Bài giảng Chuẩn đoán virus pmws bằng kỹ thuật gen - Nguyễn Hoàng Ngân

CHUẨN ĐOÁN VIRUS PMWS BẰNG KỸ THUẬT GENGiáo viên hướng dẫn: NGUYỄN NGỌC HẢI.Người thực hiện: NGUYỄN HOÀNG NGÂN.Nội dung:I. Đặt vấn đề.II.Tổng quan.III. Kết luận.IV. Tài liệu tham khảo.I. Đặt vần đềPMWS (post weaning multisystemic syndrome) được ghi nhận lần đầu tiên trên một đàn heo ở Canada vào năm 1991. Sau đó, được ghi nhận ở Mỹ rồi đến các nước châu Âu. Nhiều nước Châu Âu và một số nước châu Á gây thiệt hại kinh tế rất lớn trong ngành chăn nuôi heo. Hội chứng PMWS thường xuất hiện ở heo lứa tuổi từ 6 đến 18 tuần, tỷ lệ chết có thể dao động từ 1-2% đến 10-25% ở một số đàn heo. Hội chứng PMWS trên heo.PMWS thường hay kết hợp với virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo ( porcine reproductive respiratory syndrome virus-PRRSV), virus cúm heo ( porcine parvovirrus-PPV), Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suit và Mycoplasma hyoppneumonia.II. Tổng quan.Tác nhân gây bệnh.Circovirus thuộc họ virus có DNA mạch vòng, không có vỏ bao và chứa một bộ gen vòng đơn.Họ mới của những DNA virus gọi là Circovitidae, giống Circovirus.PVC có trọng lượng trong CsCl là 1.33-1.34 (Buhk và ctv, 1985).Là loại virus nhỏ nhất được biết đến và có khả năng sống sót cao trong môi trường.Gồm có 2 tuyp được tìm thấy ở heo, bao gồm type 1 (PVC1) và type 2 (PVC2).Bộ gen DNA của PCV1 gồm 1759bp và của PCV2 là 1768bp (Meehan và ctv,1997).Bộ gen PVC gồm 6 khung đọc ORF1 mã hóa cho protein tham gia vào quá trình nhân lên của virus và ORF2 mã hóa cho các gen cấu trúc của virus.Trên heo hai loại PVC: PVC1 và PVC2 với bộ nhiễm sắc thể tương đồng khoảng 68-78%, trong đó ORF tương đồng khoảng 83% về trình tự nucleotide và 86% acid amin. Figure 2. Morphology and genomic organisation of PCV2 PVC1 được xem như là virus nhiễm thường xuyên và tự nhiên trên tế bào thận heo PK15 và là virus không gây bệnh. PVC2 được xem như là tác nhân gây PMWS.Porcine circovirus type 2 (PCV2) with fine outer capsid.a/ Circovirus type 1 (PVC-1)	Năm 1974, các nhà khoa học đã phân lập được Circovirus type 1 từ tế bào thận heo.Hiện nay, chúng không gây bệnh cho heo.b/ Circovirus type 2 (PVC-2):Kháng thể trên PVC-2 đã được phát hiện ở huyết thanh heo nuôi tại Bỉ năm 1985.PCV2 đề kháng cao với nhiều chất sát trùng ( ethanol, chlohexidine, iodine và formaldehyde), chịu đựng sức nóng 70oC/15’, không bị vô hoạt ở pH=3. Được phân lập từ các mô lưu trữ ở -70oC trong nhiều tháng ( Ellis và ctv,1998). Sodiumhydroxide và Virkon S với độ pha loãng 1% có hiệu quả nhất trong việc bất hoạt PCV2 (Royer và ctv, 2001). PCV2 có thể lây truyền ngang dọc, theo các đường hô hấp, đường máu, nhau thai và sinh dục.Krakowka và ctv (2001) đã phát hiện acid nucleic của PCV2 có trong phân, nước tiểu, nước mắt của héo sau 31 ngày gây nhiễm. PCV2 cũng được tìm thấy trong tinh dịch của những heo đực nhiễm bệnh và sẽ lây truyền virus qua giao phối (Kim và ctv,2001).Sự chết của bào thai và sẩy thai có liên quan đến sự nhiễm bệnh qua đường sinh dục (Bogdan và ctv,2001). 2. Cách gây bệnh.Misinzo và ctv (2006) đã phát hiện PCV2 có trong nhiều loại tế bào như tế bào gan, biểu mô, nội mô, lympho bào, tế bào cơ trơn và nguyên sợi bào. Krakowka và ctv (2001) gây nhiễm qua đường mũi hay tiêm tĩnh mạch của heo có sự hiện diện của bạch cầu đơn nhân và đại thực bào trong phổi, hạch hạnh nhân, hạch lympho, tại phổi, gan, thận, dạ dày-ruột và lách khoảng ngày 14-21sau gây nhiễm. Tình trạng nhiễm virus huyết xuất hiện lúc 14 ngày sau khi nhiễm và kéo dài 2-4 tuần. Sau khi gây nhiễm 21 ngày, phổi của thú có nhiều vùng bị xẹp và mất chức năng, hạch lympho sưng lớn và chuyển sang màu nâu.Đối với hệ thống miễn dịch, PCV2 tấn công vào tế bào đích là các tế bào hình sao và tương tác với cá tế bào dòng tủy (tế bào lympho B, lympho T, tế bào NK ngoại trừ tế bào bạch cầu đơn nhân lớn). Virus PCV2 còn tác dụng làm giảm tiểu cầu nghiêm trọng gây xuất huyết mô kéo dài. 3. Giới thiệu phương pháp PCR.Nguyên tắc chung. Thành phần cơ bản cho phản ứng PCR bao gồm: DNA bản mẫu, mồi xuôi, mồi ngược, dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), dung dịch đệm cho phản ứng PCR, MgCl2, Tap polymerase. Phản ứng PCR cho phép khuếch đại từ một DNA ban đầu thành một số lượng lớn DNA, được thực hiện nhờ enzyme DNA polymerase không cần đến sự hiện diện của tế bào. Kỹ thuật này được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo ba giai đoạn sau:Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ 92-95oC, hai chuỗi DNA tách ra để làm khuôn mẫu để tổng hợp mới hai mạch bổ sung; giai đoạn ủ để lai phân tử (hybridization), hai mồi bắt cặp bổ sung với mạch khuôn của DNA ở hai đầu nhằm chuẩn bị cho sự kéo dài; giai đoạn kéo dài (elongation) tạo thành chuỗi DNA bổ sung với chuỗi DNA gốc.Mỗi chu kỳ gồm ba bước trên sẽ lặp đi lặp lại nhiều lần, lượng DNA được nhân lên theo cấp số nhân. Ba giai đoạn xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau nên cần phải có máy luân nhiệt kiểm soát phản ứng với tính tự động hóa một cách chính xác. Sự lặp lại theo chu kỳ thường xảy ra khoảng 30 lần để làm tăng hoạt một gen thành một khối lương lớn hơn rất nhiều lần so với khối lượng DNA ban đầu. b. Ứng dụng PCR trong nghiên cứu PCV2.Kỷ thuật PCR lần đầu tiên được ứng dụng để phát hiện PCV2 trong mô được báo cáo vào năm 1997 bởi Narar và ctv.Trên thế giới, nhiều tác giả đã ứng dụng kỷ thuật PCR để tìm hiểu đặc tình của PCV2 trong những đàn có hoặc không có hội chứng PMWS như Allan và ctv (1998), Harmel (1998), Calsamiglia (2001), Kim (2002), Segales và Morvan (2002)Các tác giả (Mori và ctv,2000; Lyoo và Park, 2001; Royer và ctv, 2001) đều nhận định kỹ thuật PCR là rất nhạy và đặc hiệu trong chuẩn đoán xác định PCV2.Stevenson (2000) nhận định kỷ thuật PCR là nhạy nhất, kế đến là kỷ thuật lai trong mô và thấp nhất là kỷ thuật phân lập virus. Độ nhạy của kỷ thuật PCR trong phát hiện PCV2 có thể đạt đến 5pg DNA của virus. 4.Chuẩn đoán PMWS virus.A. Giới thiệu chung về các phương pháp chuẩn đoán PMWS virus.Trong chuẩn đoán xác định nguyên nhân gây ra PMWS cần phải sử dụng các kỹ tuật thể hiện liên quan trực tiếp giữa virus và bệnh tích mô. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch, lai tại chỗ được khuyến cáo áp dụng nhiều hơn so với kỹ thuật PCR hoặc phân lập virus đơn thuần. Việc phát hiện PVC2 chỉ cho phép kết luận thú bị nhiễm PVC2 nhưng không thể kết luận thú bị PMWS. DNA hoặc kháng nguyên của PVC2 có thể phát hiện bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch, lai tại chỗ trong đại thực bào của nhiều loại mô bệnh. Do sự khác biệt về gen của ORF2 nhiều hơn so với ORF1 nên các đoạn dò thường được thiết kế dựa trên sự khác biệt gen của ORF2 nhằm chuẩn đoán phân biệt PCV1 và PCV2.Muirhead (2002) cho rằng để chuẩn đoán chính xác PMWS cần dựa trên 3 tiêu chí: biểu hiện lâm sàng, bệnh tích đặc trưng và xét nghiệm chứng minh acid nucleotide hoặc kháng nguyên của PCV2 liên quan đến bệnh tích đặc trưng. B.Sử dụng phương pháp PCR để chuẩn đoán. Phân bố mẫu.Chọn những trại có tiền sử heo cai sữa bị còi hoặc đang có heo còi với tỷ lệ tăng đột ngột sau cai sữa với quy mô khác nhau (theo đàn nái) để lấy mẫu. 5 loại quy mô chăn nuôi theo số lượng heo nái trong trại như sau:.Quy mô trại heo theo số lượng heo nái. Số trại lấy mẫu Số heo còi chọn mổ/ trạiTổng cộng heo còi chọn mổ ≤10 521011-5042-3951-10062-416101-20043-514>20035-616Tổng cộng65Thu thập và bảo quản mẫu.Số heo chọn khảo sát là 65 con, được ghi nhận tất cả triệu chứng, sau đó mổ khám để ghi lại bệnh tích theo mức độ nặng nhẹ của ca bệnh và chụp hình theo từng cụm quan sát.Bước tiến hành.ly trích DNA lần lượt từ các mẫu đã chọn (Lyoo và Park,2001).Cắt nhỏ mẫu (khoảng 1 cm3) cho vào ống eppendorf.Thêm 60 μl dung dịch đệm (50mM tris-HCl, 1mM EDTA và 1% SDS, pH=8) và 3 μl protease, ủ hỗn hợp ở 55oC trong 1h.Cho vào hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24) vortex nhẹ, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, lấy phần nước nổi, cho thêm vào 1ml ethanol lạnh, ủ ở -20oC trong 2h, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC, lấy cặn làm ráo.Cho thêm vào 180 μl TE 1X, vortex, ủ 55oC trong 15 phút.Cho vào 20μl natri acetate 2M, trộn đều, cho vào 500μl ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ ở trong 15 phút ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC bỏ phần nổi, lấy cặn, rửa cặn bằng 1ml ethanol 70%, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC, lấy cặn rồi làm khô cặn trong tủ ấm ở 55oC.Hòa tan cặn bằng 200μl TE 1X, ủ 25oC qua đêm, vortex.Sản phẩm PCR sau khi ly trích được giữ ở -20oC hoặc sử dụng ngay. Thực hiện phản ứng PCRTiến hành phản ứng PCR với sản phẩm DNA đã ly trích bằng cách dùng cặp mồi đặc hiệu với PCV2 (Hams và ctv, 2001).Mồi xuôi: PCV1067: 5’ TTAGGCTTTAAGTGGGTGTG 3’.Mồi ngược: PCV1740: 3’ATGACGTATCCAAGGAGCCG 5’.Các thành phần cho phản ứng PCR phát hiện DNA của virus PCV2:PCR bufer 10X	1.5 μlMgCl2 15mM	1μldNTPs 10mM	0.35μlMX 0.5mM	0.8μlMN 0.5mM	0.8μl Tap DNA polymerase 5UI	0.2μlDNA mẫu	2μlNước cất hai lần vô trùng đầy đủ	20μl Trộn đều nhẹ nhàng hỗn hợp trên, chạy PCR để khuếch đại DNA bằng máy luân nhiệtChu trình chạy PCR bằng máy luân nhiệt:940C trong 5 phút.94oC trong 60s.56oC trong 56s.72oC trong 45s.72oC trong 3 phút. Điện di trên gel agarose và đọc kết quả. Sản phẩm đã khuếch đại được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch agarose 20% trong dung dich TBE trong 30 phút. Nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide 1/10.000Đọc kết quả bằng máy chụp gel có gắn với màn hình vi tính (sử dụng phần mềm Quantitu one 2000).Sản phẩm PCR cần thu hoạch tại vị trí 702bp.IV.Kết luậnKỹ thuật PCR nên ứng dụng trong chuẩn đoán những ca heo còi nghi do PCV2 tại các trại chăn nuôi hiện nay với bệnh phẩm là hạch bẹn sưng lớn.Trong tình hình vacine phòng bệnh do PCV2 chưa phổ biến, các trại cần áp dụng các biện pháp an toàn sinh học khống chế các yếu tố gây stress, chọn lọc giống, cải thiện công tác quản lý, điều kiện vệ sinh chăn nuôi nhằm khống chế hội chứng PMWS.Tiếp tục khảo sát với số lượng mẫu lớn hơn trên nhiều đối tượng heo, tại nhiều tỉnh thành trong nước, theo mùa vụ trong năm nhằm nắm rõ dịch tễ và đề xuất hướng phòng và kiểm oát mầm bệnh PCV2.Khảo sát sự phân bố virus PCV2 trong nguồn tinh heo, dịch tiết hô hấp, nước tiểu, trong phân, máu để có định hướng kiểm soát nguồn virus trên đàn heo khỏe mang trùng PCV2.Khảo sát mối liên hệ giữa hội chứng còi cọc do PCV2 và một số tác nhân khác như: PRRS, PPV, Mycoplasma hyopreumoniae, dịch tả heo, E.coli. V. Tài liêu tham khảo Lê Tiến Dũng, 2006. Phát hiện virus PCV2 bằng kỷ thuật PCR và phân lập định danh một số vi khuẩn gây bệnh hô hấp trên heo nghi mắc hội chứng còi cọc sau cai sữa. Luận văn tiến sĩ nông nghiệp, ĐH Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam. Nguyễn Ngọc Hải,2007. Công nghệ sinh học trong thú y. Nhà xuất bản nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh. www.porkworld.com. www.octagon-services.co.uk. www.afbini.gov.uk.