Đề tài Chẩn đoán virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome) bằng kỹ thuật Elisa

Đề tài:CHẨN ĐOÁN VIRUS PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) BẰNG KỸ THUẬT ELISA	Người thực hiện:	Giáo viên hướng dẫn:	Ham Mát	 Nguyễn Ngọc Hải Mssv: 0612607 Lớp: DH06SHNội dung:Đặt vấn đề.Giới thiệu về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, virus PRRS.Giới thiệu về kỹ thuật ELISA.Phương pháp chẩn đoán PRRS bằng kỹ thuật ELISA.Kết luận.Tài liệu tham khảo.I.Đặc vấn đề:Hiện nay trên cơ thể của gia súc đặc biệt là cơ thể của heo, một động vật gần gũi và mang lại lợi ích kinh tế cho người dân đã xuất hiện hội chưng rối loạn sinh sản và hô hấp. Đây là một hội chứng do một loại virus có tên là PRRS, và vấn đề được đặc ra ở đây là làm thế nào để chẩn đoán virus này có tồn tại hay không tồn tại trong cơ thể của heo? Một phương phương pháp được giới thiệu để chẩn đoán virus này đò là phương pháp ELISA II.Giới thiệu về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, virus PRRS.Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) là một bệnh do virus, gây thiệt hại lớn về kinh tế và được phát hiện tại Mỹ vào năm 1987. Bệnh do Nidovirales, họ Arteviridae gây ra. Các triệu chứng thường gặp của lợn mắc bệnh bao gồm rối loạn sinh sản, gây chết (đối với lợn con) và các biểu hiện rối loạn hô hấp đối với lợn ở mọi lứa tuổi. PPRS được xếp vào nhóm B trong danh mục các bệnh của Tổ chức sức khỏe động vật thế giới. Cho đến nay, lợn là động vật duy nhất mắc hội chứng này Các đại thực bào với các "chân giả" có tác dụng bắt giữ các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus và tiêu diệt chúng (Nguồn Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH)Hiện có các chủng gây bệnh tại Mỹ và Châu Âu. Các nghiên cứu phân tử cho thấy giữa viruss gây PRRS tại Châu Âu và Mỹ chỉ tương đồng 60% về nguyên liệu di truyền (bộ gene virus). PRRS virus thuộc nhóm RNA virus (RNA mạch đơn). Virus mang gene mã hóa protein trung hòa kháng thể (ORF 5, khoảng 24-25 kDa), nucleocapsid (N protein khoảng 15kDa). Virus có khả năng đề kháng với nhiệt độ thấp (giữ độc lực trong thực phẩm được bảo quản lạnh).Phân bố của bệnhTuy được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 tại Mỹ nhưng một số nghiên cứu dịch tễ học cho rằng có thể bệnh đã lưu hành trước đó tại Canada. Bệnh xuất hiện ở Châu âu vào năm 1990 và hiên đã lưu hành ở nhiều nước thuộc châu lục này. Các kiểm tra huyết thanh học và virus học cho thấy PRRS cũng đã có mặt tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines, Nam Mỹ, các nước vùng Ca-ri-bê... Trong những ngày gần đây, bệnh đã xuất hiện tại nhiều địa phương ở nước ta. Triệu chứng lâm sàngCăn cứ vào sự biểu hiện các triệu chứng của bệnh, người ta có thể chia thành hai giai đoạn khác nhau: Giai đoạn 1 là biểu hiện các triệu chứng rối loạn sinh sản đối với lợn nái và giai đoạn hai là sự biểu hiện của các triệu chứng hô hấp. Trong khoảng 6-12 tuần sẽ có biểu hiện bệnh trong đàn lợn. Bệnh tích* Đối với lợn nái, ngoài các triệu chứng sảy thai, tăng tỷ lệ thai chết, lợn mắc bệnh thường không có các bệnh tích đặc thù. - Lợn con thường mang bệnh tích rõ hơn lợn lớn, bao gồm: -Dịch thẩm xuất trong đướng tiêu hóa và đường hô hấp (đặc biệt trong các phế quản). -Phù. -Thanh dịch trong xoang phúc mạc, xoang ngực, xoang phế mạc và tung cách mạc. -Sưng hạch bạch huyết. -Da nhiều vùng có màu xanh tím III.Giới thiệu về kỹ thuật ELISAKhái niệmELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể.Các phương pháp ELISA1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính: - Chuyển KN đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). KN sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết. - Chuyển các mẫu KN chưa biết vào các giếng khác. KN chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn. - Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa. - Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. KT sẽ kết hợp với các KN đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh. - Thêm KT thứ cấp (secondary antibody), KT thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một KT còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện KN đã gắn với enzyme). - Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ. - Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại). -Nhược điểm cơ bản: Bước cố định KN không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy KT (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này. 2. Sandwich ELISA:-Phương pháp được sử dụng để phát hiện KN trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp): (1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT (2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt (3) Phủ mẫu chứa kháng KN cần xác định (4) Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết sẽ bị rửa trôi (5) Thêm các KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán (6) Thêm KT thứ cấp đã được gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp ở bước 5) (7) Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi. (8) Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện. (9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng KT. 3. ELISA cạnh tranh: (1) Ủ KT không được đánh dấu với KN. (2) Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa KN. (3) Rửa đĩa, KT không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng KN càng lớn, lượng KT gắn thành công với KN trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh". (4) Thêm KT thứ cấp (KT của KT ở bước 1). KT thứ cấp gắn với enzym. (5) Thêm cơ chất. Lượng enzym còn dư sẽ giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu. -Trong phương pháp này, hàm lượng KN gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng yếu. - Một số trường hợp, enzym được gắn với KN chứ không phải KT.Ứng dụngMột số ứng dụng của ELISA: - Xác định nồng độ của KT trong huyết thanh; - Kiểm tra sự có mặt của KN; - Phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm; - Xác định sự có mặt của dược phẩm; - Xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học ... IV.Phương pháp chẩn đoán PRRS bằng kỹ thuật ELISA.Lấy mẫu- Mẫu máu. - Mẫu các cơ quan: Phổi, hạch hạnh nhân, hạch bạch huyết, lách.Tiến hành chuẩn đoán-Xử lý mẫu-Thực hiện các bước trong kỹ thuật ELISA với bộ kit đặc hiệu để có kết quả chính xác, tránh hoặc giảm tối đa hiện tương dương tính giả. -ngoài ra một số kit ELISA thương mại cho phép thực hiện được các chuẩn đoán phân biệt hai dòng virus châu âu và châu mỹ khi sự khác biệt về gen từ 0.5% - 1%.-Kháng thể được phát hiện sau khi nhiễm 1-2 tuần: khoảng thời gian có thể phát hiện kháng thể khoảng 4 tháng sau khi bị nhiễm.-Đọc kết quả Bộ kít chuẩn đoán virusV.Kết luận-Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) là một bệnh do virus, gây thiệt hại lớn về kinh tế và được phát hiện tại Mỹ vào năm 1987.-Hiện có các chủng gây bệnh tại Mỹ và Châu Âu. Các nghiên cứu phân tử cho thấy giữa viruss gây PRRS tại Châu Âu và Mỹ chỉ tương đồng 60% về nguyên liệu di truyền (bộ gene virus).- Tiếp xúc giữa lợn ốm và lợn khỏe là đường truyền lây chính của bệnh nên bệnh có thể lây giữa các cá thể trong một đàn hay từ đàn này sang đàn khác (nếu lợn bị bệnh được chuyển đàn, chuyển trại...). Lợn mang virus có thể giải phóng virus trong thời gian 3-4 tháng gây khó khăn cho công tác theo dõi và phát hiện và khống chế bệnh. Áp dụng các phương pháp phòng tránh chung đối với mọi loại bệnh truyền nhiễm đặc biệt là bệnh do virus như đảm bảo vệ sinh chuồng trại, nhiệt độ chuồng nuôi, thực hiện luân chuyển chuồng và tiêu độc định kỳ, đảm bảo dinh dưỡng v.v. Làm theo hướng dẫn của cán bộ thú y trong trường hợp nghi đàn có lợn nhiễm bệnh hay khi dịch đã sảy ra. - Thực hiện quy định về kiểm dịch động vật đối với việc nhập khẩu con giống, tinh dịch - Kiểm tra lợn xuất, nhập chuồng và thực hiện vệ sinh thú y trong vận chuyển đàn -Một trong những phương pháp chẩn đoán virus này là phương pháp ELISA với độ đặc hiệu và độ nhạy cao nhờ sự dụng bộ kit ELISA thương mại cho kết quả chính xác hơn so với các phương pháp khácVI.tài liệu tham khảo sách khoa hoc của VLOS.Các trang thuộc  giảng kỹ thuật công nghệ sinh ho Công nghệ sinh học trong thú y (nhà xuất bản nông nghiệp tp.hcm).