sinh tổng hợp enzym của VSV 1. Quan sát hình thái các chủng vi sinh vật đã sử dụng: 	- Nấm mốc (Aspergillus): nhuộm đơn, quan sát hệ sợi nấm, bào tử2. Xác định khả năng tổng hợp enzyme amilaza và proteaza của vi sinh vật Thành phần môi trường Hansen: Saccharose: 20g/l; Pepton: 10g/l; KH2PO4: 3g/l; MgSO4.7H2O: 2g/l; Nước cất: 1000ml; pH 5,6.PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM14Các bước tiến hành:·        Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.·        Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.·        Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1- 2 phút, rửa nước, thấm khô.·        Nhuộm lại bằng dung dịch Iod (lugon) trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.·        Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.·        Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 1-2phút, rửa nước, để khô trong không khí.·        Soi kính: dùng vật kính dầu 100´.Kết quả:Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏQUÁ TRÌNH BẮT MÀU CỦA VI KHUẨN15