Tiểu luận Chẩn đoán virus Gumboro (Infectiuos bursal disease) bằng kỹ thuật gen

Bài tiểu luận: CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO (INFECTIUOS BURSAL DISEASE) BẰNG KỸ THUẬT GEN Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện TS. Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Thị Thu Thanh	 Lớp: DH06SH MSSV: 06126133 MỤC LỤC 	I. ĐẶT VẤN ĐỀ	II. TỔNG QUAN	 1. Virus Gumboro (IBDV)	 2. Bệnh Gumboro	 2.1. Sơ lược về túi Fabricius	 2.2. Lịch sử phát hiện	 2.3. Cơ chế 2.4. Triệu chứng	 2.5. Bệnh tích	 3. Các phương pháp chẩn đoán virus Gumboro	 3.1. RT-PCR	 3.2. RFLP	III. KẾT LUẬN	IV. TÀI LIỆU THAM KHẢOI. ĐẶT VẤN ĐỀKỹ thuật gen ngày càng có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp và y học bảo vệ sức khoẻ con người. Các thành tựu nghiên cứu bộ gen người, bộ gen cây lúa, và nhân bản động vật  đã mở ra một thời kỳ mới trong sinh học, giúp con người hiểu biết rõ bản chất của nhiều loại bệnh di truyền, bệnh truyền nhiễm, chẩn đoán bệnh sớm, góp phần điều trị có hiệu quả và bảo vệ sức khoẻ con người cũng như gia súc và gia cầm. I. ĐẶT VẤN ĐỀKỹ thuật gen đã được áp dụng nhiều trong chẩn đoán virus, cho phép xác định kết quả chỉ trong vòng 24 giờ. (Những phương pháp chẩn đoán này có những ưu điểm cơ bản như: nhanh chóng, đơn giản, nhạy, chính xác và chi phí thấp)Hiện nay, việc chăn nuôi gia cầm ở nước ta đang gặp nhiều khó khăn. (Do có nhiều dịch bệnh xuất hiện trên gia cầm gây thiệt hại nặng nề cho nhà chăn nuôi như H5N1, bệnh Gumboro)Vì vậy, việc ứng dụng những kỹ thuật gen vào việc chẩn đoán, điều trị bệnh trên gia cầm hiện nay là một tất yếu. II. TỔNG QUANVirus Gumboro (IBDV):1. Virus Gumboro (IBDV):Virus Gumboro hay còn gọi là Infectious Bursal Disease Virus (IBDV).IBDV có dạng hình khối, nhiều góc cạnh, kích thước: 55-65 nm, phân tử khối: 2.106 Dalton (Nick, 1976).IBDV là virus dạng trần, không có vỏ bọc ngoài. IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA cuộn tròn và được phân thành 2 đoạn riêng biệt, nó thuộc loài Avibirnavirus của họ Birnaviridae (Leong et al., 2000). Quanh nhân là vỏ protein (vỏ capsid). Lớp capsid này được hợp thành bởi 32 capsomer (đơn vị hình thái). Mỗi capsomer được tạo bởi 5 loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral ProteinVP). 1. Virus Gumboro (IBDV):IBDV genome chứa hai mạch, A và B. Mạch B (2.9kb) mã hóa cho VP1 (VP1: 95kDa), là một enzyme RNA polimerase phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polimerase-RdRp) (Bruenn, 1991; Macreadie & Azad, 1993; Spies et al., 1987), mang bản chất của một protein tự do và của một protein liên kết genome (còn được gọi là VPg). ). VPg được cố định vào đuôi 5’ của sợi dương của 2 mạch trong genome (Dobos, 1993; Spies & Muller, 1990). Mạch A lớn hơn (3.2kb) chứa hai khung đọc mở thành phần (overlapping open reading frame-ORF). ORF nhỏ sẽ mã hóa cho protein không cấu trúc VP5, không cần thiết cho quá trình sao chép virus in vitro nhưng lại quan trọng đối với khả năng gây bệnh của virus (Mundt et al., 1997; Yao et al., 1998). ORF lớn hơn mã hóa cho 1 polyprotein 110 kDa, tự xúc tác phân cắt hình thành 3 loại polipeptide: pVP2 (48 kDa), VP3 (32 kDa) và VP4 (28 kDa). VP4, một loại enzyme protease phân cắt serine-lysine (Birghan et al., 2000), nó còn tham gia quá trình tự tách RNA dư thừa (Lejal et al., 2000; Sanchez & Rodriguez, 1999).pVP2 sẽ được tách thêm những RNA dư thừa tại những Carbon cuối cùng để trở thành VP2 (40 kDa) (Da Costa et al., 2002; Lejal et al., 2000). VP2 và VP3 là những protein cấu trúc. Trong đó, VP2 chứa những vị trí kháng nguyên quan trọng và hệ thống đáp ứng miễn dịch (Heine and Boyle, 1993). 1. Virus Gumboro (IBDV):Sức đề kháng: 	IBDV có sức đề kháng cao với các tác nhân lý, hóa và môi trường. Chịu đựng được pH từ 2-12 (Benton và cs, 1967). Ở 56oC, IBDV tồn tại trong 5h, ở 70oC thì bị tiêu diệt sau 30 phút, ở -50oC trong 18 tháng độc lực không suy giảm (Landgraf và cs, 1967). 	Trong chất thải, phân, nước tiểu,... IBDV vẫn giữ nguyên tính gây nhiễm và gây bệnh trong vòng ít nhất là 52 ngày. 	IBDV đề kháng hoàn toàn với ether, chloroform. Trong phenol 0.5% và timerosal 1.125% ở 50oC trong 1h, formalin 0.5% trong 6h, chloramin 0.5% trong 10 phút. Các hợp chất như: dẫn suất phenol, phức hợp iode, formol nồng độ cao, có thể diệt được IBDV. Chất chứa mầm bệnh: thận và túi Fabricius, nơi chứa nhiều virus nhất. Ngoài ra, trong các chất tiết, thức ăn, nước uống, chất độn chuồng... cũng chứa virus. Đường xâm nhiễm: trong tự nhiên, lây truyền qua đường tiêu hóa là phổ biến nhất, việc lây nhiễm qua không khí ít quan trọng. Trong phòng thí nghiệm, có thể dùng đường mũi và mắt. Sự lan truyền: 	Bệnh có thể truyền ngang từ gà ốm sang gà khỏe qua thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi,... 	Bệnh mang tính phức tạp trong đường lây lan do sức chịu đựng của virus trong môi trường ở nhiệt độ cao, cũng như với một số hóa chất sát trùng. 2. Bệnh Gumboro2.1. Sơ lược về túi Fabricius	 2.1. Sơ lược về túi FabriciusTúi Fabricius là cơ quan dạng lympho, nằm gần hậu môn. Trong quá trình phát triển của bào thai, nó xuất hiện sau tuyến ức và giống như tuyến ức, túi Fabricius có cấu trúc lympho biểu mô.Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho trung ương, quá trình biệt hóa trong túi diễn ra không bị ảnh hưởng bởi kích thích kháng nguyên từ bên ngoài. Túi Fabricius nhỏ đi rất sớm: gà khoảng tháng thứ 4 (tuổi dậy thì), nó bắt đầu teo và tới tháng 11-12 thì mất hẳn. Chia túi ra thành các đơn vị cấu trúc gọi là các nang (Foliculum). Mỗi nang gồm có một vùng vỏ giàu lympho bào và một vùng tủy ít tế bào hơn nhưng có chứa tương bào. Đây còn là nơi biệt hóa dòng lympho B. 2.2. Lịch sử phát hiệnNăm 1962, Cosgrove đã phát hiện và mô tả một bệnh mới, xuất hiện ở thành phố Gumboro, vùng Dalaware ở Hoa Kỳ. Bệnh thường thấy trên gà con với bệnh tích thường gặp chủ yếu ở thận và túi Fabricius. Lúc đầu, người ta cho rằng, bệnh là biến thể của bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) vì bệnh tích ở thận tương đối giống nhau. Sau này, Winterfield và Hitchner đã chứng minh rằng những con gà đã miễn dịch với IB rồi vẫn nhiễm bệnh viêm túi Fabricius. Cuối năm 1962, Winterfield đã phân lập được từ phôi trứng tác nhân gây bệnh truyền nhiễm ở gà (bệnh tích ở túi Fabricius và thận). Năm 1986-1987, lần đầu tiên những dòng biến thể của IBDV được công bố. Năm 1987, sự nguy hiểm của IBDV lần đầu tiên được công bố tại Belgium và The Netherlands. Năm 1970, Hitchner đề nghị tên chính thức cho bệnh này là Infectious Bursal Disease (IBD) hay còn gọi là Gumboro. Virus gây bệnh là Infectious Bursal Disease Virus (IBDV). 2.3. Cơ chế 2.4. Triệu chứng Thời gian ủ bệnh ngắn 2-3 ngày.  Hình 3.1: Gà bệnh nằm ủ rũ, xù lông. Hình 3.2: Gà bệnh tiêu chảy phân loãng trắng.2.5. Bệnh tích 	- Xác chết khô, lông xơ xác, chân khô.  - Cơ đùi, cơ ngực, cơ cánh xuất huyết đỏ thành vệt hoặc thâm đen.  - Mổ khám túi Fabricicus sưng to, đỏ, có xuất huyết tấm tấm hoặc cả đám, thận sưng nhạt màu. Xuất huyết trên niêm mạc dạ dày tuyến (chổ tiếp giáp giữa mề và tiền mề), ruột sưng to có nhiều dịch nhầy bên trong.- Nếu gà nhiễm bệnh đến ngày thứ  5,6,7 thì túi Fabricius nhỏ lại, đến ngày thứ  8 thì chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban đầu.Hình 3.3: Túi Fabricius sưng to, đỏ, xuất huyết lấm tấmHình 3.4: Cơ đùi xuất huyết thành từng vệt.Hình 3.5: Xuất huyết trên niêm mạc dạ dày tuyến (chổ tiếp giáp giữa mề và tiền mề).3. Các phương pháp chẩn đoán virus Gumboro 3.1. RT-PCR RT-PCR được tiến hành trong 3 bước: B1: Ly trích acid nucleic từ mẫu nghiên cứu. B2: thực hiện phiên mã ngược RNA IBDV thành cDNA. B3: khuyếch đại cDNA thu được bằng PCR. Chọn những mồi oligonucleotide trình tự ngắn bổ sung với trình tự nucleotide đặc hiệu virus. Những vùng khác nhau của bộ gen sẽ được khuyếch đại phụ thuộc vào sự định vị từ những primer được chọn. Sự khuyếch đại gen mã hoá protein vỏ bên ngoài (protein capsid outer). 3.1. RT-PCR Ly trích acid nucleic: Bộ gene RNA IBDV chuỗi đôi (dsRNA) kháng sự phân huỷ bởi enzyme RNase. Sự ly trích RNA được tiến hành một cách cẩn thận: sử dụng găng tay, những tác nhân không có RNase và phòng thí nghiệm nhân tạo. RNA IBDV có thể được ly trích từ những mô nhiễm bằng cách sử dụng một vài bộ kit có sẵn. Bằng cách khác RNA IBDV có thể được ly trích bằng cách Bổ sung 1% SDS (sodium dodecyl sulphate) và 1mg/ml protein K đối với 700 μl dịch huyền phù virus (như dịch đồng nhất bìu). Ủ ấm khoảng 60 phút ở 370C. Acid nucleic được thu bằng cách sử dụng protocol chuẩn cho việc ly trích phenol/chloroform ( chú ý: phenol là một chất độc và nên được xử lý và loại bỏ sau đó). Acid nucleic được thu hoạch từ giai đoạn dịch cuối cùng bằng việc kết tủa ethanol và được giữ ở trong nước cất không có RNase hoặc dung dịch đệm bền. RNA pha loãng nước nên được giữ lạnh ở nhiệt độ dưới -200C cho đến khi sử dụng. Sự phiên mã ngược ( Reverse transscription) 	Dung dịch cDNA thu được sau bước RT nên được giữ lạnh ở < -20oC. Việc trì hoãn bước PCR vài tuần sau khi tổng hợp cDNA có thể là nguyên nhân gây ra kết quả PCR âm tính giả. PCR 	Cặp mồi U3/L3 được dùng để khuyếch đại gen VP2 thuộc dòng IBDV serotype 1 đã được thiết kế: Upper U3: 5'-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GCA-TGC-GGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3' Lower L3: 5'-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-GAA-TTC-GAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTT-TC-3' Bước biến tính lần cuối với 35 chu kỳ (mỗi một chu kỳ gồm một bước biến tính, một bước bắt cặp và một bước kéo dài). Đối với cặp mồi U3/L3, trong một chu kỳ, biến tính ở 950C/30 giây và bắt cặp ở 640C/ 45 giây (nhiệt độ biến tính được điều chỉnh thích ứng nếu những mồi khác được sử dụng). Sự phát hiện có thể được tiến hành bằng điện di với sản phẩm PCR và marker trọng lượng phân tử DNA trong gel agarose 1% nhuộm với ethidium bromide.Ưu điểm: 	Phát hiện nhanh, sớm, lượng mẫu dùng để phát hiện đòi hỏi không nhiều.Nhược điểm:	Ba bước phản ứng PCR phải được tiến hành đối với từng mẫu cDNA (tinh sạch, cDNA pha loãng 10-100 fold) để tránh những kết quả âm tính. 	Mỗi phản ứng PCR phải có phản ứng đối chứng âm và dương. 	Việc trì hoãn PCR khoảng một vài tuần sau bước RT có thể gây ra kết quả PCR âm tính giả. 4. RFLP Những enzyme cắt giới hạn khác nhau đã được sử dụng cho RFLP của IBDV như BstNI hoặc EcoRII, Sty1, DraI, SspI, SacI, SauAI hoặc NboI, StuI HaeIII, TaqI và BspMI, là tất cả hiện nay được sử dụng kết hợp hoặc sử dụng riêng rẽ ( Jackwood và Jackwood, 1997; Jackwood và Neilsen, 1997; Dormitorio và cộng sự, 1997; Jackwood và Sommer, 1998, 1999; Banda và cộng sự, 2001). RFLP đã thành công trong việc tìm vùng biến đổi của gen VP2 trên IBDV. RNA của IBDV sau khi được chiết tách và thực hiện phản ứng RT-PCR sẽ thu được sản phẩm 743bp. Sản phẩm 743bp này còn được gọi là 700+RT-PCR. Phân tích RT/PCR-RFLP sản phẩm 743 bp về sự hiện diện và vùng đa dạng của vị trí cắt giới hạn BstNI hoặc MboI bằng cách so sánh với kích thước những đoạn giới hạn trong kết quả (jackwood và Sommer, 1997). Giữa chúng, BstNI và MboI xuất hiện để cung cấp sự nhận biết đúng đắn nhất cho sự phân lập IBDV ( Jackwood và Sommer, 1998). Jackwood và Sommer (1998) đã báo cáo 1 vài đáp ứng RFLP đạt được khi sử dụng enzyme BstNI so với enzyme MboI. Sử dụng MboI trong phân tích giới hạn để phân tích đa dạng di truyền giữa các dòng IBDV phân lập. Một lượng sản phẩm 700+RT-PCR được phân cắt bởi BstNI và 1 lượng khác được phân cắt bởi MboI. Sau đó profile RFLP của những đoạn giới hạn BstNI và MboI đuợc xác định sự khác nhau trên gel agarose, tốt nhất là gel 2.5% agarose. Proflie tốt nhất nên được xác định bằng cách nhuộm màu gel với thuốc nhuộm SYBR.TM. green I. Kết quả cắt của ezyme cắt giới hạn MboI và BstNI:EnzymeNhóm virusĐọan cDNA cắt giới hạnMboIBstNI1229 &b 234 119, 424, 172 2229 & 403 119, 424, 172 3229 & 362 119, 172, 154, 139 4229 & 362 119, 209, 172, 154 5229 & 480 119, 424, 172 6229 & 362 119, 424, 172 III. KẾT LUẬNGumboro, một bệnh có tốc độ lây nhiễm cao, có khả năng gây chết đồng loạt ở gia cầm. Gây thiệt hại nhiều cho ngành kinh tế nông nghiệp gia cầm không chỉ ở nước ta mà trên toàn thế giới. Ngày nay, cùng với các kỹ thuật gen, việc chẩn đoán, điều trị bệnh Gumboro đã được nghiên cứu và phát triển rộng rãi. Một vài kỹ thuật điển hình đã được sử dụng như: 	-RT-PCR 	-RFLP Các kỹ thuật gen này đã giúp chẩn đoán bệnh một cách nhanh chóng, với độ nhạy và độ chính xác cao.IV. TÀI LIỆU THAM KHẢOCông nghệ sinh học trong thú y – Nguyễn Ngọc Hảiưviênkhoahoc.com Cảm ơn thầy và các bạn đã chú ý theo dõi!