Tuyển chọn và tối ưu hóa vi khuẩn kỵ khí sinh tổng hợp enzyme cellulase trên cơ chất bột giấy

nấm men đã chọn, rồi đem đi ủ nuôi với các 
điều kiện đã chọn ở các thí nghiệm trên. Sau đó, hoạt tính enzyme thô và hàm 
lượng protein sinh ra cũng được xác định như đã trình bày ở trên. 
2.3 Bố trí thí nghiệm và phân tích thống kê 
Tất cả số liệu thu được trong đề tài được phân tích thống kê ANOVA (Analysis of 
Variance) dưới bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely 
Randomized Design). Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Giá trị trung bình được 
so sánh bằng việc kiểm tra thống kê khác biệt có ý nghĩa LSDT (Least Significant 
Difference Test) bằng phần mềm Statgraphic version 3.0. 
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1 Tuyển chọn dòng vi khuẩn kỵ khí có khả năng sinh tổng hợp cellulase 
mạnh nhất 
Hình 1 thể hiện khả năng sinh enzyme cellulase của 37 dòng vi khuẩn kỵ khí thông 
qua việc đo đường kính vòng tròn thủy phân. Sau 5 ngày ủ ở nhiệt độ 300C trên 
môi trường thạch, ngoại trừ một số dòng vi khuẩn như 16, 26, 65 là không thể hiện 
hoạt tính cellulase, các dòng vi khuẩn còn lại trong bộ giống đều thể hiện hoạt tính. 
Nhìn chung, đa số các dòng vi khuẩn này đều thể hiện hoạt tính khá thấp với sự 
biểu hiện đường kính vòng tròn thủy phân đều dưới 10 mm. Chẳng hạn như các 
dòng vi khuẩn số 1, 3, 15, 17, 27, 32, 64, 80, 83... tương ứng các giá trị đạt được là 
9,7; 8,3; 6,0; 5,5; 1,3; 7,7; 8,3; 2,2; 8,7 mm... Bên cạnh đó, một số dòng vi khuẩn 
sinh tổng hợp cellulase khá tốt với đường kính vòng tròn thủy phân cao hơn 10 
mm như dòng 2, 13, 84, 85...Trong đó, hoạt tính được biểu hiện khá mạnh ở các 
dòng vi khuẩn 44, 76, 39 tương ứng với các giá trị đường kính vòng tròn thủy phân 
là 13,8; 15,7; 17,7 mm, đặc biệt hoạt tính cellulase sinh ra cao nhất ở dòng vi 
khuẩn được ký hiệu là 52 tương ứng với giá trị đường kính vòng tròn thủy phân là 
20,5 mm. Như vậy dòng vi khuẩn ký hiệu 52 được chọn để tiến hành các thí 
nghiệm tiếp theo. 
Tạp chí Khoa học 2012:22b 43-53 Trường Đại học Cần Thơ 
 47
0 5 10 15 20 25
VK 1
VK 2
VK 3
VK 4
VK 13
VK 15
VK 16
VK 17
VK 18
VK 20
VK 26
VK 27
VK 30
VK 31
VK 32
VK 33
VK 36
VK 37
VK 38
VK 39
VK 43
VK 44
VK 49
VK 52
VK 62
VK 63
VK 64
VK 65
VK 66
VK 67
VK 72
VK 75
VK 76
VK 80
VK 83
VK 84
VK 85
D
òn
g 
vi
 k
hu
ẩn
Đường kính vòng tròn thủy phân (mm)
9.7 gh
11.2 ef
8.3 hi
6.5 jk
12.3 e
6.0 kl
0.0 q
5.5 kl
3.2 no
5.3 kl
0.0 q
1.3 pq
5.3 kl
12.3 e
7.7 ij
9.5 gh
3.8 mn
6.7 jk
6.5 jk
17.7 b
12.5 de
13.8 d
10.3 fg
20.5 a
4.8 lm
9.3 gh
8.3 hi
0.0 q
7.8 ij
9.5 gh
10.3 fg
9.7 gh
15.7 c
2.2 op
8.7 hi
11.3 ef 
12.2 e
Hình 1: Đường kính vòng tròn thủy phân các dòng vi khuẩn đem khảo sát 
Ghi chú: Trong cùng một dòng vi khuẩn, các giá trị thu được đều đã được trừ đi đường kính lỗ đục và được xử 
lý thống kê sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ 5%. Số liệu là giá trị của 3 lần lặp lại. 
Tạp chí Khoa học 2012:22b 43-53 Trường Đại học Cần Thơ 
 48 
3.2 Ảnh hưởng của điều kiện pH và nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp 
cellulase của dòng vi khuẩn 52 
Hình 2 trình bày sự tương tác giữa pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng sinh 
tổng hợp cellulase của dòng vi khuẩn 52. Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng có sự 
tương tác ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của 
dòng vi khuẩn 52. Trong đó, tại các giá trị pH thấp (4 và 5) hoặc kiềm (10 và 11) 
thì dòng vi khuẩn không thể hiện hoạt tính cellulase ở tất cả các nhiệt độ sau 5 
ngày ủ. Việc sinh tổng hợp cellulase bắt đầu thể hiện ở pH 6 và quan sát khá rõ 
đường tròn thủy phân ở pH 7 và đạt giá trị cao nhất tại pH 8 và giảm nhẹ tại pH 9 
với sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% tại mọi nhiệt độ 
trong bố trí thí nghiệm. 
Về sự ảnh hưởng của nhiệt độ, sự thay đổi đường kính thủy phân cũng tương tự 
như với ảnh hưởng của giá trị pH. Giá trị trung bình đường kính vòng tròn thủy 
phân đạt cao nhất tại nhiệt độ 300C sau đó giảm dần ở các nhiệt độ còn lại với mọi 
giá trị pH thay đổi. Tuy nhiên, đặc biệt là tại nhiệt độ 400C, giá trị đường kính 
vòng tròn thủy phân ở giá trị pH 9 cao hơn của giá trị tối ưu pH 8 (tương ứng với 
giá trị 19,3 mm và 17,7 mm) trong khi đó tại các nhiệt độ khác thì đường kính 
vòng tròn thủy phân ở giá trị pH 8 luôn cao hơn của pH 9. 
0
5
10
15
20
25
30
35
4 5 6 7 8 9 10 11
Giá trị pH
Đư
ờn
g 
kí
nh
 v
òn
g 
tr
òn
 th
ủy
 p
hâ
n 
(m
m
)
30oC
35oC
40oC
45oC
50oC
Hình 2: Ảnh hưởng tương tác pH và nhiệt độ đến sự sinh tổng hợp cellulase của dòng vi 
khuẩn 52 
Tóm lại, kết quả thí nghiệm đã chỉ ra rằng có sự ảnh hưởng tương tác giữa nhân tố 
pH và nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của dòng vi khuẩn 52. Giá trị 
pH 8 và nhiệt độ là 300C được chọn là tối ưu cho việc sinh tổng hợp cellulase của 
dòng vi khuẩn (ứng với giá trị đường kính vòng tròn thủy phân là 30 mm) và được 
sử dụng bố trí cho các thí nghiệm tiếp theo. 
Kết quả của thí nghiệm này tương tự với một số nghiên cứu trên thế giới trong việc 
khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase của các 
dòng vi khuẩn. Sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và dinh dưỡng lên sự sinh 
trưởng và sinh tổng hợp cellulase của Bacillus alcalophilus S39 và Bacillus 
amyloliquefaciens C23 cũng đã được nghiên cứu (Abou–Taleb et al., 2009). Kết 
Tạp chí Khoa học 2012:22b 43-53 Trường Đại học Cần Thơ 
 49
quả của bài báo chỉ ra rằng giá trị pH là 7 được thấy là tối ưu cho sự sinh trưởng và 
sản sinh cellulase. Nhiệt độ ủ tối ưu để đạt hoạt tính cao nhất của enzyme cellulase 
lần lượt là 300C và 450C cho các dòng Bacillus alcalophilus S39 và Bacillus 
amyloliquefaciens C23.Tương tự, Fred (1972) cũng đã nghiên cứu rằng giá trị pH 
tối ưu cho sự sinh tổng hợp enzyme cellulase bởi Thermomonospora curvata là 8. 
3.3 Ảnh hưởng dịch trích nấm men đến sự sinh tổng hợp cellulase của dòng vi 
khuẩn 
Dịch trích nấm men thường được xem là thành phần bổ sung dinh dưỡng trong các 
môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Hàm lượng dịch trích nấm men được thêm vào 
các môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tích cực đến khả năng sinh trưởng và sự 
sinh tổng hợp các enzyme của các dòng vi sinh vật. Tuy nhiên, tùy mỗi loài vi sinh 
vật mà lượng dịch trích nấm men tối ưu cần thêm vào là khác nhau. 
0.021
0.027
0.031
0.043
0.067
0.039
0.023
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
Hàm lượng dịch trích nấm men (%)
H
oạ
t t
ín
h 
ce
llu
la
se
 (U
/m
l)
Hình 3: Ảnh hưởng của dịch trích nấm men đến sự sinh tổng hợp cellulase của dòng vi 
khuẩn 52 
Ảnh hưởng của dịch trích nấm men đến sự sinh tổng hợp enzyme cellulase của 
dòng vi khuẩn 52 được trình bày trong hình 3. Kết quả cho thấy rằng có sự khác 
biệt rất rõ giữa nghiệm thức có bổ sung dịch trích nấm men và không có bổ sung 
dịch trích nấm men. Trong trường hợp không có sự bổ sung dịch trích nấm men thì 
hoạt tính cellulase đạt được là 0,021 U/ml, trong khi với sự bổ sung dịch trích nấm 
men thì nhìn chung hoạt tính cellulase tăng lên đáng kể. Trong đó, hoạt tính cao 
nhất đạt được là 0,067 U/ml tại giá trị dịch trích nấm men bổ sung vào là 0,4 % 
(gấp 3 lần so với không bổ sung dịch trích nấm men). Sau đó hoạt tính giảm dần từ 
hàm lượng 0,5 % đến 0,6 % (tương ứng với giá trị hoạt tính là 0,039 và 0,023 
U/ml). Việc giảm hoạt tính cellulase bắt đầu từ hàm lượng 0,5 % và 0,6 % có thể 
là do hàm lượng dinh dưỡng bổ sung vào quá nhiều làm cho sự tăng trưởng và sinh 
tổng hợp cellulase tốt dẫn đến lượng đường khử sinh ra nhiều quay lại làm ức chế 
hoạt động của cellulase (Howell and Mangat, 1978). 
Như vậy, dịch trích nấm men được bổ sung vào môi trường nuôi cấy như là chất 
kích thích khả năng sinh tổng hợp cellulase ở dòng vi khuẩn 52. Hàm lượng dịch 
trích nấm men tối ưu thêm vào được chọn là 0,4 %. 
Tạp chí Khoa học 2012:22b 43-53 Trường Đại học Cần Thơ 
 50 
Kết quả của thí nghiệm phù hợp với các nghiên cứu khác trên thế giới, và hầu hết 
các bài nghiên cứu đều chỉ ra rằng khi dịch trích nấm men được bổ sung vào môi 
trường nuôi cấy đóng vai trò là chất kích thích sự tăng trưởng cũng như khả năng 
sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật (Amtul, 1989), (Azzaz, 2009), (Abou–Taleb 
et al., 2009). Sự bổ sung hàm lượng dịch trích nấm men tối ưu được thay đổi tùy 
theo các dòng vi khuẩn khác nhau tại các điều kiện nuôi cấy khác nhau. Amtul 
(1989) công bố rằng hàm lượng dịch trích nấm men tối ưu thêm vào môi trường 
nuôi cấy dòng vi khuẩn Cellulomonas flavigena là 0,2% tương ứng với giá trị hoạt 
tính CMCase đạt cao nhất là 10 U/ml, trong khi đó tác giả Abou–Taleb đã nghiên 
cứu rằng hàm lượng 0,7 % dịch trích nấm men là tối ưu cho dòng B. alcalophilus 
S39 và B. amyloliquefaciens C23 ứng với giá trị hoạt tính CMCase cao nhất đạt 
được lần lượt là 2,35 và 2,30 U/ml (Abou–Taleb et al., 2009). Lee và Blackburn 
(1975) đã chỉ ra rằng hoạt tính CMCase đạt giá trị cao nhất là 0,124 U/ml của dòng 
vi khuẩn ưa nhiệt Clostridium sp. M7 với việc bổ sung 0,5% dịch trích nấm men 
mặc dù ở hàm lượng 0,2 và 0,3% việc sinh tổng hợp cellulase trên mỗi tế bào có 
cao hơn ở hàm lượng 0,5%. 
3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của 
dòng vi khuẩn 
Thời gian nuôi cấy cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng mạnh đến sự sinh 
tổng hợp cellulase của vi sinh vật. Vì thế, thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của 
thời gian được tiến hành trên dòng vi khuẩn 52 đã chọn. 
0
0.033
0.038
0.051
0.064
0.052
0.042
0.038
0.034
0.029
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Thời gian nuôi cấy (ngày)
H
oạ
t t
ín
h 
ce
llu
la
se
 (U
/m
l)
Hình 4: Sự thay đổi hoạt tính cellulase theo thời gian nuôi cấy 
Hình 4 biểu diễn sự thay đổi hoạt tính cellulase qua 9 ngày nuôi cấy trong các điều 
kiện nuôi cấy tối ưu pH, nhiệt độ và hàm lượng dịch trích nấm men bổ sung đã 
chọn được ở các thí nghiệm trên. Nhìn chung, hoạt tính của enzyme tăng lên nhanh 
chóng trong 4 ngày đầu. Trong đó, ở 3 ngày đầu thì hoạt tính enzyme tăng nhẹ ứng 
với các giá trị 0,033; 0,038; 0,051 U/ml. Hoạt tính cellulase đạt giá trị cực đại là 
0,064 U/ml ở ngày thứ 4. Sau đó, hoạt tính bắt đầu giảm rõ rệt từ ngày nuôi cấy 
thứ 5 (ứng với giá trị là 0,052 U/ml) đến ngày thứ 9 đạt giá trị hoạt tính giảm còn 
thấp nhất là 0,029 U/ml. Sự giảm hoạt tính sau 4 ngày có thể là do sự biến tính của 
Tạp chí Khoa học 2012:22b 43-53 Trường Đại học Cần Thơ 
 51
enzyme, bắt đầu từ sự thay đổi pH (Krishna, 1999) và sự trao đổi chất của tế bào 
(Liu và Yang, 2007) trong suốt quá trình lên men. Ngoài ra, sau 4 ngày thì hàm 
lượng dinh dưỡng và cơ chất cảm ứng trong môi trường đã giảm đi dẫn đến sự 
giảm việc sinh tổng hợp cellulase của vi khuẩn (Laurent et al., 2000). Một lời giải 
thích khác nữa là do sự ảnh hưởng do tích lũy cellobiose, được công bố là gây nên 
sự ức chế hoạt động của cả endoglucanase và β-glucosidase (Howell và Mangat, 
1978). 
Kết quả của thí nghiệm tương tự với nghiên cứu của Ray et al. (2007), đã cho rằng 
việc sinh tổng hợp cellulase tối ưu đạt được tại 96 giờ nuôi cấy cho 2 dòng vi 
khuẩn Bacillus subtilis CY5 và Bacillus circulan TP3 ứng lần lượt các giá trị hoạt 
tính là 30,5 và 25 U/ml, sau đó, hoạt tính enzyme giảm dần theo thời gian. 
Tuy nhiên, thời gian nuôi tối ưu cũng tùy thuộc và đặc trưng cho từng dòng vi 
khuẩn cũng như môi trường cơ chất cảm ứng khác nhau. Chẳng hạn như dòng 
Cellulomonas flavigena thì hoạt tính CMCase và Avicelase của dòng đạt cao nhất 
lần lượt là 10 và 1,2 U/ml sau 72 giờ lên men (Amtul, 1989), trong khi đó 
Abhaykumar (1992) phát hiện rằng hoạt tính CMCase của dòng Vibrio agar-
liquefaciens đạt giá trị cực đại là 0,09 IU/ml tại ngày nuôi thứ 9 tại pH 7. Ngoài ra, 
Azzaz (2009) cũng đã công bố rằng sự sinh cellulase bởi A. niger và A. flavus NRL 
5521 trên cơ chất bột cellulose đạt giá trị cực đại sau 48 giờ ủ. 
3.5 Khảo sát các nguồn carbon cơ chất nuôi khác nhau đến sự sinh tổng hợp 
cellulase của dòng vi khuẩn 
Hình 5 biểu diễn hoạt tính của enzyme cellulase (endoglucanase và exoglucanase) 
và hàm lượng protein sinh ra trong dịch nuôi cấy của dòng vi khuẩn 52 với sự thay 
đổi của các nguồn carbon trong các điều kiện tối ưu đã chọn. Trong số tất cả các 
nguồn carbon được dùng, bột giấy và bột cellulose được xác định là nguồn carbon 
tốt nhất cho việc sinh enzyme endoglucanase (0,032 U/ml và 0,031 U/ml) và 
exoglucanase (0,025 U/ml và 0,024 U/ml). Trong khi đó, các cơ chất còn lại như 
rơm, bã mía, vỏ trấu cũng có vai trò là chất cảm ứng cho việc sinh các enzyme 
cellulase nhưng ở mức độ thấp hơn. Nổi bật là cơ chất rơm với việc cho hoạt tính 
endoglucanase tương đối cao (0,028 U/ml) so với bã mía và vỏ trấu (0,026 U/ml và 
0,023 U/ml). Trong khi đó, hàm lượng protein sinh ra trong dịch nuôi cấy trên cơ 
chất rơm, bã mía và vỏ trấu lần lượt là 41,49; 35,45 và 58,97 µg/ml, cao hơn nhiều 
so với bột giấy và bột cellulose (26,99 và 22,75 µg/ml). Điều này có thể giải thích 
là trên các cơ chất như rơm, bã mía, vỏ trấu có chứa lignin, hemicellulose và 
xylanbao bọc quanh cấu trúc cellulose; vì thế, khi phân hủy cơ chất này vi 
khuẩn cần phải có sự phối hợp hoạt động thêm của các loại enzyme khác như 
ligninase, hemicellulase hay xylanaseđể phá vỡ cấu trúc bền vững này; từ đó, 
các enzyme cellulase mới thể hiện hoạt tính được. Sự xuất hiện và hoạt động đồng 
thời của nhiều loại enzyme cùng lúc dẫn đến sự ức chế hoạt động lẫn nhau của các 
enzyme đồng thời làm tăng lên hàm lượng protein trong dịch nuôi cấy (Badhan et 
al., 2004). 
Kết quả thí nghiệm đã chỉ ra rằng cơ chất bột giấy và bột cellulose là nguồn carbon 
tốt cảm ứng cho việc sinh tổng hợp cellulase của dòng vi khuẩn 52. Ngoài ra, trên 
các nguồn cơ chất như rơm, bã mía và vỏ trấu, hoạt tính cellulase đạt được cũng 
cho kết quả khá tốt. 
Tạp chí Khoa học 2012:22b 43-53 Trường Đại học Cần Thơ 
 52 
0.00
0.01
0.01
0.02
0.02
0.03
0.03
0.04
Các nguồn carbon khác nhau
H
oạ
t t
ín
h 
ce
llu
la
se
 (U
/m
l)
0
10
20
30
40
50
60
70
H
àm
 lư
ợn
g 
pr
ot
ei
n 
(m
g/
l)
Endoglucanase 0.031 0.032 0.028 0.026 0.023
Exoglucanase 0.024 0.025 0.010 0.015 0.011
Hàm lượng protein 22.75 26.99 41.49 35.45 58.97
Cellulose Bột giấy Rơm Bã mía Vỏ trấu
Hình 5: Ảnh hưởng của các nguồn carbon cơ chất khác nhau lên sự sinh tổng hợp cellulase 
(endoglucanase và exoglucanase) của dòng vi khuẩn 52 với các điều kiện nuôi tối ưu 
đã chọn 
4 KẾT LUẬN 
Trong 37 dòng vi khuẩn kỵ khí đem khảo sát hoạt tính, đề tài đã chọn được dòng 
vi khuẩn 52 có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao nhất trên môi trường cơ chất 
bột giấy. Việc sinh enzyme cellulase của dòng vi khuẩn đạt cao nhất với hàm 
lượng dịch trích nấm men thêm vào môi trường nuôi là 0,4%, với thời gian nuôi 4 
ngày ở nhiệt độ 300C tại giá trị pH 8. 
Nghiên cứu cho thấy rằng dòng vi khuẩn 52 không những có tiềm năng trong việc 
sinh tổng hợp cellulase trên cơ chất bột giấy mà còn có thể được ứng dụng trong 
việc xử lý các phế phẩm nông nghiệp sau thu hoạch. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Abhaykumar, V.K. and H.C. Dube, 1992. Cellulases of Vibrio agar-liquefaciens isolated 
from sea mud. Microbiol. and Biotechl. (8): 313-315. 
Abou-Taleb, A.A. Khadiga, W.A. Mashhoor, A. Sohair, M.S. Sharaf and H.M. Hoda, 2009. 
Nutritional and Environmental Factors Affecting Cellulase Production by Two Strains of 
Cellulolytic Bacilli. Australian Journal of Basic and Applied Sciences 3(3): 2429-2436. 
Amtul, J. S., 1989. Purification and Characterization of Microbial Cellulolytic Enzymes. Ph.D. 
Thesis, Institute of Chemistry, University of the Punjab Lahore – 1, Pakistan, pp: 176. 
Ariffin, H, N. Abdullah, M.S.U. Kalsom, Y. Shirai, M.A. Hassan, 2006. Production and 
characterization of cellulase by Bacillus pumilus EB3. Int. J. Eng. Tech. 3(1):47-53. 
Azzaz, H.H., 2009. Effect of cellulolytic enzymes addition to diets on the productive 
performance of lactating goats. M.Sc. Thesis, Faculty of Agriculture, Cario University, 
Egypt, pp: 141. 
Badhan, A.K., B.S. Chadha, K.G. Sonia, H.S. Saini and M.K. Bhat, 2004. Functionally 
diverse multiple xylanases of thermophilic fungus Myceliophthora sp. IMI 387099. Enz. 
and Microbiol. Technol. 35, 460–466. 
Bahkali, A.H., 1996. Influence of various carbohydrates on xylanase production by V. 
tricorpus. Bioresource Technol. 33(3): 265 - 268. 
Tạp chí Khoa học 2012:22b 43-53 Trường Đại học Cần Thơ 
 53
Bhat, M.K., 2000. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Biotech. Adv. 18: 355-
383. 20 
Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities 
of protein utilizing principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 142-146. 
Cherry, J.R. and A.L. Fidantsef, 2003. Directed evolution of industrial enzymes: an update. 
Curr. Opin. Biotechnol. 14: 438–443. 
Fred, J. S., 1972. Cellulolytic activity of Thermomonospora curvata: Nutritional requirements 
for cellulase production. Journal of American Society for Microbiol. 24 (1): 77-82. 
Howell, J.A. and M. Mangat, 1978. Enzyme deactivation during cellulose hydrolysis. 
Biotechnol. Bioeng. 20: 847-863. 
Immanuel, G., R. Dhanusa, P. Prema and A. Palavesam, 2006. Effect of different growth 
parameters on endoglucanase enzyme activity by bacteria isolated from coir retting 
effluents of estuarine environment. Int.. J. Environ. Sci. Tech. 3(1): 25-34. 
Jarvis, M., 2003. Cellulose stacks up. Nature 426: 611-612. 
Kirk, O., T.V. Borchert and C.C. Fuglsang, 2002. Industrial enzyme applications. Curr. Opin. 
Biotechnol. 13: 345-351. 
Knowles, J., P. Lethtovaara and T. Teeri, 1987. Cellulase families and their genes. Trends 
Biotechnol. 5: 255-261. 
Krishna, C., 1999. Production of bacterial cellulases by solid state bioprocessing of banana 
wastes. Bioresour. Technol. 69, 231-239. 
Laurent P., L. Buchon, J.F.G. Michel, N. Orange, 2000. Production of pectate lyases and 
cellulases by Chyrseomonas luteola strain MFCL0 depends on the growth temperature 
and the nature of the culture medium: evidence for two critical temperatures. App. and 
Env. Micro. 66 (4) 1538- 1543. 
Lee B. H. and T. H. Blackburn, 1975. Cellulase Production by a Thermophilic Clostridium 
Species. App. Micro. 30 (3) 346-353. 
Lynd L.R., P.J. Weimer, W.H. Zyl and I.S. Pretorius, 2002. Microbial cellulose ultilization: 
Fundamentals and Biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev 66: 506-577. 
Nakamura K. and K. Kppamura, 1982. Isolation and identification of crystalline cellulose 
hydrolyzing bacterium and its enzymatic properties. J. Ferment. Technol. 60(4): 343 - 348. 
Nelson, N. (1944). A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of 
glucose. J Biol Chem. 153: 375–80. 
Ray, A.K., A. Bairagi, K.S. Ghosh and S.K. Sen, 2007. Optimization of fermentation 
conditions for cellulase production by Bacillus subtilis CY5 and Bacillus circulans TP3 
isolated from fish gut. Acta Ichthyol. Piscat. 37 (1): 47–53. 
Ryckeboer J., J. Megaert, J. Coosemans, K. Deprins and J. Swings, 2003. Microbiological 
aspects of biowaste during composting in a monitored compost bin. Jour of Appl. 
Microbiol 94: 127 – 137. 
Shin, C.S., J.P. Lee, P.S. Lee and S.C. Park, 2000. Enzyme production of Trichoderma reesi 
Rut C-30 on a various lingocellulosic substrates. Appl. Biochem and Biotechnol. 84-86: 
237-245. 
Teeri, T. T., 1997. Crystalline cellulose degradation: New insights into the function of 
cellobiohydrolases. Trend Biotechnol. 15: 160-167. 
Tomme, P., R.A. Warren and N.R. Gilkes, 1995. Cellulose hydrolys is by bacteria and fungi. 
Adv. Microb. Physiol. 37: 1-81. 
Wood, T.M. and V. Garica-Campayo, 1990. Enzymology of cellulose degradation. 
Biodegradation 1: 147-161. 
Zhang, Y.H.P. and L.R. Lynd, 2004. Toward an aggregated understanding of enzymatic 
hydrolysis of cellulose: noncomplexed cellulose systems. Biotechnol. Bioeng. 88: 797-824.