Đề tài Ứng dụng kỹ thuật elisa chẩn đoán bệnh dịch tả heo

ĐÊ TÀI 09:  ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ HEOGiáo viên hướng dẫn :	 Sinh viên thực hiện: TS.NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN XUÂN KHÁNH Lớp: DH06SH MSSV: 06126055I.Đặt vấn đềNghành chăn nuôi hiện nay đóng vai trò rất quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu.Xuất phát từ tình hình trên, nên việc nghiên cứu các phương pháp phát hiện bệnh là yêu cầu cấp thiết để phòng chống bệnh, giảm tổn thất trong chăn nuôi, giữ cho đàn heo mắc bệnh ở tỷ lệ thấp nhất. II.Giới thiệu về dịch tả heoa. Phân loạiHọ FlavividaeGiống Pestivirus Virus dịch tả heo rất gần về mặt cấu trúc gen và cấu trúc kháng nguyên vơi các loài như sau:Bovine diarrhea virusEquine arteritis virusBorder diesease virusb.Hình thái, cấu tạo:Kích thước nhỏ 40-50 nmCó dạng hình cầu với cấu trúc nucleocapsid đối xứng 20 mặtBộ gen virus là một chuỗi RNA, độ dài khoảng 12.5kb, một khung đọc mở (ORF)c. Tính chất lý hóaVirus dịch tả heo được coi là virus có sức đề kháng yếu.Ổn định ở PH 5-10, ngoài khoảng PH này thì virus bị phá hủy nhanh.Những chất tan lipid như ether, chloroform và deoxycholate làm bất hoạt virus nhanh.d.Tính chất kháng nguyênChỉ có một typ kháng nguyên dịch tả heo, tuy nhiên có hai nhóm phụ Nhóm phụ A: bao gồm những chủng cường độ chủng độc lực thấp, chủng biến đổi.Nhóm phụ B: chủng độc lực thấp gây xáo trộn sinh sản.III.Nguyên lý sử dụng bộ Kit Elisa:Gồm 4 bước:Các đối chứng và mẫu được cho vào những giếng có kháng thể đơn dòng kháng HCV (p125).rửa để loại bỏ những đoạn không liên kết, thêm vào kháng huyết thanh thỏ kháng HCV.3.Tiến hành rửa lần hai, sau đó cho kháng thể dê kháng kháng thể thỏ có gắn enzyme peroxidase cho phép phát hiện dạng kháng huyết thanh thỏ kháng HCV theo phức hợp: (Mab) - (Ag HCV [p125]) - (Rabbit Ig anti-HCV [p125]) - (Goat Ab anti-rabbit Ig /peroxidase).4.Sau bước rửa thứ 3, enzyme gắn với lại conjugate được phát hiện bởi việc thêm vào cơ chất nó làm biến đổi thành sản phẩm có màu..IV.Phương pháp tiến hành:1.Phân phối đối chứng và mẫu2.Thêm kháng huyết thanh3.Thêm conjugate4.Phát hiện5.Xử lý số liệu1.Phân phối đối chứng và mẫua, Phân phối đối chứng: Đối chứng được sẵn sàng sử dụng. Lắc ống đựng đối chứng, cho 100µ đối chứng âm vào giếng A1, A2, cho 100µl đối chứng dương vào giếng B1, B2.b,Phân phối mẫu:Mẫu huyết thanh, huyết tương, và cả mẫu máu được kiểm tra sau khi pha loãng với tỷ lệ 1:2 trực tiếp trong giếng, dùng 100µl/giếng.Phân phối 50µl mẫu pha loãng và thêm 50µl mẫu được kiểm tra.Mẫu bạch cầu và dịch chiết mô: phân phối 100µl supernatant từ dịch chiết mô không pha loãng hơn nữa.Giếng phải được phủ phim dính.Trộn bằng cách lắc nhẹ đĩa(plate) hoặc máy trộn. c. Ủ đĩa(plate) Ủ 2 giờ ± 5 phút ở 37°C ± 3°C hoặc qua đêm (14-18 giờ) ở 20°C ± 5°C.d.Rửa: pha loãng nồng độ dung dịch rửa 1:10 trong nước cất hoặc nước khử ion. Cẩn thận loại bỏ phim dính và rửa 4 lần.2.Thêm kháng huyết thanhChuẩn bị kháng huyết thanh: pha loãng kháng huyết thanh 1:10 với chất pha loãng. Phân phối kháng huyết thanh: cho 100µl của kháng huyết thanh pha loãng vào toàn bộ giếng và phủ với một phim dính mới.Ủ: kháng huyết thanh 1 h ± 5 phút ở 37°C ± 3°C.Rửa: cần chú ý loại bỏ lớp phim dính và rửa 4 lần.3.Thêm conjugateChuẩn bị conjugate: chuẩn bị dung dịch conjugate pha loãng nồng độ 1:10. Phân phối conjugate: thêm 100µl conjugate pha loãng vào tất cả các giếng và phủ 1 mẫu phim dính mới.Ủ: conjugate 1 h ± 5 phút ở 37°C ± 3°C.Rửa: loại bỏ phim dính, rửa 4 lần.4.Phát hiệnThêm cơ chất: Thêm 100 µl cơ chất peroxidase / giếng..Trộn bằng cách lắc nhẹ hoặc sử dụng máy trộn.Ủ: cơ chất 30 phút ± 5 phút ở nhiệt độ phòng ( 20°C ± 5°C), tránh ánh sáng.Thêm dung dịch dừng phản ứng: thêm 50µl dung dịch dừng phản ứng trong một giếng. Trộn bằng cách lắc nhẹ hoặc sử dụng máy trộn. 4.Phát hiện(tt)Đo OD: ở 2 bước sóng hấp thu 450 và 630nm hoặc 1bước sóng hấp thu 450nm bằng máy đọc Elisa. Thu kết quả nếu có giá trị :OD đạt được đối với đối chứng dương là ≥0.300, và OD đạt được đối với đối chứng âm là < 70% ODP5.Xử lý số liệuIV. Tài liệu tham khảo: Công nghệ sinh học trong thú y. Nguyễn Ngọc Hải.Phylogenetic of hog cholera virus in Tien Giang province Trần Thị Dân, Lương Quý Phương, Nguyễn Ngọc Tuân, Thái Quôc Hiêu, Hô Huỳnh Mai . Đại học Nông Lâm TPHCM, CCTY Tiền GiangMignon B., Waxweiler S., Thiry E., Boulanger D., Dubuisson J. and Pastoret P.P. 1992 J. Virol. Methods, 40 ; 85-94.