Tiểu luận Chẩn đoán virus lở mồm long móng bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào - Nguyễn Duy Lan

CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀOGiảng viên hướng dẫn:PGS. TS. Nguyễn Ngọc HảiSinh viên thực hiện:Nguyễn Duy Lan-06126067TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCMBỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌCLỚP DH06SH1NỘI DUNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ2. TỔNG QUAN	2.1 Giới thiệu bệnh lở mồm long móng	2.2 Giới thiệu virus lở mồm long móng	2.3 Đặc điểm dịch tễ học	2.4 Chẩn đoán virus lở mồm long móng bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào3. KẾT LUẬN4. TÀI LIỆU THAM KHẢO21. ĐẶT VẤN ĐỀBệnh lở mồm long móng (tiếng Anh: Foot-and-mouth disease, viết tắt FMD; tiếng Latin: Aphtae epizooticae), là một loại bệnh rất nguy hiểm do virus gây ra trên động vật móng guốc chẵn như heo, bò, trâu, hươu, dê... Bệnh này rất nguy hiểm vì bệnh lây lan rất nhanh trên diện rộng qua nhiều con đường khác nhau như tiếp xúc trực tiếp giữa động vật với nhau, truyền qua không khí... 3Mặc dù tỷ lệ gây chết chỉ cao trên heo con, bê nghé; còn trên các gia súc lứa và trưởng thành nếu được điều trị tốt thú có thể phục hồi sau 1-2 tuần, song thiệt hại về kinh tế rất lớn, do tính lây lan quá mạnh. Vì hiện nay những nước đã khống chế được bệnh rất hạn chế nhập khẩu gia súc, hoặc cácsản phẩm động vật từ các nước chưa khống chế được bệnh LMLM, đây chính là mối nguy hại cho đầu ra của ngành chăn nuôi, cũng như sự phát triển của nó.42. TỔNG QUAN2.1 Bệnh lở mồm long móng2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh1929: Những trường hợp cuối cùng ở Mỹ1953: Những trường hợp cuối cùng ở Canada và Mexico1993: Italy1997: Đài Loan (Taiwan)2001: Anh (United Kingdom)5Vài đợt dịch khác trong những năm 1967-1968 and 1981. Dịch bệnh lở mồm long móng đã xảy ra ở nhiều châu lục như châu Á, châu Phi, châu Âu và Nam Mỹ. (7)Ở châu Âu, bệnh đã bùng phát tại Anh, Hà Lan và Pháp vào năm 2001. Hàng triệu gia súc bị thiêu hủy gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi nói riêng và nền kinh tế các quốc gia này nói chung.6Các đợt dịch FMD năm 2003 72.1.2 Phân bố bệnh trên thế giới82.2 Giới thiệu về virus lở mồm long móngFMD Virus thuộc họ Picorna Viridae có 7 type (O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1, mỗi type còn có nhiều phụ type, thí dụ như các tiểu type O1, O2, O3 , A1, A2, A3, C1, C2, C3  căn cứ vào sự khác biệt về gen và cấu trúc kháng nguyên) các type khi giám định huyết thanh đều không có miễn dịch chéo, và trong các ổ dịch, động vật có thể mắc bệnh do một hoặc cùng một lúc nhiều type huyết thanh. Serotype O là serotype phổ biến trên thế giới hơn cả. 9Lpro protein 3A 102.3 Đặc điểm dịch tễ họcTrong thiên nhiên: trâu bò mẫn cảm với bệnh nhất, rồi mới đến heo, dê, cừu, các loài dã thú như hươu, nai, heo rừngLoài ăn thịt và người ít nhạy cảm với bệnh, loài một móng như ngựa, gia cầm, chim không mắc bệnh.Chất chứa virus: Mụn nước là nơi tập trung nhiều virus nhất, đặc biệt là mụn nước sơ phát mới hình thành.11Trên cơ thể thú ngoài mụn nước, các chất bài tiết như nước bọt, nước tiểu, phân, sữa, nước mắt, nước mũi cũng chưá nhiều virus. Số lượng virus trong chất thải này có thể thay đổi tuỳ thuộc vào thời gian mắc bệnh, thường rất cao trong ngày đầu và giảm dần. Sau 2 tuần hầu như không còn thấy virus trong các chất bài tiết. Trung bình 1 con heo mắc bệnh sẽ bài thải khoảng 4 tỉ virus mỗi ngày (gấp 3.000 lần trên bò).Trên thú chết hoặc bị giết mổ, virus tập trung nhiều trong máu, bắp cơ và ở các nội tạng.Lượng virus trong bắp cơ cao hơn trong máu và có mặt đến ngày thứ 7 sau khi mắc bệnh.12Đường xâm nhập chính là tiêu hoá, virus có thể vào cơ thể qua niêm mạc miệng, và niêm mạc ống tiêu hoá. Ngoài ra, các vết trầy ở da, đầu vú cũng là nơi virus xâm nhập vào cơ thể. Đường sinh dục và hô hấp được coi là đường xâm nhập phụ.Quá trình lây lan bệnh diễn ra theo các cách thức sau:+ Lây trực tiếp + Lây gián tiếp + Virus có thể theo gió phát tán ra không khí trong cự ly 10km.Đường xâm nhập và cách truyền bệnh13Cơ chế gây bệnh Thời gian nung bệnh trung bình 2-4 ngày, đôi khi kéo dài đến 7 ngày.Đầu tiên virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc miệng, niêm mạc ống tiêu hoá, qua thức ăn, nước uống hoặc các vết trầy ở bên ngoài cơ thể. Mụn mọc ở miệng, lưỡi gây cảm giác đau nhức Mụn nước ở móng chân thường bị nhiễm trùng do thú đi đứng trong phân, đất, vi trùng phụ nhiễm sẽ tấn công sâu vào các lớp bên dưới gây hư hại nặng tổ chức da ở gờ móng, làm móng dễ bị bong tróc. 14152.4 Chẩn đoán virus lở mồm long móng2.4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bàoGiới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy tế bào	Nuôi cấy tế bào là là đơn vị nuôi cấy nhỏ nhất, là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào ngoài cơ thể sống, các tế bào trong điều kiện phòng thí nghiệm vẫn tự phân chia, thực hiện đầy đủ các chức năng biến dưỡng và các chức năng chuyên biệt của tế bào. 16Các loại tế bào nuôi cấyTế bào biểu mô (Epithelial cells)Nguyên sợi bào (Firoblast cells)Tế bào cơ (Muscle cells)Tế bào thần kinh (Nerve cells)Tế bào lympho bàoTế bào bậc một (Primary cells) Tế bào bậc hai (Secondary cells) 17Một số phương tiện cần thiếtPhòng thí nghiệm: sạch, chiếu sáng tốt, ít người qua lạiTủ cấy vô trùng chuyên nuôi cấy tế bào (hệ thống vô trùng)Tủ ấm thường và tủ ấm CO2Tủ lạnh thường và tủ lạnh sâuBình nitơ lỏng để bảo quản tế bàoHệ thống cất nước hai lần hoặc hệ thống lọc loại trừ chất độc vô cơ và hữu cơHệ thống lọc vô trùng và hệ thống trypsin hoáDụng cụ thuỷ tinh và nhựa: đựng môi trường và nước cấtKính hiển vi soi ngượcMột số máy móc khác như : autoclave, máy đếm tế bào, máy chụp hình, máy ly tâm, ...18Môi trường và những yếu tố cần thiết cho nuôi cấyYêu cầu: tế bào trong ống nghiệp gần giống trong động vật sốngCác yếu tố quan trọngNền: tạo bề mặt đặc biệt để tế bào bámMôi trường: đủ dưỡng chất cho tế bào phát triển (Carbonhydrate, Glucose, Amino acid, muối đẳng trương, Bicarbonate, Vitamin, Hormone, Phenol Red, ...). Chất bổ sung vào môi trường : huyết thanh 10%Điều kiện nuôi cấyNhiệt độ: 37oC. Nhiệt độ thấp hơn 37oC, tỷ lệ phát triển giảm, tế bào chưa bị tổn thương. Nhiệt độ từ 39-40oC, tế bào bị phá huỷ. pH = 7,419Sự cấyĐưa tế bào vào môi trường nuôi cấy tiệt trùng.Mật độ lúc cấy 104- 105 tế bào tb/ml.Sau 3 – 4 ngày đạt 106 tế bào hoặc 105 tế bào/ cm2/bề mặt cứngSự sinh trưởng ngừng lại do giới hạn chất dinh dưỡng, tích tụ sản phẩm độc, thiếu bề mặt tăng trưởng (bề mặt cứng). Lúc này ta cần thay thế môi trường hoàn toàn hay một phần sau 2 ngày để đạt mật độ tối đa cao hơn.20Cách nhận biết sự phát triển của tế bàoTrực tiếp: đếm tế bào ít nhất một lần trong ngày, tại một thời điểm nhất định. Dùng buồng đếm hồng cầu, bổ sung Trypan Blue giúp đếm dễ dàng hơn. Ưu điểm : cùng lúc đếm được nhiều mẫu. Hạn chế : số mẫu ít, sai số khoảng 10%.Gián tiếp: xác định một sản phẩm nào đó trong tế bào để xác định sự phát triển của tế bào. Ví dụ: xác định protein, xác định DNA, xác định Glucose, ...21Chẩn đoán virus lở mồm long móng bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bàoChọn mẫu 	Lấy mẫu ở đường hô hấp, dịch họng, hay đường tiêu hoá, biểu mô nghi ngờ nhiễm virus. Thời gian lấy mẫu nên là lúc mới biểu hiện các triệu chứng, hay lúc mới chết, không nên lấy mẫu lúc con vật đã chết được một thời gian.Cách bảo quản 	Xét nghiệm chẩn đoán nhiễm virut phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của bệnh phẩm, vì vậy công tác thu thập và bảo quản mẫu bệnh phẩm phải đảm bảo:+ Đúng chủng loại + Đúng thời điểm + Đúng thao tác+ Bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm đúng cách.	22Vật liệu và phương phápDòng tế bào: Tế bào Baby hamster kidney (BHK), strain 21, clone 13Mẫu bệnh phẩmMôi trường: DMEM (4,500 mg/L D-glucose, L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate) bổ sung 5% foetal calf serum (FCS)Penicillin G(100 U/ml) and streptomycin (100 μg/ml).pH được điều chỉnh bằng lượng bicarbonate23Cách xử lý mẫuLấy mẫu bệnh phẩm: cắt mô nghi ngờ, lấy tương ứng 2g (đủ để tạo huyễn dịch 10-20%). Lấy 1g huyễn dịch cho vào 9ml nước muối sinh lý- Nghiền mẫu, sử dụng cát hay mảnh thuỷ tinh để nghiền nhuyễn hơn, sau đó cho nước muối sinh lý vào, bảo quản trong tủ lạnh- Lọc lấy nước trong hay ly tâm, cho vào lọ, dùng kháng sinh (penicillin và streptomycin) để diệt khuẩn. Sau 30 phút – 1 giờ, lọc qua lưới có đường kính 0,2 μm.- Đưa vào môi trường nuôi cấy tế bào.Khi tế bào một lớp được tạo thành (phủ khoảng 70% là có thể nuôi cấy), đưa mẫu bệnh phẩm vào từ từ, tránh làm bong lớp tế bào ra.24Kết quảĐể xác định virus có gây bệnh tích tế bào hay không, dùng phương pháp nhuộm tế bào (dùng kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang), thực hiện trực tiếp trên môi trường tế bào.Nếu có virus, khi quan sát trên kính hiển vi, do virus bắt màu sẽ thấy phát huỳnh quang màu xanh.25KẾT LUẬNBệnh lở mồm long móng là một bệnh truyền nhiễm rất nguy hiểm, lây lan nhanh trên gia súc thuộc bộ guốc chẵn. Bệnh là mối nguy hại lớn đối với ngành chăn nuôi gia súc trong nước, ảnh hưởng lớn đến lợi ích kinh tế, xã hội, môi trường. Bệnh có triệu chứng lâm sàng khó phân biệt sớm được với các bệnh mụn nước khác như: Swine Vesicular Disease (SVD), Vesicular Stomatitis (VS), and Vesicular Exanthema (VE). (15). Do đó, việc chẩn đoán bệnh nhanh và chính xác là rất cần thiết, nhằm có biện pháp phòng trừ thích hợp, đồng thời giảm mức độ thiệt hại do lây nhiễm bệnh xuống mức thấp nhất. Nuôi cấy tế bào có độ chính xác cao, là phương pháp duy nhất thu nhận virus cho các nghiên cứu tiếp theo, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi người thao tác có chuyên môn cao, cần nhiều thiết bị hiện đại, ...26TÀI LIỆU THAM KHẢOMarvin J. Grubman* and Barry Baxt. Foot-and-Mouth Disease. Plum Island Animal Disease Center, USDA, Agricultural Research Service, North Atlantic Area, Greenport, New York.Rueckert, R. R., and E. Wimmer. 1984. Systematic nomenclature of picornavirus proteins. J. Virol. 50:957-959.Nguyễn Ngọc Hải. Công nghệ sinh học trong thú y. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 2007. www.lrc.ctu.edu.vn/pdoc/35/37lomomlogmog.pdf ---Danelle Bickett-Weddle, DVM. Foot and Mouth Desease. Center for Food Security and Public Health Iowa State University – 2004.27