Báo cáo Các kỹ thuật sắc ký

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINHBỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌCLỚP: DH06SHBài báo cáo môn Chẩn đoán bệnh gia súc, gia cầm bằng sinh học phân tửGVHD: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI Sinh viên thực hiện: ĐINH CÁT ĐIỀM	 	 MSSV: 06126027 Tháng 10/2009Các kỹ thuật sắc kýMỤC LỤCI) ĐẶT VẤN ĐỀII) NỘI DUNGIII) KẾT LUẬN I) ĐẶT VẤN ĐỀCác tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác nhau (protein, acid nucleic, lipid, )Những hợp chất trên có thể hiện diện ở số lượng nhỏ, dưới dạng vết (enzyme) hay ở số lượng nhiều (các protein cấu tạo)Người ta phải tìm cách tách các tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học	 Sắc ký (chromatography). Sắc ký đã được sử dụng để tách tất cả các hợp chất dù có màu hay không, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn. Nhưng vì các phân tử sinh học rất thiên hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớn nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều hay ít khác nhau nên không thể nào có một kỹ thuật sắc ký chung cho các loại hợp chất khác nhau. 	“Các kỹ thuật sắc ký” II) NỘI DUNGII.1) Lịch sử sắc ký	II.2) Định nghĩa sắc ký	II.3) Các giai đoạn của quá trình sắc ký	II.4) Các kỹ thuật sắc ký	II.4.1) Sắc ký giấy	II.4.2) Sắc ký lớp mỏng	II.4.3) Sắc ký cột	II.4.4) Sắc ký trao đổi ion	II.4.5) Sắc ký gel	II.4.6) Sắc ký ái lực	II.4.7) Sắc ký tương tác kỵ nước	II.4.8) Sắc ký khí	II.4.9) Sắc ký lỏng cao áp II.1) Lịch sử sắc ký	Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett đã cho dung dịch các sắc tố thực vật trong ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy các sắc tố bị hấp phụ lên trên đầu cột. Khi cho ete dầu hoả lên cột, các sắc tố di chuyển trong cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố có một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ mà Tvest gọi đó là sắc đồ. Ông đặt tên cho phương pháp tách này là sắc ký (Chromatography). Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp này được phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật khác nhau Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel. Đến năm 1964, Moor gọi là “gel permeation chromatography” Năm 1906, sắc ký khí được biết đến nhưng đến 1952, kỹ thuật này mới phát triển mạnh mẽ, nhất là trong thập niên 1960.Năm 1967, Horvath C. là tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp.Michael Tswett (1872 – 1919) II.2) Định nghĩa sắc kýSắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dừng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch các phân tử sinh học II.3) Các giai đoạn của quá trình sắc kýĐưa hỗn hợp lên pha tĩnh  Các chất được giữ trên pha tĩnh. b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh Pha động sẽ kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromatogram). c) Phát hiện các chất Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử.II.4) Các kỹ thuật sắc kýII.4.1) Sắc ký giấy	Sắc ký giấy (Paper chromatography)là một phương pháp phân tách dễ dàng các thành phần của một hỗn hợp (acid amin). 	Pha tĩnh là một tờ giấy bằng cellulose (tờ giấy thấm, giấy lọc trong phòng thí nghiệm). Các lọai giấy này có tính ái nước nên trên thực tế, pha tĩnh là một lớp nước (H2O) thật mỏng đã được che phủ lên trên bề mặt của tờ giấy, chính vì thế sắc ký giấy là lọai sắc ký phân chia. 	Pha động là chất lỏng( có thể là chất lỏng hay một hỗn hợp dung môi). Phương pháp này thường được sử dụng để tách các chất ưa nước như amino acid, đường,..Hình: Sắc ký giấy, các chất màu di chuyển theo dung môi lên giấy với các điểm khác nhau.Một giọt hỗn hợp (drop of mixture) đặt ở một góc mảnh giấy lọc, một cạnh giấy nằm trong dung môi.Dung môi di chuyển lên tấm giấy bằng lực hút mao mạch, các chất sẽ phân bố theo các tỷ lệ khác nhau Mỗi hợp chất di chuyển với tốc độ phản ánh kích thước của phân tử của nó và hòa tan của nó trong dung môi.Những chất khác nhau sẽ được trải ra ở những điểm khác biệt trên bảng , tạo thành một bảng sắc ký giấy.	Do phần lớn các chất hữu cơ không có màu, nên sắc ký giấy sẽ không cho thấy được vị trí của mẫu chất trong quá trình dung môi di chuyển đi lên giấy. Hiện nay, sắc ký giấy đang dần được thay thế bằng sắc ký lớp mỏng. II.4.2) Sắc ký lớp mỏng	Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) 	Dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silicagel hay oxid alumin). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng. Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy.Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin,..) được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấm nhôm, hay tấm plastic. Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha lõang 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phái trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình. 	Pha động: dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Các bước thực hiện sắc ký lớp mỏng Chuẩn bị ống vi quản, tấm bản mỏng, dung dịch mẫu Nhờ một vi quản để dung dịch mẫu lên bề mặt tấm sắc ký lớp mỏng một cách thận trọng, tránh không cho làm lũng bề mặt của lớp mỏng. Mỗi vết chấm trên bản không chứa nhiều hơn 12ug (10ug là tối ưu) mẫu chất.Sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên Hiện hình các vết sau khi giải ly Hình: Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏngCác hợp chất có màu sẽ được nhìn thấy bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phương pháp vật lý hay dùng phương pháp hóa học.Phương pháp vật lýPhát hiện bằng tia tử ngoại UV Đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng này nhận ra các hợp chất có thể hấp thu tia UV, các hợp chất có màu tối sẫm trên nền sángĐèn chiếu tia UV 366nm ánh sàng này phát hiện những hợp chất có phát hùynh quang, các vết sẫm của chất mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu Phương pháp hóa họcBằng cách dung thuốc thử hiện hìnhHơi iod, 2,7-fluorescein phát hiện đa số hợp chất hữu cơ, Ninhydrin phát hiện aminoacid hay amin, 2,4-dinitrophenylhydrazin phát hiện aldehyde hay cetonClorur antimony phát hiện steroid hay vitamin hay carotenoid, II.4.3) Sắc ký cộtSắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150um), được nạp trong cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phái trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặ ngay ống dẫn ra của cột. Phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột cũng có ưu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn.Các bước thực hiện sắc ký cột:Lựa chọn chất hấp thu: pha tĩnh là silicagel loại thườngLựa chọn dung môi:etyl acetate Nạp chất hấp thu dạng khô vào cộtNạp mẫuCho dung môi vào đầy cột để tiến hành giải ly trên cộtII.4.4) Sắc ký trao đổi ionSự trao đổi ion là sự gắn kết có tính chất thuận nghịch giữa các phân tử có mang điện tích. Trong sắc ký cột nhồi , pha tĩnh R có gắn thêm nhóm chức G mang điện tích. Giả sử cho đi ngang qua cột một hỗn hợp mẫu chất ban đầu có chứa nhiều lọai chất tan (solute) khác nhau, chất tan nào có mang điện tích ngược dấu với điện tích của nhóm chức.Thí dụ chất tan S, chất tan dẽ đuổi đối ion C ra thế chỗ vào, để gắn vào pha tĩnh, và như thế chất tan sẽ bị giữ lại trong cột, trong khi đó những chất khác của hỗn hợp mẫu chất ban đầu sẽ không bị giữ lại nên đi ra khỏi cột. Kỹ thuật này tách riêng được hợp chất S ra khỏi hỗn hợp ban đầu.Các loại hạt nhựa trao đổi ion: nhựa polystyren, silicagel, polymer carbohydrate Các bước trong sắc ký trao đổi ion Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột Nạp mẫu chất lên đầu cột Nối cột với bình cung cấp dung dich giải lyGiải ly bằng cách tăng dần nồng độ dung dịch giải ly Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm II.4.5) Sắc ký gelTrong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng này được phủ đầy dung môi dùng làm pha động. Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có trọng lượng phân tử khác nhau cò thể tách riêng được hay không là tuỳ vào kích thước lỗ rỗng. Các phân tử có kích thước lớn hơn lỗ rỗng, không thể chui lọt vào bên trong lỗ rỗng, nhanh chóng theo dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột. các phân tử có trọng lượng phân tử (TLPT) nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng, sẽ toàn phần hay bán phần lọt vào lỗ rỗng, tuy rằng cuối cùng rồi cũng theo dòng chảy đi ra khỏi cột nhưng sẽ chậm trễ hơn.Dòng chảy pha động khiến các phân tử lớn không thể chui vào lỗ rỗng của mạng gel, nhanh chóng đi xuyên qua cột, ra khỏi cột, trong khi phân tử nhỏ ra khỏi cột lâu hơn vì còn chui vào và đi ra khỏi lỗ rỗng của gel. Như vậy, các thành phần khác nhau của hỗn hợp mẫu khi đi ngang qua cột sắc ký gel, sẽ ra khỏi cột lần lượt theo trình tự TLPT lớn đi ra khỏi cột trước, phân tử nhỏ đi ra khỏi cột sau.Sắc ký gel phải thực hiện trong cột hình ống trụ bằng thuỷ tinh, gồm các bước sau:Nhồi gel vào cột Đặt mẫu cần sắc ký lên đầu cột gel Triển khai sắc ký gel 	Các chất tan sẽ ra khỏi cột theo thứ tự TLPT giảm dần Ứng Dụng: Kỹ thuật này dùng để tách các đại phân tử có nguồn gốc sinh học như: protein, polysaccharide, acid nuleic, enzyme,.. Người ta ứng dụng vào việc đóan TLPT của một hợp chất chưa biết II.4.6) Sắc ký ái lựcSắc ký ái lực hấp thụ phát hiện các ái lực sinh học mà một phân tử sinh học có với một phân tử khác được cố định trên một pha ổn định.Nhược điểm: đắt tiền, khó tẩy rửa, chọn lọc ligand (phối tử), gắn kết ligand lên giá thể hoạt hóa thường gặp nhiều khó khăn.Ưu điểm: phát triển phương pháp tinh sạch trên protein A (protein A là antigen cho IgG), bước bắt giữ tốt, cho phép phân tách protein dạng nguyên thủy còn họat tính với dạng biến tính II.4.7) Sắc ký tương tác kỵ nước	Sắc ký tương tác kỵ nước là phuơng pháp bổ sung khá tốt cho các kỹ thuật phân tách khác. Trong những năm gần đây, phương pháp này trở nên thông dụng như là bước đầu tiên trong quá trình sắc ký.Đặc điểm: Phân tách các phân tử theo tính kỵ nước của phân tử	 Các nhóm kỵ nước khác nhau đựợc cố đinh trên bề mặt giá thể.	 Dưới điều kiện nồng độ muối cao (thấp) CÁC phần kỵ nước trên phân tử tương tác các nhóm cố định.	 Các phân tử gắn kết được rứa giải bằng cách giảm áp lực ion và vì vậy hòa tan các phân tử ra khỏi giá thể.Ưu điểm: Là bước cho phép cô mẫu, công suất cao, nhanh, mẫu được thu nhận trong nồng độ muối thấp.Nhược điểm: một số protein có thể bị tủa ở nồng độ muối cao, khó nâng cấp quy mô lớn.II.4.8) Sắc ký khíSắc ký khí là phương pháp được dùng để tách các chất ở thể khí bay hơi, với pha động là chất khí, gọi là khí mang (carrier gas). Sắc ký khí còn áp dụng cho các chất khí, lỏng, rắn dễ bay hơi và bền nhiệt độ cao, có TLPT M2000. Các thành phần chính của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)1.Bình chứa dung môi	Thường làm bằng thuỷ tinh, đôi khi làm bằng thép không rỉ, trong phương pháp rửa giải thông thường chỉ cần một bình chứa dung môi, trong phương pháp rửa giải gradient thường dùng 2, 3, 4 bình chứa các dung môi khác nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp của các loại dung môi trên trộn lẫn với nhau theo ti lệ đã được xác định. Cần loại các hạt và các khí hoà tan trong dung môi. 2.Hệ thống bơm	Bơm dùng trong phương pháp phải tạo được áp suất cao (3000 - 6000 psi hay khoảng 250 - 500at), lưu lượng bơm khoảng 0,1 đến 10 ml/ph, phải trơ với các dung môi. Hệ thống bơm này phải có khả năng bơm pha động qua cột ở áp suất cao mà không bị ngắt quãng hoặc tạo nhịp sóng có thể làm sai lệch các lực thu được. Có nhiều kiểu bơm đã dùng trong các máy HPLC; nhưng kiểu phông xoay chiều hiện nay được dùng phổ biến nhất. 3.Hệ bơm mẫu (hệ tiêm mẫu)	Mẫu được bơm vào cột nhờ hệ thống van mẫu. Người ta bơm mẫu vào vòng mẫu với thể tích thường là từ 10 đến 20 μl. 4.Cột sắc ký	Kiểu cột thường phụ thuộc vào phương pháp dùng để tách, nhưng thường là những cột bằng thép không gỉ, dài từ 10 đến 30cm 	5.Detector Là bộ phận phát hiện các chất khi chứng ra khỏi cột và ghi nhận các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ. Hiện đang sử dụng các loại detector sau: Detector tử ngoại (UV): Dùng đèn thuỷ ngân cho vạch 254nm. Nhiều chất hấp thụ ở bước sóng này. Detector tử ngoại và khả kiến (UV-VIS): Dùng phổ quang kế lựa chọn bước sóng từ 195 đến 750 nm. Loại này hiện nay được dùng nhiều nhất. Detector điện hoá và detector huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao dùng trong phân tích vết. Dùng detector điện hoá có thể phát hiện được những lượng picrogam (10-12g) III) KẾT LUẬNSắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trên thế giới. Việt Nam tiếp cận kỹ thuật này vào những năm của thập niên 80. Ngày nay, để kiểm soát kiểm tra tình hình chất lượng hàng hoá để đáp ứng nhu cầu cuộc sống như: thực phẩm, dược phẩm, hoá chất Kiểm tra dư lượng kháng sinh (nitrofuran, tetracycline) trong thuỷ sản, Kiểm tra dư lượng hoocmon (clenbuterol, salbutamol) kích thích tăng trưởng, tạo nạc cho gia súc, Kiểm tra dư lượng màu đã bị cấm có trong thực phẩm và mỹ phẩm như: sudan có trong trứng gia cầm và trong son môi, 3 MCPD (3_monoclo_propan_1,2_diol) có trong nước tương, formone có trong bánh phở, Xác định một số phương pháp chế biến bảo quản nhằm loại trừ sự phát triển của các nấm mốc gây độc (có độc tố aflatoxin) trong các lô hàng nông sản dự trữ và xuất khẩu đặc biệt đậu tương và lạc Trong công nghiệp dược phẩm, sơn: kiểm tra hàm lượng hoạt chất chính trong dược phẩm, dư luợng chất có thể gây độc hại Ngoài ra còn ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như quan trắc, môi trường Vì thế kỹ thuật sắc ký càng có vai trò lớn trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng mà kỹ thuật này hoàn toàn đảm đương được nhưng yêu cầu trên. IV) TÀI LIỆU THAM KHẢO1) Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập chất hữu cơ, NXB ĐHQGTPHCM, 2007, Trang 151-451.2) Trần Nhật Phương, Học phần kỹ thuật Công Nghệ Sinh Học- Proteomic/Sắc ký, 2008, 12trang.3) Nguyễn Tuấn Anh, Đỗ Thị Lan, Nguyễn Thế Hùng, Giáo trình phân tích môi trường, ĐH Nông Lâm Thái Nguyên, trang 49-59.CÁC TRANG WEB  20Chromatography.ppt    ẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ QUAN TÂM THEO DÕI !