Bài giảng Chẩn đoán virus viêm não Nhật Bản bằng kỹ thuật Rt-Lamp - Nguyễn Minh Thiện

CHẨN ĐOÁN VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẰNG KỸ THUẬT RT-LAMPSinh viên thực hiện:	 Giảng viên:Nguyễn Minh Thiện	Nguyễn Ngọc Hải MSSV:06126145Mục lụcĐặt vấn đềTổng quan tài liệuVật liệu và phương pháp RT-LAMP định tínhRT-LAMP định lượngKết luậnTài liệu tham khảoI. Đặt Vấn ĐềTheo thông báo của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, mỗi năm có khoảng 3.000 trẻ em mắc bệnh viêm não, trong đó có từ 30-40% bị viêm não Nhật Bản. Hiện nay bệnh viêm não Nhật Bản chưa có thuốc đặc trị. Để giảm những di chứng, cũng như tử vong do bệnh cần phát hiện và điều trị trong giai đoạn sớm khi virus xâm nhập. Do đó, sử dụng kỹ thuật RT-LAMP chẩn đoán virus VNNB sẽ giúp phát hiện nhanh virus VNNB.II. Tổng quan tài liệuGiới thiệu virus VNNB và bệnh VNNB:Định nghĩa bệnh VNNB Viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh nhiễm trùng cấp tính gây ra bởi một loại siêu vi trùng thuộc nhóm Arbovirus có ái tính với tế bào thần kinh, có tên là virus viêm não Nhật Bản. Virus lây truyền qua người nhờ trung gian của loại côn trùng tiết túc là muỗi. Bệnh có thể xảy ra rải rác hay thành dịch.b. Virus VNNB: Virus VNNB được xếp vào giống Flavivirus, họ Flavivudae, được tách từ họ Togavirudae. Hình cầu, nhân chứa ribonucleic acid (RNA), kích thước 45 - 50nm, bao quanh bởi cấu trúc hình khối gọi là capsid, phần vỏ giàu chất lipid.	 Virus VNNB hiện nay có nhiều dòng khác nhau và chúng được xếp vào nhóm virus VNNB B cùng với virus viêm não Murray Valley, virus viêm não West Nile, virus viêm não Saint Louis.c. Phân bố của virus VNNB: Các virus trong nhóm virus VNNB phân bố và gây bệnh khắp nơi trên thế giới. riêng virus VNNB lưu hành rộng rãi ở các nước trong vùng Đông á, Nam Á, và Đông Nam Á trong đó có Việt Nam d. Chu trình lây nhiễm của virus VNNB:	Virút VNNB được bảo tồn trong thiên nhiên do truyền sinh học từ động vật có xương sống này sang động vật có xương sống khác qua trung gian của côn trùng tiết túc hút máu là muỗi d. Đặc điểm của bệnh VNNB:	phân bố theo mùa: Vào mùa hè thời tiết nóng, ở nhiệt độ từ 270C – 300C, virus thường phát triển tốt trong cơ thể muỗi. Nếu dưới 200C thì sự phát triển của virus dừng lại. 	Phân bố theo tuổi và giới tính: Tất cả mọi lứa tuổi chưa có miễn dịch đều có thể mắc bệnh. Ở những vùng có bệnh VNNB lưu hành, trẻ em sớm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh nên tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ cao thường từ 2 - 10 tuổi. Bệnh không liên quan tới giới tính tuy nhiên trong thực tế số bệnh nam thường nhiều hơn nữ. 2. Giới thiệu kỹ thuật LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification):Khái niệm kỹ thuật LAMP: 	LAMP là kỹ thuật nhân bản acid nucleic đơn giản, nhanh, đặc hiệu và cho hiệu quả cao. LAMP được phát triển bởi công ty hóa chất Eiken, Nhật Bản. nó sử dụng bốn đoạn mồi được thiết kế đặc biệt để nhận diện 6 vùng trình tự trên trình tự đích và quá trình phản ứng thực hiện ở nhiệt độ không đổi từ 600C– 650C (thường 630C), với thời gian phản ứng từ 30-60 phút nhanh hơn rất nhiều so với phản ứng PCR. thành phần phản ứng gồm: mẫu, 4 đoạn primer, DNA polymerase, dung dịch đệm, dNTP, tất cả các thành phần phản ứng cho vào một test tube và thực hiện phản ứng trong tủ ổn nhiệt. trong kỹ thuật này cả hai quá trình nhân bản và kiểm tra kết quả phản ứng chỉ trong một bước.b. Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP:	Mồi được thiết kế tốt sẽ quyết định kết quả của phản ứng khuếch đại. Mồi được sử dụng trong LAMP đều được thiết kế và kiểm tra bằng phần mềm PrimerExplore.	LAMP được thực hiện với bốn đoạn mồi được thiết kế đặc biệt để nhận ra sáu vùng trình tự khác nhau trên DNA đích bao gồm: Vùng F3c, F2c, F1c ở đầu 3’ và B1, B2, B3 ở đầu 5’.c. Nguyên lý của kỹ thuật LAMP:	Bước 1:	Bước 2:	Bước 3:	Bước 4:	Bước 5:Bước 6:Bước 7:Bước 8:Bước 9-11:d. Kỹ thuật RT-LAMP (reverse transcriptase LAMP) Thành phần phản ứng của RT-LAMP tương tự LAMP nhưng có thêm AVM reverse transciptase. Các bước của kỹ thuật cũng tương tự nhưng bước đầu tiên của kỹ thuật là tạo c.DNA.e. LAMP phát hiện SNP:Sử dụng 4 primer được thiết kế để xác đinh 6 vùng trình tự trên khuôn, chỉ có DNA đích bổ sung hoàn toàn mới được khuếch đại .Phản ứng đặc hiệu có thể phân biệt sự khác nhau một nucleotide.Ví dụ: Phân biệt chủng hoang dại với chủng đột biến khác nhau chỉ 1bp. f. Đọc kết quả:Định tính:	- Đọc trên gel Agarose	- Đọc bằng mắt thường hoặc dưới tia UVĐịnh lượng:	Đo giá trị OD của chuẩn tiến hành xây dựng đường chuẩn, dựa vào giá trị OD của mẫu để tính số bản sao trình tự đích có trong mẫu.III. Vật liệu, phương phápĐịnh tính virus VNNB:Vật liệu: Mồi thiết kế cho gene E: Outer primer (19 base): F3: GGAATGGGCAATCGTGA B3: CGTTGTGAGCTTCTCCAGTInner primer: FIP: GCGGACGTCCAATGTTGGTTTG BIP: GCCACTTGGGTGGACTTG Mẫu máu lấy từ bệnh nhân, đối chứng âm, đối chứng dương là virus được nuôi trên tế bào C6/36 (tế bào ấu trùng muỗi Aedes albopictus).Các hóa chất và thành phần khác của phản ứng như: Bst DNA polymerase and AMV reverse transcriptase, dNTP, Tris-HCl (ph 8.8), KCl, MgSO4, (NH4)2SO4, Tween 20, betaine.b. Phương pháp: Thành phần của một test phản ứng 25µl gồm:50 pmol mỗi loại inner primer (FIP và BIP)5 pmol mỗi loại outer primer (F3 và B3)1.4 mM dNTP0.8 M betaine0.1% Tween 2010 mM (NH4)2SO48 mM MgSO410 mM KCl20 mM Tris-HCl (pH 8.8)8 UI enzyme DNA polymerase (New England Biolabs)0.625 UI enzyme avian myelablastosis virus reverse transcriptase (Invitrogen, USA)2 l RNA mẫuquy trình thực hiện như sau:Mẫu, đối chứng dương, đối chứng âmSử dụng ngay hay trữ ở -800C nếu chưa dùngLy trích RNA bằng bộ kit QIAamp viral RNA mini kit (QIAGEN, Đức)Sử dụng ngay hay trữ ở -700C cho đến khi sử dụngSử dụng bộ kit Loopamp RNA amplification kit (Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Nhật Bản) để thực hiện phản ứng khuếch đại ở 630C trong 60 phútNâng nhiệt độ lên 800C trong 2 phút để kết thúc phản ứngc. Đọc kết quả: Đọc kết quả trên gel điện di, dương tính nếu có sự hiện màu của ethidium bromide. Đọc bằng mắt thường hay dưới tia UV nhờ SYBR green I2. Định lượng virus VNNB:Vật liệu: 	Vật liệu cho phản ứng RT-LAMP định lượng giống như RT-LAMP định tính virus VNNB. Điểm khác nhau ở đây là cần chuẩn bị thêm các mẫu chuẩn đã biết số lượng virus VNNB để xây dựng đường chuẩn.b. Phương pháp và tính toán:	Nồng độ các thành phần cho một tube phản ứng tương tự như RT-LAMP định lượng.Các bước thực hiện RT-LAMP định lượng như sau:Chuẩn bị mẫu và các mẫu chuẩn đã biết lượng virus VNNBSử dụng ngay hay trữ ở -800CLy trích RNA bằng bộ kit QIAamp viral RNA mini kit (QIAGEN, Đức)RNA được sử dụng ngay hoặc trữ ở -700C cho đến khi sử dụngThực hiện phản ứng khuếch đại các mẫu chuẩn trong Loopamp Real Time turbidimeter để xác định giá trị TpXây dựng đường chuẩn dựa trên Tp và lượng virus trong mẫu chuẩnKhuếch đại mẫu trong Loopamp Real Time turbidimeter để xác định giá trị TpThay giá trị Tp vào phương trình đường chuẩn để tính lượng virus VNNB trong mẫuMẫu chuẩn được cho phản ứng trong thiết bị Loopamp Real Time turbidimeter để đo OD liên tục. Dựa vào thời gian bắt đầu cho phản ứng dương tính và số lượng virus trong chuẩn để xây dựng đường chuẩn.IV. Kết luận kỹ thuật RT-LAMP nói riêng và kỹ thuật LAMP nói chung là kỹ thuật hứa hẹn sẽ được phát triển rộng rãi cho việc khuếch đại acid nucleic, cũng như chẩn đoán bệnh trực tiếp chỉ trong một bước phản ứng. Đây có thể chính là kỹ thuật sẽ thay thế kỹ thuật PCR do những ưu điểm của nó so với phản ứng PCR như: Nhanh (chỉ mất từ 30-60 phút), đặc hiệu, đơn giản, không cần máy móc đắt tiền RT-LAMP định tính và định lượng là kỹ thuật hiệu quả cho việc chẩn đoán virus VNNB. Cần nghiên cứu sâu hơn để xây dựng một quy trình chuẩn cho việc chẩn đoán virus VNNB. V. Tài liệu tham khảoM. M. Parida, S. R. Santhosh, P. K. Dash, N. K. Tripathi, P. Saxena1, Ambuj, A. K. Sahni1, P. V. Lakshmana Rao and Kouichi Morita, 2006; development and evaluation of reverse transcription Loop mediated isothermal amplification assay for rapid and Real-time detection of japanese encephalitis virus.Xue-en FANG, Jian LI and Qin CHEN, 2008; One New Method of Nucleic Acid Amplification-Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA. Motoki Goto, Eiichi Honda, Atsuo Ogura, Akio Nomoto, and Ken-Ichi Hanaki, 2009; Colorimetric detection of loopmediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Hiroko Toriniwa, and Tomoyoshy Komiya, 2006; Rapid detetion and quantification of Japanese encephalitis virus by Real-Time reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification. Narong Nitatpattana, Audrey Dubot-Pérès, Meriadeg Ar Gouilh, Marc Souris, Philippe Barbazan, Sutee Yoksan, Xavier de Lamballerie, and Jean-Paul Gonzalez, 2005; Change in Japanese Encephalitis Virus Distribution, Thailand.Boonyos Raengsakulrach, Ananda Nisalak, Montip Gettayacamin, Vipa Thirawuth, G. David Young, Khin Saw Aye Myint, Laura M. Ferguson, Charles H. Hoke Jr., Bruce L. Innis, And David W. Vaughn, 1999; an intranasal challenge model for testing japanese encephalitis Vaccines in rhesus monkeys.Noboru Inoue, Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA (LAMP) General Introduction.Norihiro Tomita, Yasuyoshi Mori, Hidetoshi Kanda & Tsugunori Notomi, 2008; Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.BS. Võ Công Khanh, 2007; Bệnh viêm não Nhật Bản.Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Thiện và cs, 2004; Một số bệnh mới do virus ở gia súc và gia cầm nhập nội và biện pháp phòng trị.Viện kí sinh trùng sốt rét Quy Nhơn; Chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật sinh học phân tử.Wikipedia.com.vnEikenchemical.com