Tiểu luận Cây sinh dòng virus lở mồn long móng serotype A

g 15 phút 
theo sau bởi 35 chu kỳ theo chu trình: biến tính tại 94oC trong 1 phút, bắt cặp tại 55oC 
trong 1 phút, kéo dài tại 72oC trong 1.5 phút. Chu kì cuối cùng kéo dài tại 72oC trong 10 
phút. Sau đó sản phẩm PCR đem điện gi và quan sát dưới tia UV. 
Trước khi giải trình tự sản phẩm PCR được tinh sạch bằng QIAquick 
kit(QIAGEN). Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch đem đi giải trình tự với fmol Cycle 
Sequencing kit(promega) và primer Cy5 đã được đánh dấu (antisense 5’-
GAAGGGCCCAGGGTTGGACTC). Trong một vài trường hợp, một primer đánh dấu 
được thêm vào (pA-1C612,TAGCGCCGGCAAAGACTTTGA) được sử dụng để hoàn 
thành việc giải trình tự gen 1D. Việc giải trình tự được thực hiện trên hệ thống phân tích 
ALFexpress II DNA (pharmacia) 
 3.2.4. Phân tích dữ liệu sau khi giải trình tự 
Các trình tự phân tử được so sánh dựa trên phần mềm Clustal W sẵn có trong 
chương trình OMIGATM (Oxford MolecularLtd,England) . Phân tích cây sinh dòng được 
thực hiện bằng phần mềm PHYLIP version 3.5c . Trong quá trình phân tích khoảng cách 
tiến hóa cũng được tính toán bằng phần mềm DNADIST. Khoảng cách nền được sử dụng 
để tạo cây họ hàng bằng phần mềm NEIGHBOR. Cây cuối cùng được vẽ bằng TreeView 
1.5.2. Những cây địa hình được đánh giá bằng việc phân tích mối quan hệ từ 100 bản sao 
của dữ liệu gốc được thiết lập trong chương trình BOOTSTRAP, DNADIST, 
NEIGHBOUR và CONSENSE . O2/Brescia/1947 được kể đến trong phân tích như một 
loài xa lạ.Một sự so sánh độc lập khác của trình tự nucleotide và cấu trúc phía sau của 
cây UPGMA được thực hiện bằng chương trình “EpiSeq”( được viết bởi N.J. Knowles, 
Pirbright Laboratory,UK). Các phân tích được thực hiện trên chương trình DNASTAR 
(DNASTAR, Inc, Hoa Kỳ). Các trình tự được lấy từ GenBank / EMBL hoặc đã được 
công bố trước đó để so sánh (nhập số accession hoặc số tham khảo trong dấu ngoặc đơn) 
A10-Holland (M20715), A10-61 (X00429), A12-119b (J02187), IND 17/77 (AF 
204108),A5/Spain/86 (M72587), A5/Tubingen , A24/Pirbright , Iran/4/98 (trình tự cung 
cấp bởi Drs. N. J. Knowles and R. P. Kitching, IAH, Pirbright), A22/550 Azerbaijan/65 
(A22/Azerbaijan/65; X74812), A24/Cruzeiro/Brazil/55 (A24/Brazil/55; K03340), 
A27/Cundinmarca/Colombia/76 (A27/Colombia/76; K03341), Argentina/79 (K03345), 
81/Castellanos/Argentina/87 (Argentina/87; U62255), Madrid (E)/1983 (Madrid/83; 
M16084), Modena (I)/1984 (Modena/84; M16082), Morocco (MA)/1983 (Morocco/83; 
M16090), Venceslau/Brazil/76 (Brazil/76; K03344), 4 chủng Trung Quốc (NM/EL/60, 
NM/ XZ/64, XJ/KT/58, GS/LX/62; AJ131663, AJ131664, AJ131665, AJ131666), 
A22/Iraq 24/64 , Albania/1996 (Albania/96), Iran/1987, SaudiArabia/1992 
(SAU/92),A22/Thailand/1993 (Thailand/93), Thailand/1996 (Thailand/96), 
Bilbao/Spain/1973 (Spain/73), A1/Bavaria/ 1946 (A1/Bavaria/46), A7(5)/Greece/1954 
(A7/Greece/54) , BAN/2/87, Iran/2/97, Iran/ 17/97, MAL/10/97, Turkey/1992 
(Turkey/92), Turkey/96 , A5/Westerwald and A32/Venezuela/70 . 
13 
PHẦN IV:KẾT QUẢ 
4.1. Sự phân nhóm kiểu gen của virus 
Một phần của chuỗi trình tự không thể cung cấp một cách đầy đủ những thông tin 
trong cây phát sinh loài cho sự phân loại có ý nghĩa của virus. Nhiều nhà nghiên cứu đã 
đề xuất rằng phải biết ít nhất trình tự 250 nu, nếu không biết trình tự đầy đủ của gen 1D, 
để suy xét trong việc phân loại dịch tễ phân tử của FMDV. Theo những đề xuất trên, 
chúng tôi đã phân tích hoàn toàn trình tự gen 1D của 83 chủng virus phân lậ từ Ấn Độ 
bao gồm cả 3 chủng vacxin (IND 17/77, IND 490/97 and A10-IVS) và 37 trình tự sẵn có 
trong những dữ kiệu đã được công bố trước đó để xác định sự khác nhau phổ biến giữa 
những kiểu genotype. Ở đây chúng tôi đã xác định các kiểu gen khi một nhóm được phân 
lập với độ biến động ít hơn 15%. Những tiêu chí tương tự đã được sử dụng bởi các tác giả 
khác để phân loại kiểu gen FMDV sử dụng một phần trình tự. Trong cây UPGMA (hình 
1), được xây dựng từ trình tự gen 1D, các chủng FMDV được phân thành 10 kiểu gen 
chính(đánh số thự tự theo thời gian phân lập) 
14 
Hình 1: Cây UPGMA xây dựng từ trình tự gen 1D, biểu thị mối quan hệ di truyền của các chủng 
FMDV serotype A. Genotype (kiểu gen) được đánh dấu từ I-X ( theo thứ tự thời gian phân lập) 
được hiển thị trong các nhánh 
15 
4.2.Các Genotype trong cây sinh dòng 
4.2.1.Genotype I 
Kiểu gen này đại diện cho 16 chủng được phân lập trong khoảng 5 thập kỉ (1942-
1986), bao gồm các virus từ Columbia,Greece, India, Italy,Morocco,Netherlands và 
Spain. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lưu ý đến những kiểu gen lâu đời nhất của 
FMDV serotype A. 4 chủng được phân lập bao gồm cả A10-IVS được đưa vào nhóm 
này. Độ biến động giữa 2 chủng A10-IVS và A10-Holland là khoảng 1,3%. Những bằng 
chứng này cho thấy 3 chủng phân lập thì có mối quan hệ gần với A10-IVS( độ biến 
động 1.8-2.2%) để chỉ ra rằng có sự biến đổi chủng virus từ các chủng vacxin là có thể 
xảy ra.. Những virus thuộc genotype này được phân lập ở Ấn Độ từ 1984-1986 và không 
tìm thấy chúng nữa sau năm 1986. Armstrong và các cộng sự đã tường thuật mối quan hệ 
gần gũi cuộc các dòng virus Ấn Độ trong quá trình phục hồi suốt năm 1986 với A10-
Holland/42 bằng việc sử dụng kháng thể đơn dòng 
4.2.2.Genotype II 
Kiểu gen II có chứa nhugn74 chủng từ Argentina, Brazil, United Kingdom và 
Venezuela được phân lập trong thời gian 1954-1979 
4.2.3.Genotype III 
Kiểu gen này đại diện cho bốn chủng trên lợn được phục hồi từ Trung Quốc suốt 
thời gian 1958-1964. Sự biến động giữa chúng từ 2,4-9,5%. Kiểu gen này đại diện cho 
những chủng được phân lập từ vùng mà được báo cáo là có virus type O 
4.2.4.Genotype IV 
Các chủng từ Bangladesh, India, Iraq và USSR được phân lập từ 1964-1989 được 
gộp lại trong genotype này chỉ sự phổ biến và sự lan trải trên một vùng địa lý rộng lớn . 
Chủng A22 Irag 24/64, được phân lập năm 1964, là chủng lâu đời nhất được phân lập 
trong nhóm này với sự biến động 15,1-16,4% với những chủng Indian trong cùng 
genotype. Điều quan trọng cần lưu ý là các chủng này được phân lập trước năm 1990 và 
dường như không còn tồn tại ở Ấn Độ. 
 4.2.5.Genotype V 
Những chủng thuộc kểu gen này đến từ Châu Âu (Spain/73) và Nam Mỹ 
(Argentina/87) và được phân lập trong suốt 15 năm 
4.2.6.Genotype VI 
Kiểu gen này gồm 25 chủng được phân lập bao gồm 1 chủng vacxin IND 490/97 
được phân lập năm 1982 và hầu hết là từ gia súc, có hai chủng phân lập từ trâu và 1 
chủng phân lập từ bò. Sự biến động giữa các chủng trong nhóm khoảng từ 0,2-12,8 % . 
Chủng vacxin IND 490/97 được ước tính với sự biến động 6,8-12,1% nu so với những 
chủng còn lại trong nhóm này. 
16 
4.2.7.Genotype VII 
Kiểu gen VII chứa 49 chủng bao gồm một chủng phân lập từ Albania 
(Albania/96), tỷ lệ biến động 2.8-14,7% so với những chủng phân lập ở Ấn Độ.Hầu hết 
những chủng được phân lập trên gia súc và 2 chủng được phân lập trên trâu (IND 
39/2000 và IND 81/2000). IND 21/90 phân lập vào năm 1989 từ Assam là chủng lâu đời 
nhất trong genotype này 
4.2.8.Genotype VIII 
Các virus thuộc kiểu gen này được tìm thấy ở Iran, SaudiArabia, và Thổ Nhĩ Kì. 
Hai chủng được phân lập gần đây cho thấy tỷ lệ biến động xấp xỉ 1,8% trái lại Iran/87 là 
chủng được phân lập lâu nhất trong nhóm này cho thấy tỷ lệ biến động tối đa 8,8-12,4 % 
so với những chủng còn lại trong nhóm này 
4.2.9.Genotype IX 
Kiểu gen này bao gồm 1 chủng từ Malaysia và 2 chủng có quan hệ gần nhau ( độ 
tin cậy 96,7%) được phân lập từ năm 1993 đấn 1997. Sự khác biệt giửa các nu có thể 
thấy trong nhóm 
 4.2.10.Genotype X 
Kiểu gen này chỉ tìm thấy ở Iran, bao gồm 3 chủng được phân lập trong thời gian 
2 năm (1997 và 1998). Tỷ lệ biến động tối đa khoảng 1,8% được so sánh giữa Iran/4/98 
và Iran/17/97. Chúng biến động gần 19% so với những chủng phân lập khác cũng ở Iran 
trong Genotype VIII. Kiểu gen này chia một nhánh với kiểu gen VII, cho thấy sự hiện 
diện của cùng một tổ tiên chung giữa 2 kiểu gen này. 
4.3. PHÂN TÍCH SỰ PHÁT SINH LOÀI TRÊN GEN 1D 
Để phân tích mối quan hệ tiến hóa giữa những chủng FMDV phân lập được, một 
cây quan hệ đã được xây dựng dựa trên trình tự gen 1D (hình 2). Trong cây này, những 
dòng Châu Âu và Nam Mỹ ( bao gồm dòng Indian A10) tạo thành một cụm so với các 
dòng Châu Á. Đây là một điều thú vị , hầu hết các chủng trong mỗi cụm thì được chia 
thành các dòng khác nhau theo kiểu tương tự như trong cây UPGMA, và được phân về 
địa lý. Mặc dù các chủng được phân lập trong kiểu gen IV hình thành một nhóm phân 
biệt trong cây UPGMA. Chúng không tạo thành một cụm đơn trong cây quan hệ và được 
rải rác hầu hết ở các chủng khác trong cây quan hệ. Ý nghĩa của mỗi dòng được hỗ trợ 
bởi giá trị bootstrap trên 50% (trong số 100 bản sao). Các cụm Châu Âu và Nam Mỹ 
được chia thành 3 dòng với tỷ lệ bootstrap tin cậy khoảng 54-69%. Trong cụm Châu Á, 
những virus được phân lập gần đây từ Ấn Độ hình thành 2 dòng riêng biệt (kiểu gen VII 
và VII) với giá trị bootstrap khoảng 57-99% và có vị trí xa nhau trong cây quan hệ. Trong 
cây quan hệ, chủng Ấn Độ IND 2/93, được nhóm chung với kiểu gen Iran (kiểu gen 
X).Mặc dù việc hình thành nhóm được chứng minh bởi giá trị bootstrap thấp (31%) 
nhưng cũng không thể loại trừ khả năng IND 2/93 có thể là tổ tiên của dòng Iran. Điều 
này là có thể khi so sánh những trình tự amino acid của nhóm này với dòng Ấn Độ. 
17 
Những kiểu gen châu Á còn lại( III, VIII và IX) hình thành những dòng xác định trong 
cây với giá trị bootstrap trên 99% 
4.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA VÙNG VP1 
Để phân tích các cơ sở phân tử cho thấy sự biến động di truyền trong những chủng 
phân lập ở Ấn Độ, trình tự amino acid của gen 1D cũng được so sánh (hình 3). Một số tài 
liêu cho thấy rằng vị trí kháng nguyên trong FMDV serotype A tại vị trí vòng lặp G-H (từ 
138 đến 154), và gần các vị trí 83,168 và 173 của protein VP1. Trong vòng lặp G-H, 
RGD tripeptide tại vị trí VP1 144-146 và 2 acid amim Leucine(L) tại vị trí 147 và 150 là 
được bảo toàn một cách đầy đủ trên các chủng đã được phân lập tại Ấn Độ . Tuy nhiên,sự 
thay thế thường xuyên các amino acid cũng được quan sát trên những vùng lân cận( VP1 
139,140,141,142,149,153). Đây là khu vực quan trọng vì có thể tìm được miễn dịch trội 
của FMDV A22.. Vòng lặp B-C (VP1 40-60) chứa một vị trí kháng nguyên quan trọng 
của FMDV serotype O và C, trái lại không có báo cáo nào về kháng nguyên thuộc vùng 
này trên FMDV seotype A. Từ những báo cáo so sánh, vị trí VP1 42-48 thí quan trọng 
trong việc xác định kháng nguyên của những chủng virus có trình tự amino acid thay đổi 
một cách thường xuyên. Trong genotype VI và IV( ngoại trừ chủng được phân lập trên 
voi, IND 61/88), tất cả những chủng được phân lập có trình tự RRGD tại ví trí VP1 143-
146, trong khi hầu hết các chủng phân lập trong genotype VII (ngoại trừ IND 2/93, IND 
96/96 và IND 104/2000),có TRGD tại cùng một vị trí. Một vị trí kháng nguyên nhỏ đã 
được xác định rõ đặc điểm tại VP1 169 (tương ứng với 168 ở FMDV A22) trên virus 
A10-Holland. Trong genotype IV và VI (ngoài trừ IND 170/88) hầu hết các chủng phân 
lập đều có Arginine(R) , trong khi đó ở genotype VII (ngoại trừ IND 21/90 và IND 
2/93), Lysine (K) được tìm thấy tại vị trí VP1 168. Vị trí VP1 173 cũng có vai trò quan 
trọng trong việc xác định điểm kháng nguyên, và một số amino acid thay thế được tìm 
thấy trên những chủng được phân lập, Hai aminoacid thay thế tại VP1 109 (K→R) và 
213 (L→Q) thì đặc trưng cho một chùng phân lập trên voi (IND 61/88) trong genotype 
IV. Có 24 loại amino acid khac nhau trong đó có 15 loại nằm gần hay ngay tại vùng 
kháng nguyên gữa 2 chủng vacxin được sử dụng gần đâylà IND 490/97 và IND 17/77. 
Việc thay thế các amino acid được xem xét trong vùng kháng nguyên của những chủng 
khác nhau được mong đợi là sẽ ảnh hưởng tới tính kháng nguyên của protein VP1. Trong 
genotype I, cả 3 chủng có mối quan hệ thân thuộc với chủng vacxin A10-IVS thì khác 
nhau tối đa 6 amino acid. Trong tất cả các chủng đã phân lập, bao gồm A10-IVS thiếu 
mất 1 codon tại vị trí VP1 142 khi so sánh vói A10-Holland 
18 
Hình 2: Cây sinh dòng của FMDV serotype A suy ra bằng phương pháp neighbor-joining. Giá trị 
bootstrap tin cậy của những dòng chính đã được chỉ định (giá trị trên 50% trong số 100 bản sao). 
Những kí hiệu genotype ,được xác định trong cây UPGMA (hình 1) đã được chỉ định. Chiều dài của 
nhánh đã giảm đến 50% để tiết kiệm không gian. Tỷ lệ của các thanh đại diện cho khoảng cách di 
truyền 
19 
PHẦN V : KẾT LUẬN 
5.1.KẾT LUẬN 
Ở đây chúng tôi chỉ tiến hành phân tích di truyền hoàn toàn trình tự vùng trình tự 
vùng 1D(639 nu) của 82 chủng FMDV serotype A được phân lập , bao gồm 3 chủng 
vaccine (A10-IVS, IND 17/77 và IND 490/97) được khôi phục ở Ấn Độ trong thời gian 
1977- 2000. Để nghiên cứu những biến đổi phân tử có liên quan đến đa dạng di truyền 
trên một số chủng phân lập, chúng tôi đã giải trình tự và so sánh hoàn toàn gen 1D và suy 
ra trình tự amino acid. Tiến hành xây dựng cây sinh dòng của 82 chủng virus serotype A. 
 Những báo cáo so sánh đã chỉ ra rằng những thay thế tại các vị trí 83, 139, 140, 
141,149,153 và 173 trên VP1 và những phần còn lại được xác định là quan trọng bởi 
những đột biến trung hòa của FMDV serotype A.Những kết quả được miêu tả trong bài 
báo cáo này chỉ ra sự liên quan của vòng lặp B-C VP1 trên các kháng nguyên của FMDV 
serotype A. Từ những vùng này phần quan trọng của kháng nguyên, những thay thế tại 
những vị trí này trên protein VP1 được tin rằng có vai trò giúp đỡ virus thoát khỏi những 
miễn dịch xuất hiện lúc đầu trên thú 
Những chủng FMDV serotype A từ các phần khác nhau trên trên thế giới có thể 
được chia ra làm thành 10 genotype phân biệt trong cây UPGMA, mỗi nhánh đại diện 
cho một vùng địa lí. Những genotype này,ngoại trừ genotype IV, hình thành từ những 
nhánh khác nhau trong cây quan hệ với độ tin cậy bootstrap cao. Các chủng trong 
genotype IV thì trộn lẫn với genotype khác trong cây. 
5.2.ĐỀ NGHỊ 
Tiếp tục tiến hành phân tích các chủng FMDV serotype A , xây dựng cây sinh 
dòng của các chủng FMDV serotype A được phân lập từ năm 2000 đến nay. 
Tiến hành phân tích xây dựng cây sinh dòng FMDV các serotype còn lại, đặc biệt 
là FMDV serotype O và Asia-1 là những serotype phổ biến ở Việt Nam 
20 
PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1.Công nghệ sinh học trong thú y – Nguyễn Ngọc Hải – Nhà xuất bản Nông Nghiệp 
2.Ngành chăn nuôi Việt Nam trong xu thế hội nhập - Hoàng Kim Giao – Cục chăn nuôi 
3. Genetic analysis of foot-and-mouth disease virus serotype A of Indian origin and 
detection of positive selection and recombination in leader protease- and capsid-coding 
regions - S B NAGENDRAKUMAR, M MADHANMOHAN, P N RANGARAJAN and 
V A SRINIVASAN - November 19, 2001 
4. Phylogenetic analysis of serotype A foot-and-mouth disease virus isolated in India 
between 1977 and 2000 - C.Tosh, A.Sanyal, D.Hemadri, and R.Venkataramanan 
5.  
MỘT SỐ PHỤ LỤC 
Danh sách các chủng virus sử dụng trong bài báo cáo 
Danh sách các chủng virus sử dụng trong bài báo cáo (tiếp theo) 
Bảng so sánh trình tự các amino acid giữa các chủng 
MỤC LỤC 
PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................... 2 
PHẦN II:TỔNG QUAN.................................................................................................... 2 
2.1.Bệnh lở mồm long móng.......................................................................................... 2 
2.1.1. Nguyên nhân: .................................................................................................... 2 
2.1.2 Sức đề kháng của virus...................................................................................... 2 
2.1.3. Phương thức truyền lây.................................................................................... 2 
2.1.4. Triệu chứng ....................................................................................................... 2 
2.1.5. Bệnh tích ............................................................................................................ 3 
2.1.6. Phòng bệnh ........................................................................................................ 4 
2.2.CẤU TRÚC GENOME CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG (FMDV) ....... 6 
2.3.RT-PCR..................................................................................................................... 7 
2.4. PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ ...................................................................... 8 
2.4.1.Nguyên tắc hóa học : Phương pháp Maxam và Gilbert................................. 9 
2.4.2. Phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các 
dideoxynucleotide của Sanger. .................................................................................. 9 
2.4.3.Giải trình tự bằng máy đọc tự động............................................................... 10 
PHẦN III:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................................ 10 
3.1.Vật liệu .................................................................................................................... 10 
3.2.Phương pháp........................................................................................................... 10 
3.2.1. Nuôi virus-và thu hoạch tế bào...................................................................... 11 
3.2.2.Li trích RNA tổng số........................................................................................ 11 
3.2.3. Chạy RT-PCR và giải trình tự ...................................................................... 11 
3.2.4. Phân tích dữ liệu sau khi giải trình tự .......................................................... 12 
PHẦN IV:KẾT QUẢ....................................................................................................... 13 
4.1. Sự phân nhóm kiểu gen của virus........................................................................ 13 
4.2.Các Genotype trong cây sinh dòng....................................................................... 15 
4.2.1.Genotype I ........................................................................................................ 15 
4.2.2.Genotype II....................................................................................................... 15 
4.2.3.Genotype III ..................................................................................................... 15 
4.2.4.Genotype IV...................................................................................................... 15 
4.2.5.Genotype V ....................................................................................................... 15 
4.2.6.Genotype VI...................................................................................................... 15 
4.2.7.Genotype VII .................................................................................................... 16 
4.2.8.Genotype VIII .................................................................................................. 16 
4.2.9.Genotype IX...................................................................................................... 16 
4.2.10.Genotype X ..................................................................................................... 16 
4.3. PHÂN TÍCH SỰ PHÁT SINH LOÀI TRÊN GEN 1D...................................... 16 
4.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA VÙNG VP1................................. 17 
PHẦN V : KẾT LUẬN................................................................................................... 19 
5.1.KẾT LUẬN ............................................................................................................. 19 
5.2.ĐỀ NGHỊ................................................................................................................. 19 
PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................