Bài giảng Sinh học phần tử - Chương 7: Kỹ thuật tạo dòng - Nguyễn Hữu Trí

thêm nhóm methyl vào
nucleotide chuyên biệt (vào A hay C) trong trình tự
nhận biết (recognition sequence). Sự methyl hóa ngăn
chặn sự nhận biết của restriction enzyme.
• Do đó, restriction enzyme trong một tế bào không phân
cắt DNA của chính nó. Tuy nhiên restriction enzyme
có thể phân cắt DNA ngoại lai xâm nhập vào trong tế
bào như của bacteriophage.
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí4
3Restriction Endonuclease
Loại I- có nhiều tiểu đơn vị,có hoạt tính endonuclease và
methylase, cắt một cách ngẫu nhiên tại vị trí cách vị trí
nhận biết (recognition sequence) 1000 bp
Loại II- cắt DNA ngay vị trí nhận biết, không cần ATP,
hầu hết ở dạng đơn phân
Loại III- có nhiều tiểu đơn vị, có hoạt tính endonuclease
và methylase cắt cách 25 bp từ trình tự nhận biết.
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí5
Restriction Enzyme
• Restriction enzyme 
(endonulease) cắt DNA 
tại trình tự đặc hiệu
• Những loại cầu nối nào 
bị RE cắt?
– Cầu nối đồng hóa trị 
(trong một chuỗi) 
– Cầu nối hydrogen (giữa 
hai chuỗi) Cầu nối 
hydrogen
Cầu nối đồng hóa trị
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí6
4RE hoạt động như thế nào?
• Vị trí nhận biết của enzyme
– Mỗi enzyme cắt DNA tại một trình
tự đặc biệt  restriction site
– Enzyme nhận biết 4-, 6- hoặc 8-
cặp base, trình tự lặp đảo
(palindromic sequence)
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí
7
Đầu dính và đầu bằng
• Khi các enzyme cắt, chúng có thể tạo ra
– Đầu dính: một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên
hai mạch. Trong trường hợp này các đầu dính
có thể bắt cặp trở lại
– Đầu bằng: một số RE cắt hai mạch DNA tại
cùng một điểm, sau khi cắt hai đầu bằng không
có khả năng tự kết hợp lại. Để nối chúng lại
phải dùng enzyme T4 ligase.
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí8
5Tên của restriction enzyme đến từ:
• Loại vi khuẩn mà enzyme được tìm thấy
• Thứ tự mà restriction enzyme được xác định và phân lập.
EcoRI là một ví dụ
Chủng R của vi khuẩn E.coli
I là restriction enzyme đầu tiên của E.coli được khám phá.
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí9
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí10
6Ứng dụng RE
Việc sử dụng RE có ý nghĩa quyết định trong sự
phát triển của sinh học phân tử eukaryote. Chúng
cho phép cắt nhỏ bộ nhiễm sắc thể khổng lồ ở
eukaryote
Các RE chủ yếu được sử dụng trong việc tạo dòng
với mục đích tạo ra một số lượng lớn các bản sao
của một trình tự DNA xác định.
Chúng cũng được ứng dụng để lập bản đồ cắt giới
hạn (restriction map) vào việc phân tích so sánh bộ
gen ở các loài khác nhau thông qua kỹ thuật RFLP
(Restriction Fragments Length Polymorphism –
Tính đa hình kích thước của các trình tự giới hạn)
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí11
• DNA pol xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’→
3’ như:
– DNA pol I (Klenow pol): polylerase 5’→ 3’ , exonuclease 3’→ 5’
– T4 DNA pol: giống Klenow pol nhưng exonuclease 3’→ 5’ mạnh hơn
– Taq pol: phân lập từ Thermus aquaticus
– Pfu pol : phân lập từ Pyroccus furiosus
– Reverse transcriptase:do các Retrovirus sản sinh
– DNA terminal transferase: li trích từ tuyến ức bê
• RNA pol tham gia vào việc tổng hợp RNA theo
chiều 5’→ 3’, thông dụng nhất là:
– SP6 RNA polymerase: có nguồn từ phage xâm nhiễm Salmonella
typhimurium
– T3 và T7 RNA polymerase: có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm E.coli
Polymerase
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí12
7Các ligase
• Đây là enzyme xúc tác cho phản ứng
nối giữa hai đoạn DNA (DNA ligase) 
hay RNA (RNA ligase). 
• Có các ligase sau:
– T4 DNA (RNA) ligase: li trích từ phage T4
xâm nhiễm E. coli
– T4 polynucleotide kinase: li trích từ phage
T4 xâm nhiễm E. coli
– Alkaline phosphastase: li trích từ E. coli
hay từ ruột bê
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí13
Các nuclease
• Đây là nhóm phân cắt DNA hay RNA. Gồm
các enzyme chính sau:
– DNAase I: có nguồn gốc từ tụy tạng bò
– Nuclease S1: ly trích từ Aspergillus oryzae
– Exonuclease III: tách chiết từ E. coli
– RNAase A: hiện diện khắp mọi nơi
– RNAase H: dùng trong tổng hợp cDNA
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí14
83/24/2016 Nguyễn Hữu Trí15
Kỹ thuật tạo dòng
Tạo dòng phân tử (molecular cloning)
- Tạo dòng phân tử dùng kỹ thuật di truyền phân lập và
làm thuần một gen:
+ Tách và phân đoạn DNA nguồn
+ Gắn các đoạn DNA bị cắt vào vector dòng hóa
+ Biến nạp và giữ DNA tái tổ hợp trong tế bào chủ: ngân hàng
DNA (DNA library, DNA bank)
+ Phát hiện và làm thuần dòng mục tiêu
+ Nuôi cấy dòng mục tiêu để ly trích và nghiên cứu DNA tái tổ
hợp
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí16
9• Restriction enzyme và DNA
ligase có thể được sử dụng để
tạo DNA tái tổ hợp, DNA có thể
được cắt nối lại với nhau từ các
nguồn khác nhau
• Tạo dòng (Cloning) có nghĩa là
gắn một đoạn DNA (một gen vào
một vector tạo dòng (cloning
vector) sau đó đặt vào một tế
bào sống (“Biến nạp”) để
khuếch đại gen mục tiêu.
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí17
DNA tái tổ hợp
Vị trí cắt giới hạn
DNA
Đầu dính
Enzyme RE cắt sườn
đường - phosphate
5
3
3
5
1
DNA tái tổ hợp
10
Đoạn DNA mục tiêu
được cắt bằng cùng
RE, bắt cặp xảy ra.
2
Một khả năng tái tổ hợp
Vị trí cắt giới hạn
DNA
Đầu dính
Enzyme RE cắt sườn
đường - phosphate
5
3
3
5
1
DNA tái tổ hợp
Phân tử DNA tái tổ hợp
DNA ligase
nối lại
3
2 Đoạn DNA mục tiêu
được cắt bằng cùng
RE, bắt cặp xảy ra.
Một khả năng tái tổ hợp
Vị trí cắt giới hạn
DNA
Đầu dính
Enzyme RE cắt sườn
đường - phosphate
5
3
3
5
1
DNA tái tổ hợp
11
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí21
Sử dụng các DNA được tạo dòng là cách đầu tiên xây dựng bản đồ
cắt giới hạn.
– phân tích giải trính tự DNA được tạo dòng
– Sử dụng DNA tạo dòng làm probe xác định rõ mức độ phiên
mã, kích thước của mRNA
– Sử dụng DNA tạo dòng như một probe để xác định DNA
tương tự trong các loài khác nhau hoặc tạo thành thư viện tạo
dòng
– Sản xuất thật nhiều gen được tạo dòng (Ví dụ insulin protein)
– Sử dụng tạo dòng để tạo antisense mRNA cho gene silencing
– Tạo một reporter gene để xác định sự biểu hiện của gen
Tại sao phải tạo dòng DNA?
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí22
12
– Restriction endonuclease để cắt DNA
– DNA Ligase để nối DNA
– Vector để gắn DNA
– Tế bào chủ để khuếch đại DNA
– Công cụ để chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ
– Công cụ để giữ DNA trong tế bào chủ
– Công cụ để xác định xem tế bào nào đã được tạo
dòng thành công (tầm soát)
Công cụ tạo dòng
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí23
Thể mang gen: vector
– Một vector cần có các đặc điểm tiêu chuẩn sau:
– Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ
thuộc vào tế bào chủ
– Có đặc tính giúp dễ xác định tế bào có chúng
– Mang những vị trí nhận biết duy nhất của các enzyme cắt giới
hạn
– Có kích thước càng nhỏ càng tốt, dễ xâm nhập, sao chép
nhanhhiệu quả.
– Có số lượng bản sao trong tế bào cao
– Các vector cần biểu hiện thì phải có promoter mạnh
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí24
13
Thể mang gene: vector
– Vector: phân tử DNA kích thước nhỏ dùng để mang
gene, sao chép, thao tác trên gene.
– Vector tạo dòng và vector biểu hiện
– Vector tạo dòng: chuyển và lưu trữ gen tái tổ hợp trong
tế bào chủ, nhân bản, thao tác, phân tích sau đó trên
DNA tái tổ hợp sẽ dễ dàng hơn
– Vector biểu hiện: tạo sản phẩm của gen tái tổ hợp ở
mức phiên mã, dịch mã, phân tích trình tự điều hòa sự
biểu hiện của gene.
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí25
Vector
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí26
14
Sự khác nhau của các vector tạo dòng
• Loại tế bào mà chúng có thể vào
• Cách thức mà chúng xâm nhập (bằng biến nạp hay bằng
cách xâm nhiểm của virus/phage)
• Độ lớn của đoạn DNA ngoại lai mà chúng có thể mang
• Vị trí cắt giới hạn chính xác của enzyme cắt giới hạn
• Sự ổn định của DNA khi được chèn vào
• Những khía cạnh quan tâm
– Hiệu quả tạo dòng
– Số lượng bản sao (trên một tế bào chủ)
– Khả năng tầm soát (ví dụ hệ thống Lac Z)
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí27
Plasmid là các vector tạo dòng
• Vị trí cắt hạn chế duy nhất để chèn DNA mục tiêu (vùng
polylinker), có thể nằm cắt ngang gen lacZ mã hóa cho Beta-
galactosidase, một enzyme chuyển khuẩn lạc thành màu xanh khi
hiện diện X-gal (khuẩn lạc chuyển thành màu tráng khi có một
đoạn DNA ngoại lai chèn thành công vào vùng polylinker và làm
bất hoạt gen lacZ)
• Có promoter mạnh nằm ở hai phía của vùng polylinker để biểu
hiện DNA được tạo dòng.
• Một oriC
• Marker chọn lọc (Ví dụ. Gen kháng kháng sinh) nếu không có
biến nạp vi khuẩn sẽ chết (chắc chắn rằng chỉ có những vi khuẩn
được biến nạp thành công mới sống)
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí28
15
– Plasmid là những đoạn DNA ngắn (2-5kb) dạng chuỗi xoắn
kép, dạng vòng, có thể tự nhân đôi độc lập với DNA bộ gen
– Có số bản copy cao trong tế bào E. coli (100)
– Gen khác kháng sinh (marker chọn lọc, VD. AmpR; có nghĩa là
E. coli có khả năng kháng khi biến nạp thành công nhận được
plasmid)
– Tạo dòng tốt với đoạn DNA 5-10 kb (nhỏ)
– Rất dễ sử dụng
Plasmid
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí29
Các loại plasmid
• Plasmid thế hệ thứ nhất: tìm thấy trong tự nhiên
(ColE1, pSC101)
• Plasmid thế hệ thứ hai: plasmid nhân tạo (pBR322:
kích thước 4364 bp, mang hai gen ApR, TetR và 20 vị
trí nhận biết duy nhất của các enzyme cắt giới hạn)
• Plasmid thế hệ thứ ba: đây là các plasmid mạnh
hiện nay có hai đặc tính cơ bản
– Kích thước nhỏ
– Có mang một polylinker
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí30
16
Vector tạo dòng là phage
+ Bacteriophage vector
+ Được thiết kế để đi vào chu trình tan
+ Có khả năng sinh sôi nhanh, hiệu quả xâm nhiễm cao hơn hẳn plasmid
+ Tạo dòng tốt với những đoạn DNA lớn hơn nhiều so với plasmid (5-20 kb)
+ Phage không dễ thao tác như plasmid
+ Phage  được loại bỏ 1/3 bộ gen chỉ giữ lại vùng chứa gen xâm nhập, tự sao và
lắp ghép
+ DNA ngoại lai được đưa vào tế bào chủ qua phage này, nhân bản và lưu trữ
cùng với phage
+ Vector phage  chứa ít trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn
+ Thực khuẩn thể M13
+ Bộ gen mạch đơn có kích thước 6,4 kb
+ Ưu điểm của vector này là tạo được một số lượng lớn DNA mạch đơn
+ Thường dùng để giải trình tự DNA
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí31
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí32
Vector tạo dòng là phage
17
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí33
Vector tạo dòng là phage
– Kết hợp giữa bacteriophage và plasmid
– Tạo ra, đóng gói ssDNA với sự trợ giúp của phage
– Hoặc có thể biến nạp vào E. coli khi nó thể hiện
giống một plasmid (kích thước hạn chế giống một
plasmid)
– Ví dụ. pBluescript (pBS)
– Có promoter phage T3 và T7 trên mỗi hướng cho
việc tổng hợp ssRNA in vitro.
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí34
Vector tạo dòng là phagemid
18
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí35
Vector tạo dòng là Phagemid
– Thiết kế nhân tạo bởi sự kết hợp được ưu điểm
plasmid DNA và trình tự cos từ phage 
– Khi vào trong tế bào chủ, có khả năng sao chép
như plasmid. Plasmid tái tổ hợp bền hơn trong tế
bào chủ
–Rất tốt để tạo dòng những đoạn gen rất lớn DNA
(35-45 kb). Hiệu suất chuyển gen cao hơn
– Plasmids càng lớn thì càng khó thao tác
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí36
Vector tạo dòng là Cosmid
19
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí37
Vector tạo dòng là Cosmid
• BAC (Bacterial artificial chromosome – NST nhân tạo
vi khuẩn)
– Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn
– Dùng để tạo dòng những đoạn DNA rất lớn vào E. coli (tốt và ổn định –
sử dụng trong tạo dòng HGP)
– Có chứa ORI của nhân tố f; sử dụng giống plasmid.
– BAC có thể mang đoạn DNA với kích thước từ 75-300 kb.
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí38
Vector tạo dòng là BAC
20
Eukaryotic vector
– Ti plasmid của Agrobacterium tumefaciens dùng để tạo
dòng ở thực vật. Kích thước từ 180 – 205 kb, có thể mang
đoạn DNA kích thước khá lớn, lên đến khoảng từ 30 - 150
kb.
– YAC (Yeast artificial chromosome – NST nhân tạo nấm
men) Kích thước 10kb mang được DNA 100 – 1000kb. Sao
chép như một nhiễm sắc thể bình thường của nấm men.
Dùng để tạo bản đồ vật lý bộ gen ví dụ bộ gen người
(nhưng không bền như BAC).
– MAC (mammalian artificial chromosome – NST nhân tạo
động vật hữu nhũ): gồm có tâm động, telomere và ORI của
động vật hữu nhũ, mang được đoạn gene từ 10 kb đến nhỏ
hơn 1000kb.
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí39
Vector tạo dòng
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí40
21
Ưu điểm của Prokaryote
1. Phát triển nhanh
2. Thao tác dễ dàng
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí41
Nhược điểm của Prokaryote
1. Không thể tách các intron ra
2. Intron cần thiết cho sự biểu hiện của gen
3. Kích thước DNA đưa vào vi khuẩn bị hạn chế
4. Prokaryote không có cơ chế glycosyl hóa protein
Tế bào chủ
- E. coli:
+ Tế bào chủ phổ biến nhất, dễ nuôi, sinh sản nhanh
+ Vi sinh vật gây bệnh cơ hội
+ Không tiết enzyme
- Bacillus subtilis:
+ Không gây bệnh, không tạo nội độc tố, tiết protein
+ Pasmid không ổn định trong tế bào chủ.
- Saccharomyces cerevisiae:
+ Tế bào eukaryote được nghiên cứu di truyền kỹ nhất
+ Sử dụng để thể hiện gene eukaryote.
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí42
22
Cải tiến tế bào chủ E. coli
• Thông thường E. coli dùng để tạo dòng thường
được cải tiến:
– Loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế bằng cách
gây đột biến trong hệ thống sửa đổi hạn chế nội
sinh
– Hệ thống tái tổ hợp DNA được sửa đổi để ngăn
chặn sự tái tổ hợp
– Thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng
lượng plasmid tích lũy trong tế bào
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí43
DNA 
nhiễm sắc thể
Tế bào chứa
gene mục tiêu
Gene được chèn
vào plasmid
Plasmid được
đưa vào tế
bào vi khuẩn
DNA tái tổ hợp
(plasmid)
Vi khuẩn
tái tổ hợp
Nhiễm sắc thể
vi khuẩn
Vi khuẩn
Gene 
mục tiêu
Plasmid
1
2
Các bước tạo dòng
23
Tế bào chủ được nuôi
để hình thành một dòng
tế bào có chứa gene mục
tiêu đã được tạo dòng.
Gene mục tiêu Protein được biểu
hiện bởi gene mục tiêu
Nghiên cứu cơ bản
và rất nhiều ứng dụng
Nhiều bản sao của gene Thu nhận protein
Nghiên cứu
cơ bản về gene
Nghiên cứu
cơ bản về protein
4
Vi khuẩn
tái tổ hợp
Gene kháng sâu
bệnh được đưa
vào thực vật
Gene được dùng để
tạo vi khuẩn tẩy
sạch chất thải độc
Protein làm tan cục
máu động trong liệu
pháp chống đau tim
Hormone tăng trưởng
điều trị chống còi cọc
3
Tạo dòng một gene từ Eukaryotic vào một plasmid
• Trong tạo dòng gene, plasmid được gọi là vector tạo
dòng.
• Một vector tạo dòng là một phân tử DNAcó thể
mang DNA ngoại lai vào một tế bào chủ và nhân
lên độc lập với DNA tế bào chủ.
24
Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp
• Các bước để tạo dòng gene β-globin từ chim ruồi
(hummingbird) vào một plasmid vi khuẩn.
Tế bào vi khuẩn
Plasmid
vi khuẩn
lacZ gene
Tế bào chim ruồi
Gene mục tiêu
Các mảnh DNA 
của chim ruồi
Restriction
site
Đầu dính
ampR gene
Kỹ thuật
Các plasmid tái tổ hợp
Plasmid không taí tổ hợp
Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp
Tế bào vi khuẩn
Plasmid
vi khuẩn
lacZ gene
Tế bào chim ruồi
Gene mục tiêu
Các mảnh DNA 
của chim ruồi
Restriction
site
Đầu dính
ampR gene
25
Vi khuẩn mang
plasmid
Tạo dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp
Tế bào vi khuẩn
Plasmid
vi khuẩn
lacZ gene
Tế bào chim ruồi
Gene mục tiêu
Các mảnh DNA 
của chim ruồi
Restriction
site
Đầu dính
ampR gene
Các plasmid tái tổ hợp
Plasmid không taí tổ hợp
Kết quả
Khuẩn lạc mang plasmid 
không tái tổ hợp với gene 
lacZ còn nguyên.
Các tế bào
cùng dòng
Khuẩn lạc mang plasmid 
tái tổ hợp với gene 
lacZ bị bất hoạt
Tế bào vi khuẩn
Plasmid
vi khuẩn
lacZ gene
Tế bào chim ruồi
Gene mục tiêu
Các mảnh DNA 
của chim ruồi
Restriction
site
Đầu dính
ampR gene
Kỹ thuật
Các plasmid tái tổ hợp
Plasmid không taí tổ hợp
Vi khuẩn mang
plasmid
Tạo dòng tế bào mang
plasmid tái tổ hợp
26
Tái tạo dòng (subcloning)
• Tái tạo dòng là kiểu đơn giản nhất của thí
nghiệm tạo dòng, là quá trình chuyển DNA đã
được tạo dòng từ vector này sang vector khác
để biểu hiện nó trong một chủng chủ nhất định.
• Các bước cơ bản của tái tạo dòng cũng tương
tự như tạo dòng
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí51
Thư viện DNA
• Dựa vào bản chất của DNA cần tạo dòng người ta phân biệt
hai loại thư viện gen:
– thư viện bộ gen và thư viện cDNA
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí52
27
Thư viện bộ gen (Genomic library)
– Thư viện bộ gen được lập là tập hợp tất cả các trình tự
DNA cấu thành bộ gen đầy đủ đã được gắn vào
vector. Các vector tái tổ hợp sau đó được đưa vào tế
bào chủ. Các tế bào chủ sau đó được nuôi cấy trên
môi trường và tạo thành các dòng. Vector có thể là
plasmid hoặc phage.
– Thư viện bộ gen thường được lập cho prokaryote
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí53
Các dòng
vi khuẩn
Các plasmid
tái tổ hợp
Phage DNA
pái tổ hợp
Hoặc
Toàn bộ genome 
được cắt bằng
enzyme cắt giới hạn
(a) Thư viện Plasmid (b) Thư viện Phage
Các dòng
Phage
Thư viện bộ gen (Genomic library)
28
• Bacterial artificial
chromosome (BAC)
là một plasmid lớn đã
được biến đổi để có
thể mang được đoạn
DNA lớn.
• BACs là một loại khác
của vector được sử
dụng trong xây dựng
thư viện DNA.
Thư viện bộ gen (Genomic library)
(c) Một thư viện các dòng
bacterial artificial chromosome (BAC)
Plasmid lớn
Đoạn chèn lớn với
nhiều gene mục tiêu
Các dòng
BAC
Thư viện cDNA
– Thư viện cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả
các mRNA của một tế bào. Như vậy không giống với
thư viện bộ gen, thư viện cDNA được thiết lập từ một tế
bào xác định trong đó gen cần nghiên cứu phải biểu
hiện thành mRNA
– Thường được lập cho eukaryote
– cDNA được tổng hợp từ mRNA trưởng thành
(eukaryote) (Không có các đoạn intron) sử dụng enzyme
Reverse transcriptase, RNase H , DNA Polymerase I, và
nuclease S1.
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí56
29
DNA trong nhân
mRNAs trong
tế bào chất
Tổng hợp cDNA
Reverse
transcriptase Đuôi Poly-A 
DNA Primer
mRNA
DNA trong nhân
mRNAs trong
tế bào chất
Tổng hợp cDNA
30
Reverse
transcriptase
DNA Primer
mRNA
Phân cắt
mRNA
Đuôi Poly-A 
DNA trong nhân
mRNA trong
tế bào chất
RNase H
Tổng hợp cDNA
Reverse
transcriptase
Primer
mRNA
DNA 
polymerase I
DNA
Phân cắt
mRNA
Đuôi Poly-A 
DNA trong nhân
mRNA trong
tế bào chất
RNase H
31
Reverse
transcriptase
Primer
mRNA
cDNA
DNA 
polymerase I
DNA
Phân cắt
mRNA
Đuôi Poly-A 
DNA trong nhân
mRNA trong
tế bào chất
RNase H
nuclease S1
Tổng hợp
cDNA
Tuyển chọn dòng mục tiêu
• Để có thể phân lập dòng tế bào chủ tái tổ hợp chứa
gen mục tiêu trong một thư viện DNA hay một thư
viện cDNA, người ta phải sử dụng các phương pháp
sàng lọc.
• Thông thường các phương pháp sàng lọc được xây
dựng dựa trên việc sử dụng mẫu dò DNA.
• Mẫu dò DNA (probe) là một đoạn oligonucleotide
được đánh dấu và nó bổ sung hoặc bổ sung một phần
với gen mục tiêu.
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí62
32
Tuyển chọn dòng mục tiêu
- Gen được biểu hiện trong tế bào chủ là vi khuẩn:
+Lai miễn dịch (Western blotting, Immunoblotting)
+ Hoạt tính enzyme
+ Bổ trợ đột biến (gen ngoại lai đồng dạng với gen
của tế bào chủ)
- Gen ngoại lai không biểu hiện trong tế bào chủ:
+ Lai insitu:
+ Lai khuẩn lạc (colony hybridization):
vector là plasmid
+ Lai plaque (plaque colonization): vector là phage
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí 63
Tuyển chọn dòng mục tiêu
G5 3 G GC C CT TTAA A
C3 5C CG G GA AATT T
Gene mục tiêu
Probe
(Được đánh dấu)
• Một dòng mang gene mục tiêu có thể được xác định
bằng cách dùng nucleic acid probe có trình tự bổ
sung với gene.
• Quá trình này được gọi là lai nucleic acid.
33
Probe
DNA
Phân tử Probe 
được đánh
dấu phóng xạ
Film
Màng nylon 
Đĩa nhiều giếng
chứa các dòng
của thư viện
Vị trí của
DNA với trình
tự bổ sung
Gene mục tiêu
DNA mạch đơn
từ tế bào
Màng nylon
•
Tuyển chọn dòng mục tiêu
Vector biểu hiện (expression vector)
- Để biểu hiện gen ngoại lai:
+ Thu protein tái tổ hợp
+ Nghiên cứu các yếu tố điều hòa thể hiện của gen 
- Gen ngoại lai được kiểm soát bằng promoter được nhận diện bởi RNA 
polymerase của tế bào chủ:
+ Promoter mạnh
+ Khung dịch mã đúng
+ Promoter thường dùng: lac, trp (cơ chế tắt mở)
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí 66
34
Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật di truyền
- Sản xuất những sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật
- Sản xuất vắcxin phòng chống virus
- Sản xuất protein của động vật hữu nhũ
- Tạo ra các thực vật, động vật chuyển gen
- Phân lập và ứng dụng nguồn gen vi sinh trong xử lý môi
trường
- Tạo các thuốc điều hòa sự thể hiện của gen
- Liệu pháp gen chữa trị các bệnh di truyền
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí67
3/24/2016 Nguyễn Hữu Trí68