Báo cáo Cây sinh dòng virus PRRS

trong điều 
kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ 
được khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase. 
II.3. Nguyên lý chung của phương pháp RT-PCR 
Về nguyên lý, kỹ thuật RT-PCR cũng giống như kỹ thuật PCR thông 
thường nhưng nhằm mục đích khuếch đại đoạn gen từ khuôn RNA thay vì 
DNA. Trong kỹ thuật này có hai giai đoạn khuếch đại được thực hiện: giai 
đoạn đầu là quá trình tổng hợp đoạn cDNA từ khuôn mẫu sợi RNA và giai 
đoạn sau là quá trình tổng hợp DNA từ khuôn mẫu sợi cDNA vừa được 
tổng hợp. 
Khác với kỹ thuật PCR chỉ sử dụng một enzym tổng hợp chuỗi 
oligonucleotide, trong kỹ thuật RT-PCR có sự tham gia của hai loại 
enzym tổng hợp chuỗi oligonucleotide: enzym phiên mã ngược và enzym 
tổng hợp chuỗi oligonucleotide. Do enzym reverse transcriptase chịu nhiệt 
kém nên quá trình phiên mã ngược đẻ tổng hợp cDNA thường phải thực 
hiện ở nhiệt độ thấp (thường khoảng từ 42-45 oC). 
II.4.Nguyên lý chung của phương pháp nested PCR 
8 
Kỹ thuật nPCR được phát triển nhằm mục đích gia tăng độ nhạy và độ 
đặc hiệu của phản ứng PCR. Trong kỹ thuật này, có hai cặp primer khác 
nhau được sử dụng nhưng chỉ để nhằm khuếch đại đặc hiệu một đoạn gen 
và phản ứng PCR phải thực hiện hai lần. Lần đầu, phản ứng PCR được 
thực hiện trong 15-30 chu kỳ, với cặp mồi thứ nhất. Cặp mồi thứ nhất, ở 
lần chạy PCR thứ 1, cho phép khuếch đại đoạn gen dài hơn đoạn gen cần 
xác định và đoạn gen cần xác định nằm trong đoạn gen được khuếch đại 
lần 1. Sản phẩm của PCR lấn 1, sau đó sẽ là mẫu cho PCR lần 2. Cặp mồi 
thứ hai sẽ bắt cặp phía trong (nested) của sản phẩm PCR lần 1. Phản ứng 
PCR lần 2 sau đó sẽ khuếch đại đoạn gen cần xác định. 
9 
Hình 4: Nguyên tắc cơ bản của phản ứng nested PCR 
II.5. Nguyên lý cơ bản của phương pháp RT-nPCR một 
ống 
Sử dụng một film bằng plastic, nó cho phép phiên mã ngược và nested 
PCR trong một ống duy nhất. hỗn hợp phản ứng cho phăn ứng khuếch đại 
PCR lần hai được cách ly trong cái nắp của ống phăn ứng trong suốt chu 
kỳ khuếch đại đầu tiên bằng bộ phận một film bằng plastic và sau đó 
được đưa vào trong phản ứng PCR từ chu kỳ phản ứng đầu tiên băng ly 
tâm không mở nắp phản ứng. Thuận lợi chủ yếu của phương pháp là độ 
nhạy cao, độ chuyên biệt cao, đơn giản, hiệu quả, nguy cơ tạp nhiễm thấp 
và dễ dàng trong việc thiết lập điều kiện nested PCR. Phương pháp này 
thích hợp cho việc phát hiện các mục tiêu. 
III. Phương pháp tiến hành: 
III.1.Ly trích RNA 
-RNA được ly trích từ 250 µl huyết thanh hoặc từ 20-50 mg mô, sử 
dụng kit ‘ Total RNA Prep Plus’. 
Sau khi ly trích, RNA được tách rửa với 100 µl nước không Rnase 
 -Toàn bộ RNA được sử dụng làm khuôn trong phản ứng RT-nPCR 
một ống đặc biệt cho ORF5 của EU-PRRSV 
III.2.Thực hiện phản ứng RT-nPCR của ORF5 
Bước 1: 
5 µl trehalose 22 % được sử dụng để bảo quản và duy trì hỗn hợp bên 
dưới trong dung dịch của các ống Eppendorf 0.2 ml: 20pmol cho mỗi mồi 
trong (inners) 
ORF5F(5'ATGAGATGTTCTCACAAATTGGGGCG3') và 
ORF5R(5'CTAGGCCTCCCATTGCTCAGCCGAAGT3') (Suarez et al., 
1996 ) 
1 µl dNTPs (10 mM) 
 .25 µl Taq Polymerase (1·25 U, Fermentas, Vilnius, Lithuania). 
-Để bảo quản thì các ống được sấy khô khoảng 2h nhiệt độ phòng. 
Bước 2 
-Tiến hành phản ứng RT-PCR trong đáy ống chứa chất được làm khô, 
sử dụng chất phản ứng được xử lý trehalose trong nắp ống Eppendorf. Sự 
khuếch đại được thực hiện trong 50 µl thể tích có chứa: 
5 µl RNA và những chất phản ứng sau: 
10 
5 µl 10x PCR buffer [100 mM Tris–HCl (pH 8·8) 
500 mM KCl], 0·8% Nonidet P40 (Fermentas) 
5 µl MgCl2 (25 mM, Fermentas) 
2 µl dNTPs (10 mM, Sigma) 
 5 pmol cho mỗi mồi outer EUORF5B 
(5' CAATGAGGTGGGCIACAACC 3') và EUORF5C (5' 
TATGTIATGCTAAAGGCTAGCAC 3') (Oleksiewicz et al., 1998 ) 
1 µl 10% Triton X-100 (Sigma) 
0·5 µl (2·5 U) Taq DNA polymerase (Fermentas) 
0·25 µl (10 U) RNasin (Promega) 
 0·5 µl (100 U) MMLV phiên mã ngược 
-Dầu khoáng được tính đến để hoạt động như một vật cản hơi nước 
giữa phản ứng RT-PCR và chất phản ứng được làm khô ở trong nắp ống 
Eppendorf. Sau đó,những ống này bắt buộc phải trải qua chu trình nhiệt 
sau: 
 42 °C trong 30 phút 
 95 °C trong 5 phút 
-Sau đó là 20 chu kỳ ở: 
 94 °C trong 1 phút 
 55 °C trong 1 phút 
 72 °C trong 1.5 phút. 
 -Tiếp sau đó,những ống nghiệm được đảo ngược một vài lần để hòa 
tan những chất phản phản ứng khô trong nắp để bắt đầu phản ứng 
nestedPCR. Những ống nghiệm sau đó được ly tâm trước khi trở lại chu 
trình nhiệt của phản ứng nestedPCR. 
Bước 3: Phản ứng nestedPCR tiến hành trong 35 chu kỳ với chu 
trình nhiệt sau: 
 94 °C trong 1 phút 
 55 °C trong 1 phút 
 72 °C trong 1.5 phút. 
 -Một bước kéo dài ở 72 oC for 10 min hoàn thành quá trình khuếch 
đại.Sản phẩm cuối của sự khuếch đại là 606 bp. 
III.3.Thực hiện phản ứng RT-nPCR của ORF7. 
 -Từ RNA chọn lọc, ORF7 cũng được khuếch đại. 
 5 µl RNA trộn với 8.25 µl nước, 4 µl của 5X MMLV RT buffer, 1 µl 
dNTPs( 10mM mỗi loại), 0.5 µl MMLV, 0.25 µl Rnasin và 1 µl 
hexanucleotide ngẫu nhiên(100ng). 
11 
-Dầu khoáng được thêm vào để hoạt động như một vật cản hơi nước. 
-Để tiến hành phiên mã ngược, hỗn hợp được ủ ở 370 C trong 10 phút. 
 -5 µl cDNA tổng số được khuếch đại bằng phản ứng RT-PCR trong 
thể tích 50 µl : 28.8 µl nước, 10 µl 5x dung dịch đệm phản ứng Taq 
polymerase, 5 µl 25 mM MgCl2, 4 µl dNTPs, 1 U Taq Polymerase 
(Fermentas) và 20 pmol của mỗi primer: 
 5' GCCCCTGCCCAICACG 3' và 
5' TCGCCCTAATTGAATAGGTGA 3' (Oleksiewicz et al., 1998). 
-Chu trình nhiệt được thực hiện trong 35 chu kì với chu trình nhiệt sau: 
 94 oC trong 15 giây 
 52oC trong 30 giây 
 72 oC trong 30 giây 
 -Một bước kéo dài ở 72 oC trong 10 phút hoàn thành quá trình 
khuếch đại. Kích thước mong chờ của ORF7 khuếch đại là 637 bp. 
III.4.Phân tích trình tự nucleotide 
Để giải trình tự,những sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agar 
1.5%. Sau đó nhuộm ethidium bromide và khử muối trong nước siêu 
lọc(ultafiltered water). 
 - Kích thước băng mong muốn được cắt bỏ từ gel, sử dụng dụng cụ 
máy lọc quay tròn 0.45 µm Ultrafree-MC để phục hồi DNA, những sản 
phẩm PCR tinh sạch đươc giải trình tự bằng kit BigDye Terminator Cycle 
Sequencing và một máy giải trình tự ABI310. 
-Trình tự từ hai sợi ORF5 của sản phẩm PCR được xác định với những 
mồi giống như mồi dùng cho phản ứng khuếch đại nestedPCR. 
-Trình tự ORF7 được xác định bằng mồi R133(5' 
TCGCCCTAATTGAATAGGTGACTC 3') và F132 (5' 
GTGCTGGGCGGCAAACGAGCTGGT 3'),(Drew et al.1997 ) 
Những trình tự được tập hợp bằng việc sử dụng SeqMan (Lasergene 
program package DNASTAR Inc). Phản ứng RT-nPCR và chiến lược giải 
trình tự được mô tả ở trên đã cho phép việc xác định một phần trình tự 
ORF5 (432 nucleotid tương ứng từ vị trí 97-528 của ORF5) và toàn bộ 
trình tự ORF7. Tất cả những trình tự được ghi nhận trong nghiên cứu này 
được đưa vào ngân hàng gen. 
. 
12 
 Table 1. Sequence summary 
13 
-CLUSTAL X được dùng để sắp xếp trình tự và tỉ lệ đồng hóa/dị hóa 
được ước lượng với TREE-PUZZLE 5.0(tỉ lệ biểu diễn sự biến đổi qua lại 
giữa các nucleotide trong trình tự). Những tỉ lệ này được sử dụng để đưa 
vào chương trình DNADIST của gói (package) PHYLIP để thành lập 
khoảng cách di truyền, nó là một sự ước lượng cho số lượng nucleotide 
thay thế cho mỗi vị trí, giữa cặp trình tự. Những sự tính toán DNADIST 
được dựa vào mô hình thay thế F48, đồng hóa và dị hoá xuất hiện những 
tỉ lệ khác nhau. Dựa vào khoảng cách chất nền (matrix), cây sinh dòng 
được xây dựng phù hợp với phương pháp Fitch-Margoliash, dùng chương 
trình DNADIST của gói PHYLIP.Độ tin cậy của việc lấy mẫu được thực 
hiện trong 100 bản sao bộ dữ liệu để đánh giá những giới hạn tin cậy của 
mô hình nhánh. 
IV. Kết quả 
IV.1.Cơ sở địa lý cho sự đa dạng của PRRSV ở Châu 
Âu. 
-Tổng số 22 trình tự ORF5 không hoàn chỉnh đại diện cho dòng 
PRRSV gây bệnh đã được xác định: 15 từ Ba Lan, 2 từ Đức, 1 từ Anh và 
4 từ Lithuania. Hơn nữa, hiện nay hai vaccin nhược độc chủng Châu Âu 
có thể được dùng , Porcilis PRRS (Porcilis PRRS > 86-98%,) và Pyrsvac-
183 đã được giải trình tự. Dựa vào 24 trình tự mới ORF5, và những trình 
tự ORF5 chủng Châu Âu được chọn lọc có sẵn trong ngân hàng gen, một 
cây sinh dòng được xây dựng. Cây sinh dòng cho thấy một nhóm kín của 
những trình tự từ Netherland, Anh, Pháp và Belgium gần trình tự ORF5 
Lelystad nguyên thủy. Nó đại diện một dòng của Hà Lan phân lập từ năm 
1991. Tất cả những trình tự trong nhóm kín giống Lelystad (Lelystad-like) 
thì có thể từ năm 1991-1992. Một vài nhóm nhỏ khác trong cây sinh dòng 
có thể được giải thích bởi dịch tể học: 
Ví dụ: PL9 và PL11 từ những nông trại có sự trao đổi những con heo. 
LT2 và LT4 từ hai nông trại gần nhau về mặt địa lý. 
PL2,PL7 và PL15 từ một nông trại nhưng khác biệt về thời gian. 
-Một vài nhóm không có sự giải thích rõ ràng về mặt địa lý cũng 
không về mặt thời gian cũng như về mặt dịch tễ học. 
Ví dụ: nhóm có chứa ES1 (Tây Ban Nha, 1992) và PL12 (Ba Lan, 
2000). 
14 
Fig 5:Phylogenetic tree of EU-type ORF5 sequences. The tree was 
made with the FITCH program of the PHYLIP package. 
-Những trình tự từ Tây Ban Nha, nhưng nhất là Đan Mạch, Cộng Hòa 
Czech và Ý thì khá khác biệt từ nhóm kín giống Lelystad, như đã được 
ghi nhận trước đây. Bởi vì một vài trình tự củaTây Ban Nha, và hơn nữa 
trình tự đơn của Đan Mạch và của Ý đã thu được trong năm 1991-1992, 
điều này đã chỉ ra rằng những nước khác nhau có thể chứa những chủng 
PRRS khá khác nhau tại mọi thời điểm. Tuy nhiên, việc xác định những 
15 
trình tự bắt đầu từ khi dịch bệnh xuất hiện ở các nước Châu Âu thì cần 
thiết để xác định những trình tự này là chung, hoặc duy nhất ở Đan Mạch, 
Ý và Tây Ban Nha.Ở Ba Lan, PRRSV được phát hiện sớm hơn vào năm 
1994, và trình tự đã bắt nguồn từ khi dịch bệnh bùng nổ đầu tiên ở Ba Lan 
và được gọi là Bie94. Bei94 không cùng nhóm với nhóm giống Lelystad 
(Lelystad-like) , và cũng không cùng nhóm với ‘Lek’, một nhóm phân lập 
khác ở Ba Lan từ 1994. Do đó, nó xuất hiện như một quy luật chung, dựa 
vào những trình tự từ Nhật Bản, Ý, Đan Mạch và Ba Lan, nhiều nước 
Châu Âu khác đã có những dòng PRRS khác nhau lúc dịch bệnh bùng nổ, 
mà đa dạng di truyền của PRRS ở Châu Âu có một cơ sở địa lý. 
Điều quan trọng, cơ sở địa lý này không thể được giải 
thích bằng sự tiến hóa của một tổ tiên chung PRRS dòng Châu Âu sau 
dịch bệnh bùng nổ.Những PRRS phân lập rất khác nhau có sự xuất hiện 
độc lập nhưng phần lớn xuất hiện đồng thời ở các nước Châu Âu khác 
nhau. 
(hình 1: so sánh NL1, ES1, ES2, DK1, IT1, tất cả từ năm 1991-1992, 
PL1 và PL2 từ năm 1994). 
IV.2.Trình tự PRRS của Lithuania đa dạng khác 
thường. 
-Dựa vào hình thức phân tích đơn giản nhất, việc xem xét tỉ lệ 
nucleotide giống nhau từ hai trình tự Châu Âu khác biệt nhất trong bộ dữ 
liệu là ‘Nie’ từ Ba Lan-PL9 và ‘Aus’ từ Lithuania-LT1. ‘Nie’ và ‘Aus’ đã 
cho thấy chỉ có 71.5% nucleotide giống nhau giữa chúng. Ngoại trừ trình 
tự Polish và Lithuania từ bộ dữ liệu, những trình tự Châu Âu khác biệt 
nhất là ‘2156’ (IT1’ và ‘Olot/91’ (ES1), chúng có 82.4% nucleotide giống 
nhau . Do đó, những trình tự Polish và Lithuania đã mở ra hiểu biết về 
vùng đa dạng của PRRS chủng Châu Âu. 
-Khi việc phân tích bị giới hạn bởi những trình tự từ năm 2000, hai 
trình tự khác biệt nhất trong bộ dữ liệu là ‘Sid’ từ Lithuanian và ‘Krz’ từ 
Ba Lan (LT2 và LT3). ‘Sid’ và ‘Krz’đã cho thấy chỉ có 72.2% nucleic 
acid giống nhau giữa chúng. Tuy nhiên, những trình tự Lithuania dường 
như khác so với trình tự của kiểu gen Châu Âu khác đã ghi nhận trước đó 
( LT1-LT4) . Xa hơn, sự đa dạng cao giữa những trình tự Lithuanian như 
giữa vài trình tự Châu Âu khác. 
 IV.3.Dấu vết phân tích trình tự tổ tiên chung cho kiểu 
gen Châu Âu và Châu Mỹ. 
-Để thấy được những trình tự khác biệt nhất như thế nào từ Lithuanian 
được đặt trong phả hệ EU-US PRRSV, một cây sinh dòng mới được xây 
dựng. Hơn nữa nó bao gồm một chọn lựa những trình tự ORF5 từ các 
16 
nước châu Âu trong nghiên cứu hiện nay, bao gồm cả Lithuania, dưới 
64% giống nhau ở mức độ nucleotide và dưới 70% ở mức độ amino acid 
so với những trình tự US-ORF5, và vì vậy hiểu rõ về chủng virus đa dạng 
khác thường của Lithuania liên kết về phía trên nhánh trong EU-US. Kiểu 
nhánh này có sự hỗ trợ độ tin cậy cao. Để nghiên cứu xa hơn điều phát 
hiện này, chúng tôi xác định toàn bộ trình tự ORF7 cho PL8, PL9, LT1, 
và LT2. Một cây sinh dòng dựa vào trình tự ORF7 đã chứng minh kiểu 
nhánh tìm thấy cho bảng phả hệ ORF5 mặc dù có sự hổ trợ độ tin cậy 
thấp. Kiểu nhánh giống nhau được quan sát chung cho cả ORF5 và ORF7 
ngoại trừ khả năng duy nhất về vị trí của những mẫu của Lithuania là một 
kết quả tái tổ hợp tổ tiên giữa chủng Châu Âu và Châu Mỹ của PPRSV. 
Nhánh sinh dòng duy nhất của trình tự ORF5 như là trình tự ORF7 được 
chứng minh bằng giá trị độ tin cậy cao, đề nghị rằng những trình tự ở châu 
Âu hiện nay thì giống US-PRRSV hơn EU-PRRSV. 
17 
Fig 6: Phylogenetic trees of EU-type and most diverse of US-type 
PRRSV sequences. The large tree (A) depicts the phylogenetic 
relationship of the ORF5 sequences. The small tree (B) was based on the 
ORF7 sequences. 
V.Thảo luận: 
-Từ khi dịch bệnh bùng nổ trong những năm sau thập niên 80, PPRSV 
vẫn tiếp tục là nguyên nhân chính gây thiệt hại kinh tế ở các nông trại heo. 
18 
Ở Bắc Mỹ, sự bùng nổ dịch bệnh gần đây của PRRSV không điển hình đã 
đề nghị trách nhiệm với sự bùng nổ của các dòng PRRS mới , việc chống 
lại các vaccin hiện nay dường như không cung cấp sự bảo hộ . Về mặt lý 
thuyết, viễn cảnh này không bị giới hạn ở Bắc Mỹ, và kiến thức về đa 
dạng di truyền của EU-PRRSV có thể cải thiện điều kiện đánh giá các 
trường hợp tương tự có khả năng xảy ra ở Châu Âu. Dự đoán bao gồm cả 
các nước Đông Âu trong cộng đồng Châu Âu có sự liên quan một cách 
đặc biệt trong khía cạnh này, vì dữ liệu có giá trị đưa ra giả thiết rằng Nga 
và Cộng Hòa Séc có thể có các chủng PRRSV mà có sự khác biệt so với 
những phát hiện đó ở các nước Châu Âu khác. Cho đến bây giờ hay lúc 
đó, số lượng những trình tự được ghi nhận từ Cộng Hòa Séc có sự liên hệ 
thấp với các trình tự của Nga nên sự hiểu biết của chúng tôi vẫn chưa đưa 
vào cơ sở dữ liệu chung. Vì thế, nghiên cứu hiện nay đã đảm bảo khám 
phá xa hơn về đa dạng trình tự của PRRSV ở Đông Âu bằng việc phân 
tích các trình tự của PRRSV đầu tiên từ Ba Lan và Lithuania. 
Khám phá chính trong nghiên cứu hiện tại là Lithuania có dòng 
PRRSV đa dạng khác thường. Tất cả bốn trình tự trong huyết thanh heo 
của Lithuania được lấy từ sản phẩm RT-PCR. Theo ý kiến của chúng tôi, 
điều này làm nó giống các trình tự của Lithuania được lấy từ toàn bộ 
virion của PRRSV. Chúng tôi lấy những trình tự của virus trực tiếp từ 
trình tự cả hai sợi của sản phẩm PCR không tạo dòng để giảm tối thiểu 
việc tạo Taq nhân tạo. Tuy nhiên, do có sự ngạc nhiên lớn về các trình tự 
của Lithuania, chúng tôi tiến hành thêm các đối chứng để điều tra RT-
PCR và kế hoạch giải trình tự: 
-Đầu tiên, lặp lại RT-PCR và giải trình tự trong các mẫu huyết thanh 
được chọn lọc và xác định trình tự DNA. 
-Bước thứ hai: giải trình tự ORF5 cũng như là ORF7 cho virus ở 
Lithuania, và thu được nhóm sinh dòng xác định. Xa hơn, chúng tôi đánh 
giá sự đa dạng của PRRSV Lithuania giống với sự đa dạng của các dòng 
PRRSV ở Nga, trình tự nucleotid của ORF7 có sự khác biệt tới 16% so 
với virus Lelystad đã được ghi nhận. 
-Những trình tự của Lithuania cho thấy có sự ngạc nhiên lớn và kiểu 
nhánh bất thường trong sinh dòng EU-US. Trong đó, chúng dường như có 
nguồn gốc từ trình tự tổ tiên giống Châu Mỹ (US-like) hơn được thấy 
trước đây ở Châu Âu. Sự giải thích này được chứng minh bằng sự quan 
sát kích thước protein ORF7 của PRRSV ở Lithuania (124 residues) là 
trung gian giữa kích thước của protein ORF7 của chủng Châu Âu đầu tiên 
(128 residues ) và chủng Châu Mỹ (123 residues) (hình 3b). Tuy nhiên, 
các trình tự ORF7 của Lithuanian cung cấp ví dụ đầu tiên về đa hình kích 
thước có thể xảy ra trong protein ORF7 của dòng PRRSV phân lập của 
19 
chủng Châu Âu. Khám phá này có sự liên quan rõ ràng, ví dụ: sử dụng 
kích thước ORF7 sau phản ứng RT-PCR để phân biệt giữa các chủng 
virus. 
-Trong đoạn ORF5 được giải trình tự, chúng tôi phát hiện một vài 
dòng EU-PRRSV có 71.5% nucleotid giống nhau (PL9 và LT1). 
-Những nghiên cứu trong đa dạng di truyền của EU-PRRSV có thể bao 
gồm một số lượng phân lập lớn từ tất cả các nước Châu Âu và ưu tiên giai 
đoạn từ năm 1991 (virus Lelystad phân lập là PRRSV phân lập đầu tiên) 
đến nay. Rõ ràng, điều này không thể thực hiện. Do đó, việc mô tả đúng 
về đa dạng trình tự của EU-PRRSV sẽ có thể phát triển dần dần, do có 
liên tiếp nhiều nghiên cứu bổ sung. Nghiên cứu hiện nay về tính đa dạng 
chủ yếu ở Châu Âu, dòng PRRSV của chủng Châu Âu đã bổ sung vào 
tính đa dạng của EU-PRRSV trong nghiên cứu trước đó (Suarez et al., 
1996 ; Oleksiewicz et al., 2000 ; Indik et al., 2000 ; Forsberg et al., 2001 , 
2002 ). Hướng mô tả dường như cho thấy các dòng PRRS thay đổi khác 
nhau không thể là một đặc trưng riêng biệt ở bất kì một quốc gia nào, 
nhưng là một quy luật chung ở Châu Âu, ngoại trừ các nước như là Hà 
Lan, Belgium, Pháp và Anh nơi hiện diện của nhiều dòng PRRSV có quan 
hệ gần gũi ( Lelystad-like) có thể được giải thích bằng con đường 
thương mại. 
Figure 5 Sequence alignment of Lelystad Virus và 
Porcilis®PRRS 
VI. Kết luận 
Sự đa dạng của PRRSV ở Châu Âu do nhiều nguyên nhân: 
- Sự tiến hóa của một tổ tiên chung PRRS dòng Châu Âu sau dịch 
bệnh bùng nổ. 
-Một vài nhóm có thể được giải thích bằng dịch tể học và về mặt địa 
lý. 
-Có sự đa dạng lớn giữa các trình tự của Lithuania. 
20 
- Những trình tự ở châu Âu hiện nay thì giống US-PRRSV hơn EU-
PRRSV. 
VII. Tài liệu tham khảo 
Công nghệ sinh học trong thú y. Nguyễn Ngọc Hải. 
www.porcilis-prrs.com/pathogensis prrs.asp 
21 
Mục lục: 
I.Đặt vấn đề .......................................................................................... 3 
II. Tổng quan........................................................................................ 3 
II.1.Giới thiệu về virus PRRS.............................................................. 3 
II.1.1. Lịch sử phát hiện virus PRRS................................................... 3 
II.1.2. Kích thước và hình thái học virus PRRS. ................................. 5 
II.1.3. Tổ chức gen virus PRRS 6 
II.2 Nguyên lý chung của phương pháp PCR .................................... 6 
II.3. Nguyên lý chung của phương pháp RT-PCR 8 
II.4.Nguyên lý chung của phương pháp nested PCR .......................... 9 
II.5. Nguyên lý cơ bản của phương pháp RT-nPCR một ống ........... 10 
 III. Phương pháp tiến hành ................................................................. 11 
III.1.Ly trích RNA ............................................................................. 11 
III.2.Thực hiện phản ứng RT-nPCR của ORF5................................. 11 
III.3.Thực hiện phản ứng RT-nPCR của ORF7................................. 12 
III.4.Phân tích trình tự nucleotide ................................................... 13 
IV. Kết quả......................................................................................... 15 
IV.1.Cơ sở địa lý cho sự đa dạng của PRRSV ở Châu Âu................ 15 
IV.2.Trình tự PRRS của Lithuania đa dạng khác thường.................. 17 
 IV.3.Dấu vết phân tích trình tự tổ tiên chung cho kiểu gen Châu Âu và 
Châu Mỹ. 17 ................................................................................................ 
V.Thảo luận: ...................................................................................... 19 
VI. Kết luận........................................................................................ 21 
 VII. Tài liệu tham khảo....................................................................... 22