Tiểu luận Ứng dụng kĩ thuật multiplex – PCR để phát hiện một số gen độc lực của nhóm E.coli sản sinh độc tố Shiga (STEC) phân lập được từ phân bò, heo tiêu chảy - Lê Hoài Lâm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCMBỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌCTiểu luận: ỨNG DỤNG KĨ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA NHÓM E. COLI SẢN SINH ĐỘC TỐ SHIGA (STEC) PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ PHÂN BÒ, HEO TIÊU CHẢY.GIẢNG VIÊN: NGUYỄN NGỌC HẢISINH VIÊN: LÊ HOÀI LÂM 	 DH06SH 06126068Phần 1: Mở đầu1.1. Đặt vấn đềEscherichia coli (E. coli) là một trong những vi khuẩn phổ biến trong đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng.Dựa vào đặc điểm gây bệnh, người ta chia E. coli thành nhiều nhóm. Mỗi nhóm đều có những yếu tố độc lực khác nhau và được quy định bởi những gen độc lực khác nhau(ehxA, stx1, stx2, và uid của nhóm STEC, gen eae của nhóm STEC và EPEC).Do vậy, việc xác định các gen độc lực của E. coli trong phân gia súc bình thường hoặc tiêu chảy là cần thiết.Vì vậy, đề tài tiến hành sử dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện đồng thời các gen độc: stx1, stx2, eae, ehxA, và uid của E. coli phân lập được từ phân bò, heo tiêu chảy 1.2. Mục tiêu – yêu cầu 1.2.1. Mục tiêu Phát hiện gen độc lực stx1, stx2, eae, ehxA và uid của E. coli, đặc biệt là nhóm STEC.1.2.2. Yêu cầu- Phân lập được E. coli từ phân, thịt trên một số loại môi trường chọn lọc (MAC, SMAC, CT - SMAC).- Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR phát hiện một số gen độc lực của E. coli phân lập được.Phần 2. Tổng Quan2.1. Vi khuẩn E. coli2.1.1.Đặc điểm sinh học Phân loại: vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia.Hình thái: là trực khuẩn, gram âm, di động, không bào tử, giáp mô, có lông tơ xung quanh.Kích thước: khoảng 0,5 m  2 – 3 m.Đặc tính nuôi cấy: vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi.Đặc tính sinh hóa: E. coli lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrate thành nitrite.2.1.2. Phân loại E. coli E. coli sinh độc tố Shiga (STEC- Shiga toxigenic E. coli hay VTEC- Verotoxigenic E. coli và EHEC Enterohemorrhagic E. coli ).E. coli gây bệnh đường ruột (EPEC- Enteropathogenic E. coli).E. coli sinh độc tố đường ruột (ETEC- Enterotoxigenic E. coli).E. coli bám dính kết tập ở ruột (EAEC hay EaggEC- Enteroaggregative E. coli).E. coli tấn công hay xâm lấn đường ruột (EIEC- Enteroinvasive E. coli).2.2. Shiga toxigenic E. coli (STEC)2.2.1. Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC 2.2.1.1. Độc tố Shiga (Stx) Shigella dysenteriae do Kiyoshi Shiga phát hiện năm 1897, sản sinh độc tố thường được gọi là Shiga.Stx là một ngoại độc tố không bền với nhiệt, tác động lên ruột lẫn hệ thần kinh trung ương.Cấu trúc và tổ chức các gen stx: họ độc tố Stx ở STEC gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2 2.2.1.2. Enterohemolysin (haemolysin)Enterohemolysin tồn tại ở nhiều dạng (,  và ) trong các E. coli xâm lấn hay sinh độc tố đường ruột (Manil và Daube, 2005).Enterohemolysin thuộc nhóm độc tố RTX (Repeats in toxin).RTX hiện diện trong E. coli gây bệnh đường huyết niệu (uropathogenic E. coli), Pasteurella haemolytica và các tác nhân khác gây bệnh cho người, động vật (Bauer và Welch, 1996).Haemolysin do gen ehxA nằm trên plasmid 60 MDa pO157 mã hóa 2.2.1.3. Yếu tố bám dínhYếu tố bám dính của STEC đã được chứng minh đóng vai trò quan trọng trong sự định vị vi khuẩn ở ruột.Ngoài ra còn có các yếu tố liên quan đến sự bám dính của các tác nhân khác gây bệnh đường ruột bao gồm fimbriae, OMPs (outer membrance proteins) và LPS (lipopolysaccharide). 2.3. Serotype O157:H7Nhạy cảm với nhiệt độ, không phát triển được ở nhiệt độ 44 – 44,50C (Jay, 2000). Không có khả năng lên men D-sorbitol trong 24 giờ. Trong khi đó có đến 75 – 94% những dòng E. coli khác lại lên men sorbitol.Không biểu hiện hoạt tính -D-glucuronidase (GUD).Kháng kháng sinh: cefixime, sulfivoxazol, tetracycline, streptomycine và các tác nhân ức chế khác như potassium tellurite (ức chế các VSV thông thường) (Kim và ctv, 1994).Tính kháng acid (acid resistance - AR) đóng vai trò quan trọng cho khả năng sống sót của vi khuẩn trong môi trường acid.Khả năng chịu mặn: Trong canh khuẩn 4,5% NaCl, vi khuẩn tăng số lượng gấp 3 lần khi tăng thời gian lên 2 lần, và không phát triển khi 8,5% NaCl (Jay, 2000).2.4. Kỹ thuật PCR2.4.1. Khái niệmPhương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 đã và đang được sử dụng rộng rãi. Đây là một phương pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào. 2.4.2. Nguyên tắcPhản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA, là phản ứng gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm 3 bước:Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ thường sử dụng là 94 – 950C.Bước 2: là giai đoạn lai (hybridization), nhiệt độ dao động trong khoảng 400C – 700C.Bước 3: là giai đoạn kéo dài (elongation hay extension), thường ở nhiệt độ 720C.2.4.3. Các thành phần cần thiết của phản ứng PCR- Dung dịch đệm: quan trọng nhất là ion Mg2+. - Các dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA. - Mồi (primer): là những oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. - Taq polymerase: là DNA polymerase chịu nhiệt, được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+ .- DNA mẫu xét nghiệm.2.4.4. Phân tích kết quả PCR Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di.Sau khi điện di, các DNA trong gel sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide.Và để ước lượng kích thước DNA trên gel, người ta sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử “ (molecular weight marker - MWN) hay còn gọi DNA ladder (thang chuẩn).2.4.5. Multiplex – PCRLà phản ứng PCR sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi để khuếch đại nhiều đoạn DNA trong cùng một phản ứng PCR.Phương pháp này được thử nghiệm thành công vào năm 1988 và được áp dụng vào nhiều công trình nghiên cứu.Phần 3. Nội Dung Và Phương Pháp Tiến Hành3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1. Thời gianĐề tài được thực hiện từ ngày 1/03/2005 đến ngày 30/07/2005.3.1.2. Địa điểmMẫu phân được lấy từ các hộ hoặc trại chăn nuôi ở Đồng Nai, TP. HCM và Tiền Giang.Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại Phòng thực hành Kiểm nghiệm thú sản và Môi trường sức khỏe vật nuôi, Khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.Xác định các gen độc lực của E. coli được thực hiện tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.3.2. Nội dung thực hiệnPhân lập vi khuẩn E. coli trong phân bò, heo.Li trích DNA của E. coli phân lập được. Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện các gen eae, ehxA, stx1, stx2 và uid của E. coli. 3.3. Phương pháp thực hiện3.3.1. Vật liệu thí nghiệm cơ bảnDụng cụ lấy mẫu: tăm bông, đèn cồn, chai cồn, môi trường chuyên chở Carry Blair, ...Mẫu vi khuẩn đối chứng dương: EDL933. 3.3.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫuDùng muỗng vô trùng lấy phần giữa cục phân (khoảng 10 -12 g) mà bò, heo vừa mới thải ra, cho vào túi nylon vô trùng, buộc kỹ, bảo quản 4 – 80C và chuyển về phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Phân tiêu chảy có thể được lấy bằng cách dùng tăm bông, cho vào môi trường chuyên chở Carry Blair, chuyển về phòng thí nghiệm.3.3.2. Nuôi cấy và phân lập E. coli 3.3.2.1. Môi trường nuôi cấyMôi trường tăng sinh: Sử dụng môi trường tăng sinh pepton đệm có bổ sung kháng sinh cefixime (0,0125mg/L) và vancomycin (8mg/L) (FDA, 2002).Môi trường phân lập: Để xác định môi trường nào cho kết quả tốt khi phân lập E. coli nhóm STEC mang gen độc lực, ta sử dụng 3 loại môi trường MAC, SMAC và CT - SMAC 3.3.2.2. Qui trình phân lập, định tínhNuôi cấy và phân lập: 	- E. coli được ria trực tiếp trên môi trường thạch đĩa MAC và SMAC, ủ 370C trong 18 - 24giờ.	- Chọn và thu khuẩn lạc điển hình, giữ gốc.	- Li trích DNA rồi thực hiện multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực. Chọn khuẩn lạc E. Coli: Trên từng loại môi trường MAC, SMAC, CT - SMAC, chọn ngẫu nhiên 6 – 10 khuẩn lạc rời rạc đại diện Thử sinh hóa: Sử dụng nghiệm pháp IMViC (FAO, 1992) cho từng khuẩn lạc riêng lẻ thuộc nhóm đó để xác định E. coli.3.3.3. Li trích DNAThu khoảng 6 -10 khuẩn lạc E. coli trên môi trường thạch (MAC hoặc SMAC hoặc CT - SMAC hoặc NA) cho vào eppendorf đựng sẵn 0,4 - 0,5 ml nước cất hai lần vô trùng, đun sôi 10 phút, lấy ra và chuyển vào tủ âm -700C giữ trong 10 phút.Sau khi rã đông hoàn toàn, ly tâm 13000 vòng trong 3 phút.Để yên và hút phần dung dịch ở phía trên làm DNA khuôn mẫu (DNA xét nghiệm).3.3.4. Qui trình multiplex – PCR Trình tự các đoạn mồiCác thành phần của phản ứng PCR: (Feng và Monday, 2000)Mỗi phản ứng là 25 l, gồm các thành phần sau: 	- PCR buffer 1,1X; 	- MgCl2 3mM;	- Mỗi dNTP 200 M; mỗi loại primer 7,5 pmol; Taq 2,5 l;	- DNA 2 l; 	- Nước cất vừa đủ 25 l.Chu kỳ nhiệt (Feng và Monday, 2000)	- Tiền biến tính 950C/5 phút	- Biến tính 940C/1 phút	- Ủ bắt cặp 610C/1 phút 25 chu kỳ	- Kéo dài 720C/1 phút	- Kéo dài chuỗi 720C/7 phút3.3.5 Điện di và đọc kết quảLấy 10 l sản phẩm PCR cùng với 2 l loading dye được điện di trên gel agarose 1,6% trong TBE. Thang chuẩn (ladder) cũng được điện di đồng thời. Thời gian điện di 30 – 35 phút ở 90 V và 250 mA.Sau khi điện di, gel được ngâm trong dung dịch ethidium bromide khoảng 30 phút. Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UV bằng máy chụp gel (phần mềm Quality One 2000, Bio-Rad). Các sản phẩm PCR được xác định bằng cách so với các băng của đối chứng dương và thang ladder 100 bp. Phần 4. Kết Quả Và Thảo Luận4.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu chảyKết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trong từng nhóm khuẩn lạc phân lập được từ phân bò tiêu chảy được ghi nhận ở bảng 4.1.Trong 10 mẫu phân bò tiêu chảy có 5/10 mẫu (50%) phát hiện E. coli mang gen độc lực thuộc nhóm stx. 	- Gen ehxA được phát hiện với tỉ lệ cao nhất (100%); 	- Kế đến là stx2 (4/10 mẫu – 40%), stx1 (1/10 mẫu – 10%); 	- Và không phát hiện được gen uid và eae.→ Như vậy, phân bò tiêu chảy là nguồn lưu cữu STEC mang gen stx2. Theo Paton và Paton (1998) đã nhận định rằng những dòng STEC mang stx2 thì thường liên kết bệnh nặng hơn so với những dòng STEC chỉ mang stx1.4.2. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo con cai sữa tiêu chảyKết quả phát hiện gen độc lực của E. coli từ 9 mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy được trình bày ở bảng 4.3.Bảng 4.3 cho ta thấy có 4/9 mẫu (44,4%) mang gen stx, trong đó có: 	- ¼ mẫu mang gen stx1 (25%); 	- ¾ mẫu mang gen stx2 (75%); 	- Không có mẫu nào mang gen uid và eae, 9/9 mẫu (100%) mang gen ehxA. →Blanco và ctv (1997) kết luận rằng gen stx1 thường hiện diện tỉ lệ thấp trên heo.Có 6/25 (24%) nhóm khuẩn lạc được phân lập từ 9 mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy, cùng lúc mang 2 gen độc lực (ehxA và stx1 hoặc ehxA và stx2). Điều này sẽ làm tăng khả năng gây bệnh của E. coli đối với heo. Người ở mọi lứa tuổi đều có thể bị nhiễm STEC với những serotype khác nhau (Beutin và ctv, 1995). 4.3. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu chảyTrong 8 mẫu phân bê tiêu chảy, có 8/8 mẫu (100%) phát hiện được E. coli mang ít nhất 1 gen độc lực, có mẫu phát hiện E. coli mang 2 -3 gen độc lực. Gen ehxA được phát hiện với tỉ lệ cao nhất (8/8 mẫu – 100%), kế đến là gen stx1 (7/8 mẫu – 87,5%), gen stx2 (1/8 mẫu – 12,5%) . Trong khi đó, không phát hiện được gen uid trong bất kì mẫu nào. →Smith và Scotland (1988) và Gyles (1992) cho rằng nhiều loại gia súc mang STEC không có biểu hiện triệu chứng, một vài dòng STEC có khả năng gây tiêu chảy cho bò, đặc biệt là bê. Và 7/8 (87,5%) mẫu đều hiện diện cả gen ehxA và stx.Theo Barrett và ctv (1992), độc tố Stx là điều kiện cần chứ chưa phải là điều kiện đủ để gây bệnh tiêu chảy trên vật nuôi. →Do đó, sự xuất hiện đồng thời các gen ehxA và stx có thể góp phần giải thích lý do tiêu chảy trên bê. Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR