Chẩn đoán virus cúm gia cầm ( avian influenza hoặc bird flu) bằng kỹ thuật gen - Nguyễn Thị Phưởng

CHẨN ĐOÁN VIRUS CÚM GIA CẦM ( AVIAN INFLUENZA HOẶC BIRD FLU) BẰNG KỸ THUẬT GENngười thực hiện: Nguyễn Thị PhưởngLớp: DH06SHMSSV: 06126114 I.Đặt vấn đềVirus cúm là thành viên chính của họ orthomyxoviridae và là căn nguyên gây bệnh cúm. Bệnh cúm là một nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính tạo thành dịch do virus Virus cúm đã gây nhiều vụ dịch lớn trên thế giới với tỉ lệ tử vong cao. Có 3 týp vi rút cúm là A, B và C, trong đó vi rút cúm A hay gây đại dịch.Bệnh cúm gia cầm đã bùng phát trở lại ở một số địa phương nước ta. Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất hiện nay đối với ngành chăn nuôi, bệnh diễn biến phức tạp, thường ở thể quá cấp và cấp tính gây chết nhanh chóng, hàng loạt khi nhiễm phải, làm thiệt hại lớn cho người chăn nuôi. Việc xác định các bệnh nhân đang nằm viện bị H5N1 là khó khăn, nhất là khi không biết được mối liên hệ dịch tễ và khi có các triệu chứng không đặc hiệu. trong những năm gần đây, nhờ sự phát triển của công nghệ gen và công nghệ sinh hoc...nhiều phương pháp chẩn đoán mới đã được xây dựng, áp dụng trong chẩn đoán virus, cho phép xác định kết quả nhanh. những phương pháp mới này có ưu điểm là nhanh,đơn giản, nhạy, chính xác và chi phí thấp...II.NỘI DUNGII. Virus cúm gia cầm 1.Giới thiệu về virus cúm gia cầm Cúm gà hay Cúm gia cầm là một loại bệnh truyền nhiễm gây ra bởi các virus thường chỉ gây bệnh cho gia cầm ( gồm cả chim) và có thể xâm nhiễm một số loài có vú. Tuy nhiên, các virus cúm gia cầm cũng có thể gây bệnh cho người, thậm chí gây tử vong. Virus H5N1 là một loại virus cúm gia cầm đặc biệt, mà gần đây đã lan truyền rộng rãi ở nhiều quốc gia. Virus này được phát hiện lần đầu tiên là tại Ý vào thập niên 1900 và giờ đây phát hiện ở hầu hết các nơi trên thế giới Virus cúm có tên khoa học là avian influenza (AI) thuộc nhóm virus cúm A của họ Orthomyxociridae đây là những retrovirus, mang vật liệu di truyền là những đoạn phân tử RNA, sợi đối mã (sợi âm tính).TÌNH HÌNH BỆNH DO VIRUS CÚM GIA CẦM H5N1 Ở NGƯỜI2.Những đại dịch cúm trong lịch sử loài người 3. Cấu tạo của virus cúm A Dưới kính hiển vi điện tử,. Virus cúm hình cầu, Đường kính khoảng 100-120nm. Các hạt virus cúm có cấu trúc phức tạp. Các protein capsid virut cúm, cùng với ARN, tạo thành nucleocapsid đối xứng xoắn. Vỏ của virus cúm được cấu tạo bởi hai lớp lipid, trên bề mặt hai lớp lipid đó có những vị trí trồi lên giống như những gai. Các gai này cấu tạo bởi glycoprotein và có hai loại hemaglutinin và neuraminidase ký hiệu là H và N. Mỗi cấu trúc H và N dài 8-10nm, cách nhau 8nm. Hemaglutinin có chức năng giúp virus bám vào các receptor trên bề mặt tế bào cảm thụ và đó là yếu tố quyết định kháng nguyên rất quan trọng trong sản xuất vacxin. Chức năng của neuraminidase chưa được hiểu rõ hoàn toàn, nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy chúng bổ sung cho chức năng của hemaglutinin, thúc đẩy sự lắp ráp và giải phóng của virus từ tế bào cảm thụ. Hai cấu trúc glycoprotein H và N xác định kháng nguyên đặc hiệu của từng týp virus.Như các loại cúm gia cầm khác, H5N1 có những dòng "độc lực cao" (HP)  và "độc lực thấp" (LP). Virus HPAI có độc tính rất cao và tỷ lệ gây chết trong bầy gia cầm bị nhiễm thường gần 100%. Virus LPAI (Virus cúm gia cầm độc lực thấp) có độ độc không đáng kể, nhưng những virus này có thể cung cấp nguyên bản cho dòng virus độc lực cao. Dòng H5N1 hiện tại là nguyên nhân gây chết ở các loài chim trên khắp thế giới là một dòng HPAI; các dòng hiện tại khác của H5N1, bao gồm cả dòng Bắc Mỹ  không gây bệnh ở bất kỳ loài nào, là những dòng LPAI. Tất cả các dòng HPAI được xác định đến giờ đều có liên quan đến phân nhóm H5 và H7. Điều khác biệt là sự phát sinh bệnh liên quan đến các loài gia cầm chứ không phải con người. Thông thường một loài virus cúm gia cầm độc lực cao thì không gây bệnh nặng trên cả người và những loài không phải gia cầm. Dòng H5N1 chết người hiện tại lại có dấu hiệu gây chết bất thường cho nhiều loài, bao gồm cả những loài như mèo nhà, vốn chưa từng mắc bệnh cúm với bất cứ loại virus cúm nào trước đây 4.Cấu trúc di truyền và các typ liên quanKí tự N trong H5N1 là viết tắt của “"Neuraminidase",H5N1 là phân nhóm của loài virus cúm A thuộc Chi “Influenzavirus” A trong họ Orthomyxoviridae Giống như các phân nhóm cúm A khác, phân nhóm H5N1 là một virus RNA, nó có 8 đoạn gen mạch RNA dương viết tắt là PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, MP và NS 5.Các tính chất của virus Sức đề kháng với các tác nhân lý hóa học: - Hạt virus bị phá hủy bởi ether và deoxycholate natri do nó có 20-30% lipid. - Ph thích hợp nhất là 6,5 – 7,9 - Virus chiệu nhiệt kém: ở 56oC – 60oC tính xâm nhiễm bị phá hủy trong một vài phút, nhưng hoạt tính ngưng kết hồng cầu vẫn được duy trì.Virus cúm có thể sống và truyền bệnhBản chất của virus cúm là lipoprotein nên có sức đề kháng yếu và dễ bị mất hoạt bởi bức xạ mặt trời mặt trời có chứa tia tử ngoại , bởi nhiệt độ trên 56oC (trong vòng vài chục phút) và bởi các chất dung môi hòa tan lipid, chất khử trùng như formaldehyde, chloramin, cồntuy nhiên, virus cúm thường lẫn trong dịch xuất tiết của đường hô hấp và được bao bọc trong màng nhầy của chất này nên có thể sống lâu hơn ở môi trường bên ngoài, nhất là trong mùa lanh.Trong điều kiện này, nó có thể duy trì hoạt lực ở môi trường nhiều giờ hoặc 1-2 ngày. Với virus H5N1, có thể là đã thích ứng cao trên các loài chim hoang dã nên khả năng tồn tại ở môi trường có thể cao hơn:trong phân gia cầm tới hàng tháng, trong sản phẩm gia cầm bảo quản lạnh tới hàng năm. Chúng chỉ bị diệt ở 70oC trong 30 phút, hoặc ở môi trường acid, kiềm sau nhiều giờ.6. khả năng gây bệnh của virusVirus cúm type A,B,C là tác nhân gây bệnh cúm ở người với những đặc điểm rất đặc biệt như: tính cảm thụ cao, thời gian ủ bệnh rất ngắn từ 1-2 ngày, bệnh diễn tiến nhanh chóng, gây ra một sức miễn dịch cao nhưung không lâu bền, lây truyền trực tiếp qua đường hô hấp. đó là những nguyên nhân làm cho bệnh cúm dễ lan tràn thành các vụ dịch lớn.a.sự lan truyền của virus trong cơ thểSơ đồ cách thức vi-rút cúm A tấn công vào tế bào của người bệnh và tiếp tục sinh sôi nảy nở Vi-rút H5N1 nhìn dưới kính hiển vi điện tử b.hình ảnh lâm sàng Thường gặp là thể điển hình với các đặc điểm là: sau 1-2 ngày ủ bệnh xuất hiện sốt 38oC, rét run, sốt, đau khắp mình mẩy, suy nhược, tổn thương bộ máy hô hấp,khó thở, tím tái,cảm giác hụt hơi,thiếu hơi,giảm độ bão hòa oxi máu, tiêu chảy, phân nước, nhiều lần, bệnh khởi phát nhanh nhưng mệt mỏi kéo dài. Ngoài ra có thể gặp thể nặng với các triệu chứng của bệnh phế quản: phế viêm do virus hoặc nhiễm các vỉ khuẩn tụ cầu, liên cầu, phế cầu, Klebsiella pneumoniae thường gặp ở người già và trẻ nhỏ với tỷ lệ tử vong cao.c.dịch tễ học Tiếp xúc trực tiếp với gia cầm như gà, vịt, chim bị bệnh trong vòng 7 ngày trước đó hoặc sống ở vùng gia cầm bị bệnh hơcj có tiếp xúc với người bị bệnh cúm. Bệnh lây trực tiếp qua đường hô hấp, thường gây dịch lớn, nhất là type A. dịch cúm thường xảy ra vào mùa đông xuân: vì bệnh cúm là bệnh của đường hô hấp, vị trí đột nhập đầu tiên của virus cúm là các tế bào đường hô hấp. trong điều kiện lạnh và ẩm thấp, các tế bào hô hấp của người dễ bị tổn thương, tạo diều kiện tốt cho bệnh cúm phát triển. Sau khi nhiễm bệnh cúm sẽ có miễn dịch đặc hiệu type kéo dài từ 6 tháng đến 3 năm. các type H và N khác nhau của các virus cúm có thể gây bệnh cho người và nhiều động vật khác nhau. Một số thứ type thường gây bệnh ở người như H3N2, H1N1riêng thứ type H5N1 của virus cúm A là loại bệnh ở gia cầm nhưng hiện nay đã vượt qua rào cản giới hạn thụ thể đặc hiệu loài để gây nhiễm ở động vật có vú và cả người. từ năm 1997 đến nay, dịch cúm A (H5N1) xảy ra liên tiếp ở nhiều nước Châu Á đặc biệt là Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam, d.xét nghiệmX quang phổi: tổn thương là hình ảnh viêm phổi mô kẽ khu trú một bên, hoặc có hình ảnh tổn thương giống viêm phổi thùy,nhưng ranh giới không rõ, sau đó tiến triển nhanh lan tỏa sang hai bên. Cần chụp phổi nhiều lần(ít nhất 2 lần) trong ngày ở giai đoạn cấp.IV. Phương pháp chẩn đoán bệnh 1.các xét nghiệm chân đoánChẩn đoán chỉ dựa vào yếu tố dịch tể học, dấu hiệu lâm sàng và các dấu hiệu huyết học-sinh hóa vì độ nhạy của các test nhanh quá thấp. Các kỹ thuật để xác định chẩn đoán: xét nghiệm phân tử Phân lập virus Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang2.Để xét nghiệm phát hiện virus H5N1, cần lấy bệnh phẩm gì? Bệnh phẩm dùng cho xác định nhiễm H5N1 gồm: dịch hầu họng hoặc dịch phế quản; huyết thanh bệnh nhân trong giai đoạn cấp (huyết thanh 1), và giai đoạn hồi phục (huyết thanh 2, thu thập 10-15 ngày sau khi lấy huyết thanh 1). Những người thu thập bệnh phẩm là: Nhân viên phòng thí nghiệm đã được tập huấn về cách thu thập bệnh phẩm và phương pháp bảo hộ cá nhân; các bác sĩ lâm sàng (trong trường hợp bệnh nhân nặng cần hỗ trợ thở).3.quy trình xét nghiệm để chẩn đoán (tại bệnh viện Nhiệt Đới) Real time RT-PCR-Đích: M gene-Probe IA Taqman-Độ nhạy: 10 copies-Chứng nội tại (EAV)-Bản định lượng.RT-PCR đặc hiệu với: H5N1H3, N1Real time PCR-đặc hiệu với H5-Taqman độ nhạy 10 copiesVi trung hoàPhân lậpLoại trừ cúm Aphết họng và mũihuyết thanh 2 lầnA.xét nghiệm phân tử Có thể phát hiện RNA đặc hiệu cho H5N1 trong nhiều loại bệnh phẩm lâm sàng như máu, phân, chất tiết hô hấp hoặc các dịch cơ thể bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Một số cách thức tiến hành PCR do các thành viên của mạng lưới xét nghiệm WHO phát triển hiện sẵn cót trên website của WHO ( Hơn nữa, kit xét nghiệm RT-PCR 5’-nuclease chứa đoạn mồi và chứng dương tính và âm tính do Viện Bernhard Nocht ( et al.) phát triển hiện sẵn có trên thị trường ( Phân tích RT-PCR thường quy QUY TRÌNH RT-PCR thường quy 117Các quy trình và primơ dùng để thực hiện PCR và điện di thạch thường quy trên các sản phẩm để phát hiện virut cúm gia cầm A(H5N1) trong bệnh phẩm thu thập từ người được nêu dưới đây. Những quy trình này đã tỏ ra rất có hiệu quả để định loại các chủng 1, 2 và 3 của virut H5N1 khi được áp dụg với những thuốc thử và primơ được chỉ định. Các phòng thí nghiệm có quan tâm đến việc xác định những chủng đang lưu hành nên liên hệ với một trong số các thành viên của Uỷ ban chuyên gia về PCR trong Cúm gia cầm của TCYTTG (Phụ lục C) hoặc một trong số các Phòng thí nghiệm H5 chuẩn thức của TCYTTG để được hỗ trợ trong việc tìm ra primơ tốt nhất.Vật liệu cần có Bộ xét nghiệm nhỏ tìm RNA virut QIAamp® (QIAGEN® Cat#51104) Bộ xét nghiệm RT-PCR một bước (QIAGEN®, Cat#210212) Chất ức chế RNA 20U/μl (Hệ thống sinh học ứng dụng Cat# N808-0119) Nước không chứa RNA Ethanol (96–100%) Máy siêu ly tâm (điều chỉnh được, đến 13.000 vòng/phút) Pipét điều chỉnh được (10, 20, 200, 100 μl) Đầu pipét không chứa RNA vô khuẩn có màng khí Máy quay Ống nghiệm dùng cho máy siêu ly tâm (0,2 và 1,5ml） Điều chỉnh nhiệt độ Bộ primơ Chứng dương (có thể đặt từ một Phòng thí nghiệm H5 chuẩn thức của TCYTTG18) Primơ Gien :H5 Chủng :1, 2, 3 Chuỗi primơ :H5-1: GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC : H5-3: CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG kích cỡ mong đợi của sản phẩm 219 bp Nguồn tham khảo chỉnh sửa theo Juen và CS. 1998 Gen M Chủng 1, 2, 3 chuỗi primer M30F: TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG M264G2: ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG kích cỡ mong đợi của sản phẩm 234 bp nguồn tham khảo NIID19 Gen N1 Chủng chuỗi primer N1-1: TTG CTT GGT CGG CAA GTGC N1-2: CCA GTC CAC CCA TTT GGA TCC kích cỡ mong đợi của sản phẩm 616 bp nguòn tham khảo: Wright và CS. 1995Quy trình 1. Tách chiết RNA virut từ bệnh phẩm lâm sàng bằng Bộ xét nghiệm nhỏ tìm RNA virut QIAamp® hoặc bộ công cụ tách chiết tương đương theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 2. Thực hiện RT-PCR một bước. Đối với các gien H5 hoặc N1 a. Chuẩn bị hỗn hợp chính cho RT-PCR như sau:5x đệm QIAGEN® RT-PCR 10 μl hỗn hợp dNTP 2 μl 5x dung dịch Q 10 μl Primơ chuyển tiếp (5 μM) 6 μl Primơ đảo ngược (5 μM) 6 μl Hỗn hợp men 2 μl Chất ức chế RNA (20U/μl) 0,5 μl Nước (Độ phân tử) 9 μl Tổng cộng 45 μl b. Thêm 5μl RNA virut Đối với gien M a. Chuẩn bị hỗn hợp chính cho RT-PCR như sau: 5x đệm RT-PCR QIAGEN® 10μl Hỗn hợp dNTP 2 μl Primơ chuyển tiếp (5 μM) 6 μl Primơ đảo ngược (5 μM) 6 μl Hỗn hợp men 2μl Chất ức chế RNA (20U/μl) 0,5μl Nước (Độ phân tử) 19μl Tổng cộng 45μl b. Thêm 5 μl RNA virut 3. Điều kiện quay nhiệt PCR H5, N1 Sao chép ngược 30 phút 50°C Hoạt hoá PCR ban đầu 15 phút 95°C quay 3 bước làm biến chất 30 giây luyện 30 giây 55oC mở rộng 30 giây 72oC số vòng 40 mở rộng vòng cuối 2 phút 72oC M Sao chép ngược 30 phút 50°C Hoạt hoá PCR ban đầu 15 phút 95°C làm biến chất 30 giây luyện 30 giây 94oC mở rộng 30 giây 50oC số vòng 40 mở rộng vòng cuối 2 phút 72oC 4. Điện di thạch aga sản phẩm RT-PCR Chuẩn bị thạch aga, sản phẩm PCR và cân điện tử, và vận hành theo quy trình chuẩn thức. Theo dõi màn hình cân dưới ánh sáng tia cực tím. Ví dụ về quy trình được nêu dưới đây. QUY TRÌNH RT-PCR hiện thời 121 Tách chiết RNA virut từ bệnh phẩm lâm sàng theo cách mô tả trong Phần A.1.1. Phân tích RT-PCR thường quy đã nêu ở trên. Vật liệu cần có Sao chép ngược 10X đệm PCR I với 15 mM MgCl2 (Hệ thống sinh học ứng dụng) Hexamer ngẫu nhiên 50 μM (Hệ thống sinh học ứng dụng) Men sao chép ngược MuLV 50 U/μl (Hệ thống sinh học ứng dụng) Chất ức chế RNA 20 U/μl (Hệ thống sinh học ứng dụng). PCR hiện thời Bộ công cụ LightCycler ® – FastStart™ DNA Master HybProbes (Roche) Primơ và hỗn hợp thuốc thử: Thêm một lượng bằng nhau những thành phần sau để chuẩn bị primơ và hỗn hợp thuốc thử cho H5 và M. Primơ và thuốc thử Gen H5 chủng 1; 2; 3Chuỗi primơ : H5-266F: 5’- TGCCGGAATGGTCTTACATAGTG -3’ (5 μM) H5-1615F: 5’- GTGGCGAGCTCCCTAGCA -3’ (5 μM) H5-347R: 5’- TCTTCATAGTCATTGAAATCCCCTG -3 (5 μM) H5-1695R: 5’- TCTGCATTGTAACGACCCATTG -3’ (5 μM) H5-290P: 5’-(FAM)-AGAAGGCCAATCCAGTCAATGACCTCTGTTA- (TAMRA)-3’ (2,5 μM) H5-1634P: 5’-(FAM)-TGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGG-(TAMRA)-3’ (2,5 μM)Gien M Chủng 1, 2, 3 Chuỗi primơ FLUAM-1F: 5’AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-3’ (10 μM) FLUA-2F: 5’CATTGGGATCTTGCACTTGATATT-3 (10 μM) FLUAM-1R: 5’-CAA AGCGTCTACGCTGCAGTCC-3’ (10 μM) FLUAM-2R: 5’-AAACCGTATTTAAGGCGACGATAA-3’ (10 μM) FLUA-1P: 5’-(FAM) TTTGTGTTCACGCTCACCGT-(TAMRA)-3’ (5 μM) FLUA-2P: 5’-(FAM)-TGGATTCTTGATCGTCTTTTCTTCAAATGCA- (TAMRA)-3’ (5 μM) (1) Quay và ly tâm sơ bộ ống nghiệm có chứa hỗn hợp. (2) Đặt ống nghiệm ở nhiệt độ trong phòng trong 10 phút, sau đó ủ ở 42°C trong vòng ít nhất 15 phút. (3) Ủ ống nghiệm ở 95°C trong 5 phút, sau đó làm lạnh trong nước đá. Thực hiện PCR hiện thời (1) Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng “Khởi động nóng” bằng cách dùng pipét nhẹ nhàng bơm 60 μl Thuốc thử Hỗn hợp phản ứng LC-FastStart™ (lọ 1b) vào men LC-FastStart™ (lọ 1a). (2) Với mỗi bệnh phẩm xét nghiệm và các chứng dương và âm, chuẩn bị hỗn hợp thuốc thử với primơ và hỗn hợp thuốc thử B.Phân lập virusPhân lập virus bằng cách nuôi cấy là một kỹ thuật nhậy cảm với ưu điểm là sau đó sẽ có được loại virus này để định loại và tiếp tục mô tả các đặc điểm di truyền và kháng nguyên học, xét nghiệm tính nhậy cảm với thuốc, và chuẩn bị văcxin. Môi trường tốt nhất để virut cúm mọc bao gồm các tế bào MDCK hoặc trứng gà có phôi. Không giống như các chủng virut cúm A khác, cúm A(H5N1) cũng sẽ mọc trong những dòng tế bào chung khác như Hep-2 và RD. Để tăng trưởng, virut cúm A(H5N1) ở người không đòi hỏi phải có thêm tripxin ngoại sinh. Sau đó có thể tiến hành định loại và kiểu hình của virut cúm được nuôi cấy bằng các thử nghiệm PCR, miễn dịch huỳnh quang (IFA) sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu, hoặc ngưng kết ức chế hồng cầu (HA) và phân tích kháng nguyên (xác định kiểu phụ) bằng thử nghiệm ngăn ngưng kết ức chế hồng cầu (HI) có sử dụng các kháng nguyên tham chiếu chọn lọc. Chỉ nên nuôi cấy virut khi đảm bảo có cơ sở vật chất đạt mức độ BSL-3, và cần thực hiện các biện pháp phòng ngừa an toàn sinh học khi xử lý nuôi cấy tế bào có thể chứa cúm gia cầm có độc tính cao. Quy trình Cần tuân thủ các quy trình chuẩn thức nuôi cấy tế bào trong phòng thí nghiệm trong các khâu nhân giống nuôi cấy tế bào, tiêm bệnh phẩm, và gặt tế bào bị nhiễm để làm IFA hoặc nước nổi nuôi cấy cho xét nghiệm HA và HI (Lennette & Schmidt, 1995; WHO, 200224), RT-PCR, hoặc phân tích chuỗi. Cần tuân thủ các quy trình chuẩn thức về HA và HI, đảm bảo có đủ tất cả mọi chứng được khuyến cáo. Chi tiết cụ thể về những quy trình này được nêu trong tài liệu của TCYTTG về chẩn đoán và giám sát bệnh cúm ở động vật25. Diễn giải kết quả Độ pha loãng cao nhất của virut cho phép ngưng kết ức chế hồng cầu hoàn toàn là điểm kết thúc trong xác định hiệu giá HA. Độ pha loãng cuối cùng của kháng huyết thanh cho phép ngăn ngưng kết ức chế hồng cầu hoàn toàn là điểm kết thúc của HI. HIệu giá được biểu diễn ở dạng tỷ số của độ pha loãng cuối cùng. Định loại phân lập từ thực địa được tiến hành bằng cách so sánh kết quả của phân lập không rõ với các chứng kháng nguyên. Một phân lập được xác định là một chủng con đặc hiệu của virut cúm A nếu hiệu giá kháng thể HI đặc hiệu với chủng con của virut cúm A là 4 lần hoặc cao hơn so với hiệu giá thu được từ kháng huyết thanh khác. Ngưng kết tố không đặc hiệu có thể xuất hiện trong huyết thanh và dẫn đến các phản ứng giả âm tính; tương tự như vậy, một số phân lập có thể rất nhậy cảm với chất ức chế không đặc hiệu trong huyết thanh, dẫn đến các phản ứng giả dương tính. V. Kết luậnQuy trình RT-PCR, phân lập virus,thử nghiệm miên dịch huỳnh quang dụng đều cho phép phát hiện được RNA của virus cúm gia cầm. Trong đó phương pháp RT-PCR là cho kết quả tốt nhất lại nhanh chóng đơn giản tiết kiệm thời gian,chính xác và chi phí thấp.Tài liệu tham khảoKhuyến cáo và quy trình xét nghiệm để phát hiện virus cúm gia cầm A( H5N1) trong bệnh phẩm thu thập từ các ca nghi nhiễm bệnh ở người của “ World Health Oganization” Chẩn đoán và xử lý sớm bệnh do virus cúm A /H5N1) của Ts.Bs Trần TỊnh Hiền Nguyễn Ngoc Hải “công nghệ sinh học trong thú y” nhà xuất bản nông nghiệp www.vcn.vnn.vn