Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương - Chương II: Các kỹ thuật nền của công nghệ sinh học hiện đại - Ninh Thị Thảo

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI 
 (9 TIẾT) 
 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn 
 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng 
gen 
 Các phương pháp lai phân tử 
 Phương pháp PCR, ứng dụng 
 Kỹ thuật xác định trình tự DNA 
 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 
8/26/2014 1 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Kiến thức ôn tập 
• Cấu trúc phân tử DNA 
8/26/2014 2 
Thành phần cấu tạo của DNA- các bazơ 
Purines Pyrimidines 
8/26/2014 3 
• polynucleotide chain 
• 3’,5’-phosphodiester bond 
ii). Structure of the 
 DNA double helix 
Structure of the DNA 
polynucleotide chain 
5’ 
3’ 
8/26/2014 4 
[structure of deoxyadenosine] 
Nucleoside 
Nucleotide 
8/26/2014 5 
8/26/2014 6 
DNA  RNA  Protein  Function 
Học thuyết trung tâm:The Central Dogma 
Transcription 
Replication 
Translation 
Work 
8/26/2014 7 
Phân loại Gene 
coding genes 
non-coding 
genes 
Messenger RNA 
Proteins 
Structural RNA 
Structural proteins Enzymes 
transfer 
RNA 
ribosomal 
RNA 
other 
RNA 
Chromosome 
(simplified) 
intergenic 
region 
8/26/2014 8 
2.1 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME - RE) 
 Khái niệm: là các enzyme có 
khả năng nhận dạng và cắt DNA 
ở những vị trí đặc hiệu. 
– Restriction enzymes = Restriction 
endonuclease 
 Endo (bên trong), nuclease (cắt nucleic 
acid) 
– Trình tự nhận biết của RE được gọi là trình 
tự giới hạn 
8/26/2014 9 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Ví dụ: trình tự nhận biết của EcoRI 
• 1950s: một số dòng vi khuẩn có khả năng chống lại sự 
xâm nhiễm của một số bacteriophages. 
• 1962: phát hiện các vi khuẩn này có chứa hệ thống 
enzyme có khả năng nhận biết và phá huỷ DNA của 
phage, đồng thời có khả năng tự biến đổi DNA của bản 
thân để tránh bị phá huỷ 
• 1970: Haminton Smith at Johns Hopkins University, Phát 
hiện được enzyme HindII từ Haemophilus influenzae: có 
khả năng cắt đặc hiệu đồng thời tự methyl hoá DNA của 
tế bào chủ để tự bảo vệ. 
8/26/2014 10 
Lịch sử phát hiện 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Restriction Endonucleases 
Why don’t bacteria destroy their own 
DNA with their restriction enzymes? 
8/26/2014 11 
Methylation 
8/26/2014 12 
• Loại I: Cắt tại điểm cách vị trí giới hạn 
khoảng 1000-5000 nucleotide 
• Loại II: cắt ngay tại vị trí giới hạn. 
• Loại III: cắt ở vị trí cách vị trí giới hạn đó 
khoảng 20 nucleotide. 
8/26/2014 13 
Phân loại các RE 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Genus (Tên chi) 
Species (Tên loài) 
Strain (Chủng) 
Thứ tự tìm ra enzyme 
(số La Mã) 
8/26/2014 14 
Cách gọi tên 
 Ví dụ: EcoRI 
 Escherichia 
 coli 
 R 
 I 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
8/26/2014 15 
Đặc điểm của trình tự nhận biết của RE loại II 
Don't nod 
Dogma: I am God 
Never odd or even 
Too bad – I hid a boot 
Rats live on no evil star 
No trace; not one carton 
Was it Eliot's toilet I saw? 
Murder for a jar of red rum 
Some men interpret nine memos 
Campus Motto: Bottoms up, Mac 
Go deliver a dare, vile dog! 
Madam, in Eden I'm Adam 
Oozy rat in a sanitary zoo 
Ah, Satan sees Natasha 
Lisa Bonet ate no basil 
Do geese see God? 
God saw I was dog 
Dennis sinned 
Trình tự nhận biết là các 
palindrome. Đây là đoạn DNA 
mạch kép, 2 mạch bổ sung có 
trình tự giống nhau khi đọc theo 
cùng chiều 5’3’ hoặc ngược lại 
T
rụ
c
 đ
ố
i x
ứ
n
g
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
 Nếu giả thiết trình tự sắp xếp của các loại base là ngẫu 
nhiên thì xác suất để một đoạn trình tự được nhận biết sẽ 
là 1/4n (n là chiều dài (bp) của chuỗi được nhận biết). 
8/26/2014 16 
Tần suất cắt 
Số nucleotide của đoạn 
nhận biết 
Xác suất xảy ra sự kiện 
phân cắt bởi RE 
4 1/ 44= 1/256 
5 1/ 45= 1/ 1024 
6 1/ 46= 1/ 4096 
8 1/ 48= 1/ 65.536 
n 1/ 4n 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
8/26/2014 17 
Các kiểu cắt 
5’ overhangs 
3’ overhangs 
blunt ends 
T
ạ
o
 đ
ầ
u
 s
o
le
T
ạ
o
 đ
ầ
u
 b
ằ
n
g
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
8/26/2014 18 
Ví dụ một số RE loại II 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
• Tạo DNA tái tổ hợp 
• Lập bản đồ giới hạn 
8/26/2014 19 
Ứng dụng của RE loại II trong công nghệ gen 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
• DNA tái tổ hợp là các DNA được tạo thành 
từ ít nhất hai đoạn DNA có nguồn gốc khác 
nhau thông qua vi thao tác của con người 
• Nếu như 2 (hay nhiều) DNA đều được cắt 
bởi cùng một loại enzyme thì các đầu cắt 
của các đoạn DNA được tạo ra hoàn toàn 
khớp nhau (tương ứng theo quy tắc bổ 
sung) gọi là các đầu dính và chúng rất dễ 
dàng gắn lại với nhau khi có mặt enzym 
ligase. Từ đây xuất hiện khả năng ghép nối 
các DNA có nguồn gốc khác nhau để tạo 
nên DNA tái tổ hợp 
8/26/2014 20 
Tạo DNA tái tổ hợp 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Bản đồ giới hạn 
• Là bản đồ thể hiện loại enzyme giới hạn, số lượng 
và kích thước các đoạn DNA bị cắt bằng enzyme 
giới hạn. 
• Một phân tử khi sử dụng các loại enzyme khác 
nhau có thể cho nhiều đoạn cắt khác nhau hình 
thành nên các bản đồ giới hạn khác nhau. 
• Được sử dụng trong xác định nguồn gốc hoặc sự 
khác nhau giữa các cá thể trong loài. 
8/26/2014 21 BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Phương pháp lập bản đồ giới hạn 
• Tách chiết DNA mẫu nghiên cứu và thực hiện PCR 
tạo ra một lượng DNA cần thiết. 
• Lựa chọn các enzym giới hạn thích hợp, xử lý 
enzym giới hạn các mẫu trong điều kiện thích hợp. 
• Điện di kết quả trên gel agarose cùng với thang 
DNA chuẩn, tính toán kết quả và lập bản đồ. 
8/26/2014 22 BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Sử dụng enzym 1 để cắt đoạn 
ADN nghiên cứu (kích thước 
17kb). Kết quả cho 3 đoạn ADN 
(6kb, 3kb, 8kb). Điều này chứng 
tỏ enzym 1 có 2 vị trí cắt trên 
đoạn ADN nhưng chưa rõ đoạn 
3kb nằm ở giữa hay ở cuối sợi. 
Khi cắt sợi ADN nghiên cứu 
bằng enzym 2, kết quả cho 2 
đoạn cắt (7kb, 10kb) chứng tỏ 
enzym này chỉ có một điểm cắt 
trên sợi 17kb. Khi cắt bằng tổ 
hợp hai enzym 1 và 2 cho thấy 
có sự xuất hiện lại đoạn 6kb và 
8kb, hai đoạn này là sản phẩm 
của sự hoạt động của enzym 1. 
Như vậy đoạn 3kb sẽ bị cắt bởi 
enzym 2 (vỡ kết quả cắt phối 
hợp cho 4 đoạn (6kb, 8kb, 2kb, 
1 kb). Từ đây suy ra đoạn 3kb 
phải nằm ở giữa sợi. 
VÍ DỤ VỀ LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HẠN 
8/26/2014 23 
Restriction enzyme animation 
8/26/2014 24 
Bµi tËp 
 Nhân dòng một đoạn ADN có chiều dài 900 bp sau đó phân 
cắt với 3 enzyme, chạy điện di cho các kết quả sau đây: 
Enzyme Độ lớn các đoạn phân cắt 
(bp) 
EcoRI 
Hind III 
BamHI 
EcoRI + Hind III 
EcoRI + BamHI 
HindIII + BamHI 
200, 700 
300,600 
50,350,500 
100,200,600 
50,150,200,500 
50,100,250,500 
Hãy vẽ bản đồ giới hạn từ những số liệu trên? 
8/26/2014 25