Đề tài Chuẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng

ng hợp của HPAIV , một sự đi qua thứ hai sử dụng chất để tiêm chủng 
pha loãng có thể thuận lợi cho sự sản xuất tối ưu của sự ngưng kết. 
Sự phân lập ngưng kết được mô tả kháng nguyên bằng thử nghiệm ức chế ngưng 
kết (HI) sử dụng (mono-) kháng kháng huyết thanh loại phụ 16 H và cho việc kiểm 
soát, kháng lại những những type khác nhau của virus trên gia cầm, những type này 
cũng thể hiện hoạt động nhưng kết. Loài phụ NA có thể được được xác định sau đó 
bởi thử nghiệm ức chế neuraminidase, mặc khác yêu cầu laọi phụ huyết thanh dặc biệt 
( Aymard 2003 ). Trong trường hợp phân lập những dòng H5 hoặc H7 được chạm trán, 
bảng liệt kê tác nhân trong động mạch gây bệnh (IVPI) cần thiết cho việc xác định để 
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 
 - 13 - 
phân biệt giữa kiểu LP và HP (Allan 1977 ). Đó được hoàn thành bởi sự tiêm chủng iv 
của 10 con gà được 6 tuần tuổi với virus phân lập trong trứng phát triển ( 0,1 ml của 1 
trong 10dung dịch pha loãng của dịch túi niệu bao gồm một độ chuẩn lớn hơn 1 trong 
16). Những con gà được khảo sát trên một thời kỳ mười ngày có triệu chứng bệnh. 
Những kết quả được nhập và bên trong một bảng biểu thị một virus HPAI khi tỷ lệ lớn 
hơn 1.2 vẫn được sử dụng. Như một sự lựa chọn, một HPAI phân lập được thử sức 
khi tối thiểu 7 ngoài 10 ( 75% ) gà được tiêm chủng chết với giai đoạn khảo sát. 
Những thủ tục cơ bản được mô tả có thể đưa đến một sự chẩn đoán HPAI trong 
khoảng thời gian 5 ngày nhưng có thể đòi hỏi nhiều hơn hai tuần để loại trừ sự có mặt 
của AIV. Trong tình huống thêm vào, những công cụ chẩn đoán chất lượng cao ( SPF 
eggs, H- and N-subtype specific antisera) và kỹ năng của mỗi người là điều kiện quyết 
định trước hết. Ngày nay, không một sự ứng dụng nuôi cấy tế bào nào cho việc phân 
lập AIV, sự phân lập AIV có thể đạt được sự nhạy cảm của những trứng mái có phôi ( 
Seo 2001). 
ii) Một sự tiếp cận nhanh chóng, đặc biệt khi loại trừ sự tiêm nhiễm được đòi hỏi, tận 
dụng kỷ thuật sinh học phân tử, nó nên theo một kiểu phân tầng: sự hiện diện của 
RNA đặc biệt của virus cúm được phát hiện thông qua kỹ thuật RT-PCR kỹ thuật này 
nhằm vào những đoạn của gen M, hầu hết những vùng genome bảo tồn cao của những 
virus cúm ( Fouchier 2000, Spackman 2002), hoặc những gen mã hoá capsid (Dykaer 
2004). Khi một kết quả dương tính đạt được, RT-PCRs sẽ khuếch đại những đoạn của 
gen ngưng kết của loài phụ H5 và H7 được chạy để phát hiện sự có mặt của AIVs có 
thể khai báo ( Dybkear 2004, Spackman 2002). Khi sự đáp lại dương tính, một chẩn 
đoán phân tử của loại tác nhân gây bệnh (LP chống lại HP) có thể thực hiện được sau 
khi giải trình tự một đoạn của gen HA trải dài vùng phân tách bỡi enzyme proteoza 
nội thích ứng. Hiện tại phân lập với những amino acid phức tạp có tính bazơ được 
phân loại như HPAI. PCRs và những kỷ thuật DNA khác đang được thiết kế cho việc 
phát hiện dòng H5N1 châu Á (Collins 2002, Payoungporn 2004, Ng 2005). Loài phụ 
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 
 - 14 - 
Non-H5/ H7 có thể được nhận diện bởi một RT-PCR hợp với tiêu chuẩn và phân tích 
trình tự sau đó của đơn vị dưới HA-2 (Phípp 2004).Đó là những primer cho mỗi loài 
phụ NA. Một đặc trưng đầy đủ có thể đạt được trong vòng 3 ngày, đặc biệt khi kỷ 
thuật real time PCR được sử dụng (Perdue 2003, Lee and Suarez 2004). Tuy nhiên 
những chip DNA được phát triển chúng có thể xúc tiến việc sắp xếp có hiệu quả hơn 
các loại virus AI (Li 2001, Kessler 2005). Một sự chẩn đoán loại trừ thì có khả năng 
thực hiện trong khoảng một ngày làm việc một mình. 
Những bất lợi của những phương pháp chẩn đoán phân tử là giá thành để trả cho 
việc mua những thiết bị và những thứ có thể dùng, nhưng nếu có sẵn, một vài mẫu có 
thể được phân tích với ít người trong thời gian ngắn hơn cực kì so với phân lập virus 
trong trứng. Tuy nhiên, không nên giữ bí mật rằng mỗi phản ứng PCR hoặc lai phân 
tử, ngược với phân lập virus trong những quả trứng, chứa chấp một bản chất không rõ 
ràng liên quan đến sự hiện diện của những thay đổi đặc biệt trong việc phân lập tại 
những vị trí liên kết của những primer và/hoặc những probe chúng có thể đưa đến thử 
nghiệm âm tính giả. 
Do đó, một sự kết hợp của sinh học phân tử ( e.g. kết quả sàng lọc) và những 
phương pháp phân loại (e.g. đặc trưng không thay đổi của phân lập và xác nhận của 
phương pháp chẩn đoán của một bảng phụ lục) có thể giúp để đối trọng sự bất lợi của 
hai nguyên lý. 
Những phương pháp thử nghiệm nhanh được thiết kế cho việc phát hiện kháng 
nguyên của virus trong những vết mô trong phương pháp xét nghiệm kính phết và 
cryostat section khi sử dụng miễn dịch phát huỳnh quang hoặc thử nghiệm miễn dịch 
liên kết enzyme bắt giữ kháng nguyên (ELISA) và những hệ thống que đo mực nước 
dòng chảy phần bên ở trong chất lưu trong miếng gạt. Cho đến bây giờ, những kỷ 
thuật có độ nhạy thấp hơn kỷ thuật phân lập virus hoặc PCR,và do đó có thể gặp khó 
khăn để chấp nhận cho một phương pháp chẩn đoán hợp lý, đặc biệt của một bảng 
danh mục ( Davision 1998, Selleck 2003, Cattoli 2004). Ứng dụng của những phương 
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 
 - 15 - 
pháp xét nghiệm nhốt trên mắt phẳng trong lĩnh vực thú y thì vẫn còn trong giai đoạn 
phôi thai và cần được đẩy mạnh việc phát triển. 
4. Phân lập và nhận dạng virus 
4.1. Phân lập virus băng tiêm miễn dịch trong những quả trứng gà có phôi 
4.1.1. Quá trình vật liệu cho chẩn đoán virus 
4.1.1.1. Miếng gạt lấy mẫu ở lỗ huyệt 
30 miếng gạt lấy mẫu ở lỗ huyệt sẽ được chia ra như một mẫu được phân phối 
trong buffer chứa những kháng thể 30 ml ( isotonic PBS, pH 7,2, penicilin 2000 
IU/ml, streptomycin 2 mg/ml và fungizone 0,025mg/ml). Lấy miếng gạt ra ngoài 
trước khi tim chủng. Sau đó, mẫu đối chứng dương tính trong nhóm đầu tiên tiêm 
chủng 200 µl avian influenza virus HA 107,5. Nhóm thứ hai tiêm chủng 200 µl PBS 1x 
cho đối chứng âm. Nhóm cuối cùng tiêm chủng 200 µl thể vẩn bước đầu của nồng độ 
virus. Thể vẩn từ 3 nhóm được ly tâm 3000 vòng trong 30 phút trong máy ly tâm lạnh 
(4oC) để lắng những mảnh mô và tất cả vi khuẩn, chất lỏng sạch trong được thu thập, 
sau đó chất lỏng được lọc bằng màng lọc (0,45µm). Khi nhóm đối chứng dương và âm 
mỗi thứ lấy 3ml vật liệu tiêm chủng cho vào ống siêu li tâm, và nhóm cuối cùng cho 
thể vẩn bước đầu của nồng độ virus chia vào 10 phần giống hệt nhau. 
Cho dung dịch pha loãng tiếp nhau (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9) thủ 
tục giống như nói đén ở trên được sử dụng. 
4.1.1.2. Mẫu mô (cơ quan phổi) 
20 mẫu phổi thu thập từ từ 10 con gà được chia ra như một mẫu cho sự phân lập 
virus. Nghiền mẫu mô trong một cái cối và chày tiệt trùng với thuỷ tinh tán vụn từ một 
pipette tiệt trùng, tạo ra một thể vẩn 10% với môi trường vận chuyển được phân phối 
trong buffer bao gồm kháng thể 30 ml (PBS đẳng trương, pH 7,2, penicilin 2000 
IU/ml, streptomycin 2mg/ml và fungizone 0,025mg/ml), sau đó chuyển mẫu đồng 
nhất với môi trường vận chuyển vào bên trong ống li tâm. Khi đối chứng dương trong 
nhóm đầu tiêm chủng 200µl vius cúm gia cầm HA7,5. Nhóm thứ hai tiêm chủng 200 µl 
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 
 - 16 - 
PBS 1x cho mẫu đối chứng âm. Nhóm cuối cùng tiêm chủng 200 µl thể vẩn bước đầu 
của nồng độ virus. Thể vẩn từ 3 nhóm được li tâm 3000 vòng 30 phút trong máy li 
tâm lạnh (4oC) để lắng những mảnh mô và hầu hết vi khuẩn, dịch lỏng sạch bên trên 
được thu thập, sau đó dịch lỏng được lọc bằng màng lọc (0,45µm),. Sau đó nhóm đối 
chứng lấy 3ml vật liệu tiêm chủng vào trong ống siêu li tâm, nhóm thứ hai là đối 
chứng âm lấy 3ml vật liệu tiêm chủng vào trong ống siêu li tâm, và nhóm cuối cùng 
cho thể vẩn bước đầu của nồng độ virus chia vào 10 bản sao giống hệt nhau. 
Cho dung dịch pha loãng cận nhau (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9) 
tiến trình giống như đề cập ở trên được sử dụng. 
4.1.1.3. Vật liệu 
• Những quả trứng gà đặc biệt sạch với mầm bệnh (SPF), 9-11 ngày tuổi 
• Vật soi trứng 
• Ethanol 70% 
• Kim nhọn 
• 22 Máy đo 
• Ống tiêm 1ml, 1/1/2 
• Cái thoi dùng để tạo lỗ thủng trên quả trứng 
• Keo hồ hoặc men trám 
• Chất để tiêm chủng 
• Khay để trứng 
4.1.2. Thủ tục 
1. Soi trứng 
1. Khảo sát những quả trứng với một biện pháp soi trứng và đặt đầu cùng của 
quả trứng quay lên vào bên trong những cái khay trứng. 
2. Loại bỏ những trứng không được thụ tinh, có những vết nứt, phát triển 
không đày đủ, hoặc xuất hiện lỗ thủng. 
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 
 - 17 - 
2. Sự tiêm chủng cho những quả trứng. 
1. Đặt những quả trứng với đầu cùng của nó quay lên vào bên trong những cái 
khay trứng và đánh dấu mỗi quả trứng với một con số nhận dạng đặc biệc ( 3 
quả trứng cho một mẫu bệnh phẩm). 
2. Lau sạch mặt trên của những quả trứng bằng ethanol 70% và thọc một lỗ nhỏ 
vào bên trong vỏ xuyên qua túi khí. Ba quả trứng cho mỗi mẫu bệnh phẩm 
thường được tiêm chủng trong túi niệu. 
3. Hút 200µl mẫu đã được xử lý vào bên trong một ống tiêm vaccine với một 
22 gauge, kiêm tiêm 1/1/2 inch. Lồng kiêm vào bên trong cái lỗ đã được tạo của 
quả trứng. dừng một máy đâm ngắn , tiêm chủng 200µl mẫu xử lý chúng được 
chuẩn bị từ miếng gạt lỗ huyệt và phổi trong mỗi dung dịch pha loãng cho sự 
tập trung virus bên trong khoang huyệt, 10 mẫu cho mỗi nồng độ pha loãng. Rút 
kim ra. Tim chủng hai quả trứng khác với cách giống nhau với ống tiêm giống 
nhau, kim giống nhau cho toàn bộ 3 trứng đã tiêm chủng mỗi mẫu xét nghiệm. 
Vứt bỏ ống tiêm vào bên trong một vật chứa an toàn riêng biệt. Bịt kín những 
cái lỗ thủng trong những quả trứng bằng một giọt keo dáng. Ấp những quả 
trứng ở nhiệt độ 38-39oC và độ ẩm 60%- 70% thời gian 5 ngày. 
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 
 - 18 - 
3. khảo sát những quả trứng đã được tiêm chủng 
Trứng được tiêm chủng được soi đến 5 ngày. Ghi nhận những quả trứng bị chết 
và ghi chép thời gian làm cho phôi chết. Những quả trứng chết trong ngày đầu 
tiên được quan tâm như không đặc biệt và không cần để ý đến. Vứt bỏ những 
phôi này. Những quả trứng chết trong những ngày sau đó thí có khả năng thừa 
hưởng virus cúm gia cầm.( hình 2) 
HPAI chết trong 1-2 ngày 
LPAI chết sau 2-4 ngày 
Thuận lợi: 
- Nguyên tắc vàng: Phương pháp được 
tiến cử bởi WHO, OIE 
- Chính xác : Độ chính xác cao nhất 
- Hữu ích : cho phép những nghiên cứu tiếp sau. 
Bất lợi : 
- Tốn thời gian : thường mất hơn 1 ngày 
- Sự an toàn phòng thí nghiệm : BLS-3 
- Chất lượng cao hơn của mẫu 
- Những tác nhân khác nên được loại trừ 
- Sự nhiễm chéo 
4. Sự thu hoạch của những quả trứng gà được tiêm chủng 
Những quả trứng được giữ lạnh ở 4oC qua đêm hoặc khoảng 4 giờ trước khi thu 
hoạch. Dáng nhãn một ống plastic (15ml) cho mỗi quả trứng tương ứng với con 
số ghi cho mẫu bệnh phẩm. Lau sạch chóp của mỗi quả trứng bằng ethanol 
70%. Với kiềm vô trùng, làm vỡ lớp vỏ bên trên túi khí và đẩy màng túi niệu về 
một bên bằng kiềm. Sau đó sử dụng một ống tiêm và kim, chọc thủng túi ói và 
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 
 - 19 - 
rút kim ra khi một số lượng lớn 
dịch trong túi ói có thể chấp 
nhận được. Đặt kết quả trong 
một ống tách rời, kết hợp dịch 
túi niệu từ 3 quả trứng được 
tiêm chủng mỗi mẫu xét 
nghiệm . Ly tâm dịch thu hoạch 
và thực hiện một xét nghiệm 
hemagglutination và ủ ở 4oC/30 phút. 
5. Xét nghiệm hemagglutination 
Vật liệu 
Sử dụng 96 đĩa vi chuẩn độ tốt với kiểu đáy chữ V 
Multichannel micropipette 5-50 µl.,single micropipette 1-200 µl 
Đồng hồ bấm giờ 
Muối phosphate buffer (PBS) pH 7,2 
1% tế bào máu đỏ của gà 
Mẫu đối chứng dương và huyết thanh virus bệnh Newcastle. 
Phương pháp 
Dùng khay dùng một lần đáy chữ V. Phân phối 50µl dịch túi niệu từ mỗi mẫu 
cho vào trong một đĩa vi chuẩn độ tốt. Dùng một tip riêng biệt cho mỗi mẫu. Kể 
cả chứng âm và chứng dương kiểm soát những mẫu dịch túi niệu trên một trong 
những cái đĩa. Phân phối 50µl PBS vào trong mỗi đĩa. Thêm 25 µl 1% red 
blood cell vào mỗi đĩa. Mở nhẹ những tấm của đĩa để trộn. Đặt một vỏ bọc lên 
trên đĩa. Để cho đĩa đứng 45 phút tại phòng nhiệt. khảo sát và ghi chép kết quả. 
6. Đọc kết quả 
a) Giải thích kết quả 
HI âm tính: Một cái nút nhọn của những tế bào máu màu đỏ tại đáy của V-
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 
 - 20 - 
botton well. 
HI dương tính: một hình ảnh mờ mờ của những tế bào máu đỏ, không nút hoặc 
một nút rất nhỏ của những tế bào máu đỏ tại đáy của V-botton well. 
Đó sẽ thể hiện sự kháng ngưng kết hồng cầu và chứa đựng một đơn vị kháng 
ngưng kết hồng cầu. 
Nếu virus gây bệnh Newcastle (NDV) thì xét nghiệm ngưng kết hồng cầu là âm 
tính. Sau đó, chứng thực bằng kiểu phụ với xét nghiệm nhanh trực tiếp bởi việc 
sử dụng vet smart® test. 
b) Xét nghiệm nhanh bằng sử dụng vet smart® test 
Bộ kit xét nghiệm vet smart® test quảng cáo trên thị trường. Rockeby Avian 
Influenza Virus Antigen đã được sử dụng 
Bộ kít là một sự phát hiện kháng nguyên của Avian Influenza (Test Type A) 
cho việc chẩn đoán, Rockeby biomed. Singapore.Pte.Ltd ). 
Phương pháp xét này được thiết kế để đo lường chất lượng của kháng nguyên. 
200 µl mẫu được lấy từ mỗi ống nghi ngờ kết quả avian influenza từ xét nghiệm 
kháng ngưng kết hồng cầu và góp phần như một mẫu. Lấy một phần chia của 
mẫu (dịch túi niệu) từ ống vi ly tâm với mẫu gạt thu thập. chèn miếng gạt vào 
trong ống mẫu xét nghiệm chứa đựng dung dịch xét nghiệm pha loãng. Trộn 
miếng gạt cho đến khi mẫu được tan rã vào bên trong dung dich xét nghiệm pha 
loãng. Để mặt ống xét nghiệm cho đến khi những mẩu rộng được đọng xuống 
đáy của ống. Thoát thiết bị chẩn đoán từ túi nền, và đặt nó lên trên một bề mặt 
nhẵn khô. Dùng ống nhỏ giọt dùng một lần đã cung cấp, giữ nổi trên bề mặt từ 
mẫu phân tách trong ống. Thêm 8 giọt vào bên trong lỗ thủng của mẫu bằng 
ống nhỏ giọt dùng 1 lần. 
(Hình 3). Giải thích kết quả sau 10 phút. 
Sự giải thích kết quả; 
C : band đối chứng được tìm thấy chỉ band này nó là kết quả âm tính 
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 
 - 21 - 
T : Nhóm xét nghiệm được xét nghiệm mẫu 
Kết quả âm tính từ xét nghiệm tìm thấy ở band C 
Kết quả dương tính từ xét nghiệm tìm thấy ở cả band C và T 
Xét nghiệm nhanh trực tiếp bỡi sử dụng vet smart® test bước trước để phát hiện 
kháng nguyên trong thể vẩn của nghiên cứa thí nghiệm trong mỗi dịch pha 
loãng của nồng độ virus. Kết quả dương tính trong xét nghiệm nhanh dùng để 
có khả năng thể hiện ghi nhận kết quả. ( Cho việc phân lập virus và phát hiện 
virus bằng việc sử dụng những quả trứng gà có phôi) 
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 
 - 22 - 
C. Kết luận 
- Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng cho kết quả chính 
xác nhất 
- Phương pháp chẩn đoán bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng tốn nhiều thời gian. 
- Trong phương pháp chẩn đoán bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng việc đảm bảo 
những quả trứng sạch là rất quan trọng. 
- Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi 
cấy phôi trứng cần kết hợp với các phương pháp khác như : sinh học phân tử, huyết 
thanh học, 
D. Tài liệu tham khảo: 
• www.influenzaReport.com 
• www.adb.org/Documents/Events/2007/HPAI-control-technology-
CAREC/Detection-Avian-influe 
• www.vphcap.org 
• www.who.int 
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 
 - 23 - 
ài liệu tham khảo 
A. Đặt vấn đề ...................................................................................................................2 
B. Tổng quan....................................................................................................................2 
I. Thông tin chung về cúm gia cầm..................................................................................3 
1.Cúm gia cầm là gì? .......................................................................................................3 
2. Vi-rút cúm khuyếch tán và lây truyền như thế nào?....................................................7 
3. Hiện nay dịch cúm gia cầm xảy ra như thế nào? .........................................................7 
4. Cúm gia cầm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người .......................................................8 
(a) Sự lan rộng và tồn tại lâu dài của dịch cúm gia cầm gây ra 2 mối nguy cơ lớn đối với sức khoẻ 
con người .........................................................................................................................8 
(b) Các trường hợp cúm gia cầm H5N1 xảy ra trên con người .......................................9 
(c) Con người bị nhiễm vi-rút cúm H5N1 trong trường hợp nào ....................................9 
5. Triệu chứng của bệnh cúm gia cầm ở người là gì?......................................................10 
(a) Yếu tố dịch tễ..............................................................................................................10 
(b) Lâm sàng ....................................................................................................................10 
(c) Cận lâm sàng ..............................................................................................................11 
II. Chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm ....................................................................11 
1. Sự thu thập mẫu xét nghiệm ........................................................................................11 
2. Sự vận chuyển mẫu xét nghiệm...................................................................................12 
3. Phát hiện trực tiếp sự tiêm nhiễm của AIV..................................................................13 
4. Phân lập và nhận dạng virus ........................................................................................16 
4.1. Phân lập virus băng tiêm miễn dịch trong những quả trứng gà có phôi ...................16 
4.1.1. Quá trình vật liệu cho chẩn đoán virus ..................................................................16 
4.1.1.1. Miếng gạt lấy mẫu ở lỗ huyệt .............................................................................16 
4.1.1.2. Mẫu mô (cơ quan phổi).......................................................................................16 
4.1.1.3. Vật liệu................................................................................................................17 
4.1.2. Thủ tục ...................................................................................................................17 
1. Soi trứng.......................................................................................................................17 
2. Sự tiêm chủng cho những quả trứng............................................................................18 
3. khảo sát những quả trứng đã được tiêm chủng ............................................................19 
4. Sự thu hoạch của những quả trứng gà được tiêm chủng..............................................19 
5. Xét nghiệm hemagglutination......................................................................................20 
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 
 - 24 - 
6. Đọc kết quả ..................................................................................................................20 
a) Giải thích kết quả .........................................................................................................20 
b) Xét nghiệm nhanh bằng sử dụng vet smart® test.........................................................21 
C. Kết luận .......................................................................................................................23 
D. Tài liệu tham khảo.......................................................................................................23