Báo cáo Định loại sán lá gan lớn bằng kỹ thuật RAPD-PCR

ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN BẰNG KỸ THUẬT RAPD-PCRSinh viên thực hiện:Lê Thanh VươngGiáo viên hướng dẫn:TS. Nguyễn Ngọc HảiNội dung chínhI. Giới thiệu chungGiới thiệu về sán lá gan và bệnh sán lá ganKỹ thuật PCRKỹ thuật điện di trên gel agaroseKỹ thuật RAPD-PCRII. Vật liệu và phương phápIII. Kết quảIV. Kết luậnI. Giới thiệu chungSán lá gan lớn là loại ký sinh trùng nguy hiểm đối với người và gia súc.Việc giám định loài ở sán lá gan là cần thiết, giúp nhận biết loài gây bệnh cụ thể tiện lợi trong kiểm soát bệnh.Phân biệt sán lá gan qua hình thái rất khó.Kỹ thuật RAPD-PCR giúp phân biệt các cá thể khác nhau thông qua sự khác biệt bộ gen, hỗ trợ cho chẩn đoán miễn dịch đặc hiệu và tạo cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo để phòng trị sán lá gan lớn cho cả người và gia súc.1. Giới thiệu sán lá gan lớn và bệnh sán lá gan lớnSán lá gan lớn- Hình chiếc lá, kích thước 10 – 30 x 12 mm. Ký sinh ở gan, trong đường mật người và gia súc. Đôi khi ký sinh trong cơ bắp, dưới giaMột số hình về sán lá ganSự phát triển và vòng đời của sán lá gan lớnHình: Sơ đồ phát triển và vòng đời của sán lá ganBệnh sán lá gan lớnKhi người bị nhiễm ấu trùng sán lá gan vào bộ phận tiêu hóa, ấu trùng đó sẽ theo máu di hành đến gan và cư trú ở đó. Một số trường hợp, ấu trùng theo đường máu cư trú ở các cơ quan khác như phổi, dưới da thì chúng vẫn phát triển được.Đối với trâu bò sán lá gan cư trú trong ống mật. Do vậy, phương pháp tìm trứng trong phân rất dễ dàng. Động vật nhai lại (trâu, bò, cừu...) bị nhiễm sán lá gan là mãn tính. Khi bị nhiễm, chúng ít khi có triệu chứng sốt mà biểu hiện chủ yếu là sút cân, gầy yếu. Thông thường, động vật mắc bệnh này ở giai đoạn di hành của ấu trùng sán lá gan lớn thường kéo theo các vi khuẩn hiếm khí dẫn đến nguy cơ tử vong cao.Bệnh sán gan lớn gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng do làm tổn thương gan và giảm năng suất thịt, sữa.2. Kỹ thuật PCRPCR (Polymerase chain reaction) là phản ứng nhân bản trình tự DNA quan tâm trong test tube.Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt, lập lại khoảng 30 – 50 chu kỳ. Phản ứng PCR gồm ba chu kỳ như hình 5 với các thành phần phản ứng như sau:Taq polymerasedNTPPrimerDNA mẫuBufferKết quả phản ứng được đọc qua bảng điện di được nhuộm với Ethidium bromide.Hình 5: Các giai đoạn của phản ứng PCR3. Kỹ thuật điện di trên gel agarose- Là kĩ thuật phân tích các phân tử DNA, RNA hay potein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện (isoelectric point).- Thành phần chính	+ Dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều	+ Bản gel agarose đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử	+ Các chất nhuộm (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di.- Điện di trên gel là phương pháp hữu dụng trong các phân tích sinh hoá học Hình: gelAgarose:- Cấu tạo mạng lưới cấu trúc ba chiều, cầu nối hydrogen giữa các thành phần.- Có kích thước lỗ gel lớn thích hợp cho phân tách các phân tử có kích thước lớn và điện di dựa trên độ tích điện.- Dùng để phân tách các protein > 500 kDa và các DNA có kích thước > 2000 bp.Một số thiết bị điện diKỹ thuật RAPD-PCRLà kỹ thuật PCR sử dụng những pimer ngắn khoảng 10 cặp nucleotide đã biết trước trình tự khuếch đại DNA một ngẫu nhiên.Nguyên tắc: sự khác biệt sản phẩm PCR phát hiện qua điện di cá thể khác nhau.Quy trình thực hiện RAPD-PCR- Ly trích DNA- Lựa chọn primer- Thực hiện phản ứng PCR- Chọn các primer khuếch đại ổn định nhất- Điện di trên gel agarose- So sánh kết quả giữa các mẫuPhản ứng RAPD-PCRKết quả điện diIII. Vật liệu và phương phápPhân lập sán lá gan- Sán lá gan thu nhận từ gan bò và cừu, rửa nhiều lần với phosphate-buffered saline (PBS) pH 7,4- Ủ trong hệ đệm tương tự ở 37 ° C trong 3 giờ- Rửa lại nhiều lần với PBSChiết tách DNA Mẫu ký sinh trùng được đồng nhất trong một dung dịch phân giải (8% triton 100X, 0,25 M Sucroza, 50 mm EDTA, pH 7,4).Dung dịch đồng nhất được ly tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút, ở 4°C.DNA bộ gen được tách ra bởi SDS-proteinase KTách bởi phenol chloroform.DNA phục hồi được hòa tan trong 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,6 (Tris-EDTA đệm)RNA được loại bỏ bằng cách ủ với RNAse ở 37 ° C trong 1hKết tủa lần thứ hai bởi phenol cloroform và ethanol.Dịch huyền phù được bảo quản ở -20°C.Lựa chọn mồiĐể tối ưu hóa các điều kiện PCR, ba mồi (5'-TCG TCG CATT -3 '(OSA09), 5'-AGC AGC AGGC -3' (OSA 10) và 5'-GGG TAA CGCC -3 '(OSA 11 )) đã được lựa chọn ngẫu nhiên để khuyếch đại DNA của Fasciola hepatica có nguồn gốc ở bò và cừu. Phản ứng PCR- Phản ứng được thực hiện trong một thể tích 50 μL chứa10X dung dịch đệm (500 mM KCI, 200 mM Tris-HCl pH 8,4)2,0 mM MgCI20,4 μm dNTPs (Promega, Hoa Kỳ).Mỗi ống phản ứng có 2 đơn vị của Taq polymerase.- DNA được khuếch đại trong 75 chu kỳ với một bước biến tính ở 94oC trong 5 giây, mồi bắt cặp lúc 36 ° C trong 30 giây, và bước kéo dài ở 720C trong 10 giây.Điện di sản phẩm PCRĐiện di trên gel agarose1,4% gel agarose được nhuộm màu với bromua ethidium.Kết quảKết luận3 mồi ngẫu nhiên đã cho các đoạn DNA có kích thước khác nhau theo nguồn gốc các loài trên ký chủ khác nhau.Phân biệt những đoạn đặc trưng cho F. hepatica có nguồn gốc từ bò và cừu.Với primer OSA-09, khuếch đại một đoạn DNA dài 150 bp thu được từ F. hepatica trên cừu. Đoạn DNA độ dài 700 bp đã được xác định từ F. hepatica trên bò.Các kết quả này tương đồng với báo cáo trước đó. Từ đó kết luận rằng RAPD-PCR kỹ thuật có thể chứg minh về mối quan hệ di truyền giữa Fasciola hepatica có nguồn gốc và cừu và cũng để xác định cụ thể các loài giun sán ký sinh. Tài liệu tham khảo