Bài giảng Vinh sinh vật học đại cương - Chương 6: Các phương pháp phân tích định lượng vi sinh vật

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 
ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT 
I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP 
- Dùng để xác định các loại vi sinh vật đơn bào cĩ 
kích thước lớn. 
- Quy trình cho phép xác định nhanh chĩng số lượng 
vi sinh vật 
-Khơng phân biệt được tế bào sống và chết 
-Khơng phân biệt được các tế bào vi sinh vật và hạt 
vật thể 
-Hạn chế đối với huyền phù cĩ mật độ thấp 
Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu 
I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP 
Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu trên kính hiển vi 
I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP 
1. Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu 
Quy trình: 
 - Pha lỗng mẫu (5-10 tế bào/ơ nhỏ) 
 - Nạp mẫu vào buồng đếm 
 - Đếm số lượng tế bào hiện diện trong 5 ơ lớn 
Tính mật độ: 
 Mật độ tế bào: N/ml = 0,25a x 106 tế bào/ml 
 a: trung bình cộng số lượng tế bào trong 5 ơ lớn 
I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP 
II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC 
- Dùng để xác định các loại vi sinh vật sống trong mẫu 
- Độ nhạy cao, định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp 
- Cĩ thể định lượng các vi sinh vật kích thước nhỏ, di 
động 
II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC 
Quy trình: 
- Pha lỗng 
mẫu (25-250 
khuẩn lạc/đĩa) 
- Tạo hộp đổ 
- Nuơi ủ, đếm 
số lượng 
II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC 
II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC 
Máy đếm khuẩn lạc 
Bút đếm khuẩn lạc 
II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC 
Tính kết quả: 
Với : 
 N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g 
 hay 1ml mẫu. 
 C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn 
 n1 : Số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ i 
 di: hệ số pha loãng tương ứng. 
 v: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa 
)...(
)//(
11 iivdnvdn
C
mlghayCFUCFUN



Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí 
10 g mẫu + 90 g Salin Pepton Watter 
Đồng nhất bằng stomacher / 30 giây 
Dung dịch 10 -1 
Pha lõang 10-2, 10-3, 10-4,.. 
Cấy 1ml/petri – 3 độ pha lỗng liên 
tiếp – 2 petri/độ pha lõang 
Cho 15-20 ml PCA/petri. Lắc đều 
Tổng VSV hiếu khí/g (TPC) 
 N 
 TPC = 
 n1V1F1 + .+ niViFi 
N: Tổng KL; n: số đĩa cho mỗi nồng độ 
V: Thể tích cấy (=1) ; F: độ pha lõang 
Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí 
Để đơng đặc 
Lật ngược đĩa, ủ ấm 30±1oC/ 72±6h 
Khuẩn lạc 
Chọn đĩa cĩ 25 – 250 khuẩn lạc  đếm 
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC 
- Định lượng vi sinh vật cĩ mật độ thấp 
- Định lượng thơng qua số lượng khuẩn lạc 
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC 
- Kích thước lỗ lọc: 0,45 m hoặc 0,2 m 
- Thường dùng màng lọc kỵ nước, in các ơ vuơng ngăn cản sự 
mọc lan của khuẩn lạc 
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC 
Bộ lọc và 
màng lọc vơ trùng 
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC 
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC 
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC 
Quy trình: 
 - Khử trùng dụng cụ lọc 
 - Lọc chân khơng 
 - Nuơi cấy màng lọc trên mơi trường dinh dưỡng 
 - Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa petri 
Tính mật độ: 
 MPN = N x ln(N/N - x) 
 Với: N: Tổng số các ơ vuơng 
 x: số ơ cĩ khuẩn lạc mọc 
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC 
III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC 
 Vi khuẩn phát triển trên màng lọc 
IV. PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM 
- Kỹ thuật dùng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, coliform, 
coliform phân, nấm mốc, nấm men 
- Kỹ thuật dễ thao tác 
- Tiết kiệm khơng gian ủ, bảo quản, thời hạn sử dụng lâu 
- Khơng cần hấp khử trùng mơi trường 
IV. PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM 
IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) 
- Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật cĩ xác 
suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu 
- Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một 
loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha lỗng khác nhau 
- Kết quả định tính: sinh hơi, đổi màu, hố đục của mơi trường 
nuơi cấy  dương tính 
- Độ chính xác phụ thuộc vào số ống nghiệm lặp lại ở mỗi độ 
pha lỗng (3 hoặc 5 lần) 
- Phương pháp dùng định lượng mọi nhĩm vi sinh vật nuơi trên 
mơi trường chọn lọc, cho kết quả biểu kiến. 
IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) 
Phương 
pháp 
MPN 
(loạt 5 
ống) 
IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) 
Bảng tra MPN 
(loạt 3 ống) 
Số lượng ống dương tính Số 
MPN/100ml Số ml mẫu sử dụng 
10 1 0,1 
0 0 0 - 
0 0 1 3 
0 0 2 6 
0 0 3 9 
3 3 0 240 
3 3 1 460 
3 3 2 1100 
3 3 3 - 
IV. PHƯƠNG PHÁP MPN 
(MOST PROBABLE NUMBER) Bảng tra MPN (loạt 5 ống) 
IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) 
Quy trình: 
 - Pha lỗng mẫu bậc 10,chọn 3 nồng độ liên tiếp 
 - Cấy vào loạt ống nghiệm (9 hoặc 15 ống) chứa mơi trường chọn lọc 
một lượng mẫu xác định từ 3 nồng độ đã chọn 
 - Nuơi ủ, xác định số ống dương tính ở 3 nhĩm 
 - Tra bảng Mac Cradytrị số MPN (a) 
Tính mật độ: 
 Số MPN/100ml (MPN/1g) = a x x d 
Với: a: trị số tra từ bảng Mac Crady 
 V2: thể tích mẫu sử dụng (thường là 1) 
 V1: thể tích mẫu theo bảng Mac Crady ở loạt ống đầu tiên (10ml) 
 d: hệ số pha lỗng ở loạt ống đầu tiên 
1
2
V
V
V. PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC 
V. PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC 
V. PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC 
- Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng tế bào vi sinh 
vật có trong môi trường. Trong một giới hạn nhất định, mối quan 
hệ giữa số lượng vi sinh vật trong môi trường tỷ lệ tuyến tính với 
độ đục của môi trường. 
 Do đó có thể định lượng vi sinh vật trong môi trường bằng 
máy đo độ đục hay máy so màu ở bước sóng 550 – 610nm. 
- Trong phương pháp này cần xây dựng biểu đồ tương quan 
tuyến tính giữa độ đục và số lượng vi sinh vật có trong môi 
trường bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp 
V. PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC 
* Phương pháp tiến hành: 
- Pha loãng huyền phù chứa vi sinh vật cần kiểm nghiệm sao cho các dung 
dịch thu được khi đo trên máy so màu ở bước sóng 610nm được các trị số 
OD gần 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. 
- Dùng phương pháp đếm trực tiếp xác định lượng tế bào vi sinh vật có trong 
1ml ký hiệu N/ml. 
- Tính giá trị log (N/ml) cho từng mức nồng độ pha loãng. Vẽ đồ thị biểu 
diễn log (N/ml) theo các giá trị OD. Xác định khoảng tuyến tính giữa log 
(N/ml) với OD. 
* Tính mật độ: 
- Từ trị số OD đo được đối chiếu trên đồ thị tương quan giữa mật độ tế bào 
và OD để xác định lượng tế bào có trong mẫu nghiên cứu. 
 N/ml = 10
a
 với a=log (N/ml). 
VI. PHƯƠNG PHÁP ELISA 
(Enzyme linked immunosorbent assay) 
- ELISA (Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme) dựa trên 
nguyên tắc phản ứng kết hợp giữa tế bào (kháng nguyên) với một 
kháng thể đặc hiệu. 
- Tín hiệu phản ứng miễn dịch được nhận biết qua sự ngưng tủa, kết 
dính của kháng nguyên-kháng thể hoặc bằng những kháng thể đã 
được đánh dấu (phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzym). 
VI. PHƯƠNG PHÁP ELISA 
(Enzyme linked immunosorbent assay) 
VI. PHƯƠNG PHÁP ELISA 
(Enzyme linked immunosorbent assay) 
Đĩa ELISA 
VII. PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase chain reaction) 
- Phương pháp PCR dùng để tổng hợp DNA dựa trên khuôn DNA ban đầu, 
khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao 
nhờ enzym polymerase mồi đặc hiệu. 
- Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: 
+ Biến tính: Mạch ADN tách thành dạng mạch đơn (94-95
o
C, 30-60 giây) 
+ Lai: các mồi bắt cặp với mạch khuôn (40-70
o
C, 30-60 giây) 
+ Kéo dài: Enzyme Polymerase hoạt động, tổng hợp AND (72
o
C, 30 giây – vài 
phút) 
- Chu kỳ ba bước lặp lại nhiều lần, sau 30-40 chu kỳ sẽ tạo ra 10
6
 bản sao. 
- Sau phản ứng PCR, ADN được nhuộm bởi ethidium bromide, quan sát qua 
điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV 
VII. PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase chain reaction) 
VII. PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase chain reaction) 
VII. PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase chain reaction) 
Quy trình thực hiện: 
- Tăng sinh: vi sinh vật được nuôi cấy tăng sinh trên 
môi trường chọn lọc (TSB) 10-20 giờ. 
- Tách chiết DNA vi sinh vật 
- Thực hiện phản ứng PCR 
- Điện di trên gel agarose 1,5%, đọc kết quả trên 
đèn UV. 
VIII. PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG SINH HỌC ATP 
-Phân tử ATP hiện diện ở tất cả các tế bào sinh vật sống. ATP có thể được phát 
hiện một cách nhanh chóng bởi lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp với 
enzym luciferase nhờ một máy đo sáng. Cơ chế phản ứng phát quang của phương 
pháp xảy ra như sau: 
Luciferase + Luciferin + ATP  Luciferase-Luciferin AMP + PPi 
Luciferase-Luciferin AMP + O2  Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv (phát quang) 
-Kỹ thuật này có thể phát hiện được 1pg ATP (10
-12
g) tương đương với khoảng 
1000 tế bào vi khuẩn (10
-15
g ATP/tế bào). 
- Sự phân tích được thực hiện nhanh chóng chỉ diễn ra trong vài phút. 
VIII. PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG SINH HỌC ATP 
Dụng cụ quẹt bề mặt Máy đo sáng 
VIII. PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG SINH HỌC ATP