Chuyên đề Phát hiện sán lá gan bằng kĩ thuật Elisa

Trường ĐH Nông Lâm Tp.HCMBộ môn Công Nghệ sinh họcLớp DH06SHPHÁT HIỆN SÁN LÁ GAN BẰNG KĨ THUẬT ELISA SVTH :Đàng Nguyên Lưu Vi VyMSSV:06126187GVHD:PGS.TS Nguyễn Ngọc HảiChuyên đề MỤC LỤC: I. Sơ lược A.Nguồn gốc B.Lây nhiễm C.Biểu hiện D.Dich tễ học E.Phương pháp chẩn đoán sán lá ganII.Phát hiện kháng nguyên phân (coproantigen) bằng kĩ thuật sandwich ELISA trong thử nghiệm cừu bị nhiễm Sán lá gan A.GIỚI THIỆU B.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1.Mẫu 2.Bài tiêt / phân tiết (ES) kháng nguyên của F. gigantica 3.Monoclonal antibody Kháng thể đơn dòng 4.ELISA gián tiếp 5.Chuẩn bị phân nổi bề mặt 6.Sandwich ELISA 7.KẾT QUẢ 8.Thảo luậnIII.Tài liệu tham khảo I.Sơ lượcA.Nguồn gốcSán lá gan ký sinh ở trâu, bò. Sán lá gan có trong đường ruột của trâu bò, theo chất thải của trâu, bò ra ngoài môi trường. Vì thế, ở đâu có phân trâu bò là ở đó có sán lá gan. Sán có thể bám trên rau cỏ, có thể nó có ở trong nguồn nước mương, nước ao, kênh rạch...Sán lá gan chết ở nhiệt độ 60-70độCVòng đời của F.hepaticaB.Lây nhiễmNhiều bệnh nhân bị nhiễm bệnh do ăn rau sống, hay do uống nước sông, suối, ao hồ...Hiện nay, nhiều người dân vẫn giữ thói quen ăn rau sống, hoặc ăn tái các loại rau thủy sinh như rau muống, rau cần, rau ngổ, rau cải xoong, ngó sen. Do rửa không sạch ấu trùng sán sống bám trên rau, nên nhiều người bị nhiễm sán mà không hề biết. Sán lá gan khi vào người sẽ “du lịch” khắp cơ thể và đích đến cuối cùng là gan. Chúng đi xuyên qua mạch máu, rồi vào ổ bụng. Từ ổ bụng, sán xuyên qua bao gan để vào gan sinh sống.Miền Trung và Tây Nguyên là nơi có tập quán sử dụng phân chuồng trong sản xuất nông nghiệp và phổ biến nghề chăn thả gia súc. Chính vì vậy, khi người dân không hiểu biết về cơ chế lây bệnh sán lá gan thì nguy cơ lây nhiễm bệnh là không thể tránh khỏi.C.Biểu hiệnBiểu hiện lâm sàng thường thấy ở người bị nhiễm sán lá gan lớn là đau bụng, sốt thất thường, vàng da, vàng mắt. Tuy nhiên, biểu hiện của từng người tùy theo mức độ bệnh nặng, nhẹ. Có người sốt nhẹ, cảm giác bị ớn lạnh. Nhưng có người lại sốt cao đến 39 – 40 độ. Có người đau bụng âm ỉ, có người đau quằn quại ở vùng gan và thượng vị. Do vậy, ngoài việc nhầm tưởng là ung thư gan, có người còn nhầm là mình bị đau dạ dày.Việc chẩn đoán sán lá gan lớn khá phức tạp, vì các triệu chứng thường biến đổi và giống với các triệu chứng của các loại bệnh khác. Triệu chứng chủ yếu là đau tức vùng gan, ậm ạch khó tiêu, sốt, ngứa... Việc chẩn đoán phải kết hợp nhiều phương pháp như căn cứ vào các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm máu bằng công thức Elisa, siêu âm, chụp cắt lớp. Đối với sán lá gan lớn, việc xét nghiệm phân thường khó phát hiện ra vì tỷ lệ trứng trong phân rất thấp (khoảng từ 10 – 12%).D.Dịch tễ học.Có vài loại sán lá gan nhỏ hay gây bệnh cho người.- Opisthorsis viverrini- C.sinensis.Sán lá gan lớn Fasciola Gây bệnh chủ yếu ở động vật ăn cỏ như trâu, bò, cừu... và gây bệnh ở người có 2 loài:- Fasciola hepatica, - Fasciola gigantica.Fasciola hepatica trưởng Fasciola GiganticathànhE.Phương pháp chẩn đoán sán lá gan phản ứng vón kết hồng cầu gián tiếp (Indirect Hemaaglutination Assay-IHA)phản ứng cố định bổ thể (Complement Fixation - CF)miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA)phản ứng trong da (IDT)Miễn dịch điện di (Immunoelectroporeis Assay-IEA))xét nghiệm ELISAII.Phát hiện kháng nguyên phân (coproantigen) bằng kĩ thuật sandwich ELISA trong thử nghiệm cừu bị nhiễm Sán lá ganA.GIỚI THIỆU Chẩn đoán bệnh sán gan do Fasciola gigantica, một thuận lợi quan trọng là ký sinh trùng của động vật nội địa thường đạt được bằng cách xác định trứng sán lá trong phân. Tuy nhiên, các trầm tích kỹ thuật để phát hiện trứng không thể phát hiện bệnh trước khi chúng trưởng thành và bắt đầu đẻ trứng lúc khoảng 15-18 tuần. Cách tiếp cận là phát hiện kháng thể trong huyết thanh của động vật nhiễm bệnh. Các kháng thể dựa trên xét nghiệm huyết thanh đã sử dụng thành công để phát hiện F. hepatica gan từ 2-4 tuần sau khi nhiễm trùng (Itagaki et al., 1989).Phương pháp thứ hai là phát hiện kháng nguyên.Sự tuần hoàn kháng nguyên ký sinh trùng có thể được phát hiện sớm nhất là 4-6 tuần sau khi bị nhiễm trùng (Rodriguez-Perez & Hillyer, 1995).Chẩn đoán sán lá bằng phát hiện kháng nguyên phân ở người bằng cách sử dụng ELISA đã được báo cáo (Espino và Finlay (1994). Phát hiện kháng nguyên được xem là phương pháp đáng tin cậy hơn cho việc đánh giá tình trạng nhiễm trùng có thể được sử dụng để giám sát hiệu quả của việc điều trị. B.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1.Mẫu 9 con cừu chưa nhiễm F. gigantica được sử dụng trong thử nghiệm.7 con cừu được gây nhiễm bằng cách cho uống 100 F. gigantica và 2 cừu khác được dùng như là đối chứng âm (không nhiễm) . Phân và mẫu máu được thu thập hàng tuần, một trong những mẫu tại thời điểm kích thích và 25 mẫu hàng tuần sau khi kích thích. Tại tuần 18 bài nhiễm tất cả cừu bằng cách cho uống triclabendazole , huyết thanh và mẫu phân thu thập cho hơn 7 tuần. Huyết thanh đã được thu thập để xác định kháng thể kháng Fasciola và mẫu phân đã được xử lý để phát hiện kháng nguyên và kiểm tra trứng. 2.Bài tiêt / phân tiết (ES) kháng nguyên của F. gigantica Kháng nguyên ES thu được từ người lớn F. gigantica như mô tả của Wijffels và cộng sự (1994) với sửa đổi chút ít.Ngắn gọn,sán lá trưởng thành đã được loại bỏ khỏi ống dẫn mật của gia súc nhiễm tự nhiên tại lò mỗ địa phương và khoảng 50 sán lá đã được đưa vào 100 ml PBS tại 37độC trong 15 phút.ban đầu chảy ngược, chứa máu, mật và các mảnh vỡ, đã được gỡ bỏ bằng cách rửa ký sinh trùng ở tầng giữa huyết quản RPMI có chứa một loại kháng sinh và sau đó những sán lá sống được loại bỏ và ấp ở trung RPMI tươi từ 4-6 giờ ở 37độC (2 sán lá/ml RPMI).Sau khi ủ,những phần có chứa kháng nguyên ES được ly tâm tại 2,500 rpm ở 4độC trong 10 phút, và được lưu trữ ở -20độC.3.Kháng thể đơn dòng Các kháng thể đơn dòng (MAB) và MAB biotinylated được mua từ Viện Walter ELISA Hall, Melbourne, Úc. Kháng thể đơn dòng was raised against Fasciola MAB này đã được nâng lên so với Fasciola bài tiết / phân tiết kháng nguyên. 4.ELISA gián tiếp Phương pháp sử dụng ELISA gián tiếp thì tương tự như mô tả của Wijffels et al (1994) với một số sửa đổi.Ngắn gọn, tấm Polystyrene rất nhỏ (Maxisorp; Nunc) được phủ một lớp 100 μL kháng nguyên ES mỗi giếng (2 µg/ml) và đem ủ qua đêm tại 40độC Các tấm mỏng này được rửa ba lần với PBST và bị chặn với 200 μL 5% sữa không kem trong PBST. Sau khi ủ 1 h ở 37độC , tấm được rửa lại 3 lần với PBST. Sau đó, thêm vào mỗi giếng 100 μL huyết thanh pha loãng (1:100) trong PBST và ủ trong 1 h ở 37độC .Sau khi rửa 4 lần với PBST, 100 μL kháng thể peroxidase tinh khiết kháng thỏ-cừu IgG liên hợp (1:1000) được thêm vào mỗi giếng và các tấm được ủ trong 1 h ở 37độC (1:1000) được thêm vào mỗi giếng và các tấm được ủ trong 1 h ở 37độC.Chất nền được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1 viên Tetramethylbenzidine (TMB) đến 1 ml của Dimethylsulfoxid (DMSO) và trộn với 9 ml dung dịch đệm phosphat citrate và 2 μL H2O2 (1 viên thuốc của TMB cho 1 tấm). Sau khi rửa một lần nữa, 100 μL chất nền được thêm vào mỗi giếng, ủ 10 phút, sau đó ngừng lại với 25μl của H2SO4 .Mật độ quang học (OD) được đo ở 450 nm trong trình đọc ELISA5.Chuẩn bị phân nổi bề mặtPhân nổi bề mặt đã được chuẩn bị sẵn sàng cho việc phát hiện kháng nguyên theo Espino et al (1990) với một số sửa đổi. Một thời gian ngắn, một mẫu phân động vật từ một cá thể đã được lấy và được làm đồng nhất bằng cách sử dụng cối giã cho nhão.Một gam phân trên được cố định trong 2 ml 0,1 PBST%, và pha trộn bằng vortexing, sau đó ly tâm tại tốc độ cao 10phút.Phần nổi trên mặt này được thu thập và lưu trữ tại -20độC cho đến khi dùng.6.Sandwich ELISA ELISA sandwich dùng cho việc phát hiện coproantigen như sau: tấm Polystyrene vi phẫu chuẩn (Maxisorp; Nunc) được phủ một lớp 100 μL không biotinylated monoclonal (2.5 µg/ml) và ủ ở 4độC qua đêm. Các tấm này được rửa sạch (4x, PBST), bị chặn với 5% skim-milked trong PBST trong 1 giờ ở 37độC .Sau khi rửa (4x, PBST), các phân nguyên chất nổi trên mặt được thêm (100 μL / giếng) và ủ trong 1 giờ ở 37độC. Rửa tiếp với(6x, PBST) và 100 μL /giếng của biotinylated kháng thể đơn dòng (0,63 ug / ml) được bổ sung và ủ trong 1 giờ ở 37độC Sau khi ủ, các tấm được rửa lại (6x, PBST) và 100 μL / giếng của extravidin (peroxidase liên hợp) pha loãng 1:1000 đã được bổ sung vào các giếng và ủ trong 45 phút ở 37độC.Tấm được rửa sạch lần cuối cùng (8x, PBST) và 100 μL / giếng dung dịch nền được thêm vào giếng và ủ ở RT trong 10 phút. Phản ứng được ngừng lại bằng cách bổ sung 25μl/ giếng H2SO4 1M.Giá trị hấp thu được đo tại 450 nm trong một trình đọc ELISA. Đối với đối chứng âm, Phân cừu nổi trên bề mặt không bị nhiễm bệnh được sử dụng. Đối với đối chứng dương, 25 μg / ml kháng nguyên ES của F. gigantica được thêm vào tương ứng với các mẫu Phân Fasciola chưa đem ra thí nghiệm.Điểm kết thúc thu được bằng cách cộng với ba lần độ lệch chuẩn (SD) của giá trị gia tăng hấp thu có được từ cừu nhiễm.7.KẾT QUẢ Kết quả của sandwich ELISA phát hiện coproantigens được hiển thị trong hình 1 Các kháng nguyên trong phân đã được phát hiện trong vòng 5 tuần nhiễm bệnh ở 4 trong 7 cừu bị nhiễm bệnh (57%) và trong vòng 9 tuần nhiễm bệnh phát hiện năm cừu (71%) và trong vòng 11 tuần nhiễm trùng, coproantigens được phát hiện ở 7con cừu bị nhiễm (100%). giá trị OD của các coproantigen dương tính trong tuần 5-11 đăng nhiễm giữa 0,21 và 0,59 với một ý nghĩa của 0,30 (SD +0,09). Thú đối chứng có giá trị OD là 0,17 (SD +0,02). giá trị OD trong phương pháp Sandwich ELISA để phát hiện các kháng nguyên trong phân được xem là dương tính khi giá trị OD ≥ 0,23 (0,17 +3 (0,02)). Sau khi diệt giun sán, xử lý và loại bỏ các ký sinh trùng, mức độ coproantigens đã không còn được phát hiện ở trong phân trong vòng 2 tuần sau khi điều trị. có nghĩa là giá trị OD trong 3-7 tuần sau khi điều trị là 0,19 (SD +0,01). kháng thể kháng F. gigantica trong huyết thanh được phát hiện trong vòng 3 tuần ở tất cả các con cừu bị nhiễm bệnh (100%) và khả năng hấp thu các kháng thể tăng lên suốt tuần sau và đã đạt đến đỉnh điểm trong vòng 9-14 tuần sau khi lây nhiễm. Hai tuần sau khi điều trị mức độ hấp thu kháng thể giảm nhưng vẫn còn cao (Hình 2). Giá trị OD thu được bằng phương pháp ELISA gián tiếp là 1,66 (SD +0,69) với phạm vi 0,44-2,69 trong suốt quá trình nhiễm trùng. Hơn nữa, giá trị OD trong 3-7 tuần sau khi điều trị là 1,14 (SD +0,41). trứng F. gigantica đã được phát hiện ở hai trong số 7 con cừu bị nhiễm (29%) trong vòng 15 tuần nhiễm trùng và sáu trong số 7con cừu bị nhiễm (86%) trong vòng 17 tuần nhiễm trùng Một tuần sau khi xử lý trứng không thể được phát hiện trong phân. 8.Thảo luận Hai kháng thể đơn dòng cho kháng nguyên F. gigantica ES đã được sử dụng trong phương pháp chuẩn đoán miễn dịch ở cừu nhiễm sán lá bằng cách phát hiện coproantigen với phương pháp sandwich ELISATuy nhiên, phương pháp này có những hạn chế vì sự hiện diện các kháng thể cho thấy trước đó đã tiếp xúc với ký sinh trùng hơn là sự tồn tại của nhiễm trùng.Phát hiện các nhiễm trùng do xét nghiệm mẫu phân cho sự hiện diện của trứng Fasciola thường rất khó vì chúng không được tìm thấy ở một thời kỳ rõ ràng. Trong một số trường hợp, cũng gặp khó khăn, vì trứng được bài tiết không liên tục (Santiago & Hillyer, 1988; Chauvin et al, 1995.)Sandwich ELISA sử dụng MAB ES 78 đã chứng minh rằng nó là một phương pháp tốt và cụ thể để phát hiện kháng nguyên ES F. hepatica trong huyết thanh và phân từ động vật và người nhiễm sán(Espino et al, 1990.; Castro et al, 1994.; Dumenigo et al., 1996). Trong nghiên cứu này, có 57-71% số cừu bị nhiễm bệnh đã bị phát hiện F. gigantica kháng nguyên trong phân trong vòng 5-9 tuần bị nhiễm và tất cả cừu bị nhiễm bệnh đã phát hiện được kháng nguyên F. gigantica trong phân lúc tuần 11 cho đến khi thời gian điều trị bằng cách sử dụng phương pháp phát hiện coproantigen bởi sandwich ELISA.Sau xử lý diệt giun sán mức độ coproantigens đã không còn phát hiện trong vòng 2 tuần điều trị. Điều này gợi ý rằng phương pháp này sẽ thích hợp cho việc phát hiện sán lá ở cừu ít nhất bốn tuần sớm hơn thời gian xuất hiện trứng trong phân theo báo cáo của Dumenigo et al (2000.). So với ELISA gián tiếp, kháng thể kháng F. gigantica được phát hiện trong vòng 3 tuần lây nhiễm cho thấy độ nhạy cảm hơn để phát hiện sớm nhiễm trùng. Tuy nhiên, sau khi xử lý diệt giun sán mức độ kháng thể kháng F. gigantica vẫn còn cao ít nhất 6 tuần khi nghiên cứu này kết thúc.Khảo nghiệm huyết thanh học đòi hỏi túyp máu và ống kim thu sera do đó làm tăng chi phí, trong khi đó thu phân thì đơn giản và dễ dàng hơn. Nghiên cứu này chứng tỏ rằng sử dụng phương pháp Elisa sandwich phát hiện coproantigens Fasciola là có thể phát hiện nhiễm trùng sớm (5-9 tuần) và quan trọng hơn là đã có thể phát hiện các bệnh nhiễm trùng sán lá. Kết luận: Không như kỹ thuật xét nghiệm trứng cổ điển, ELISA có thể phát hiện nhiễm sán giai đoạn sớm và có thể tin cậy được.III.Tài liệu tham khảo Anderson, N., Luong, T.T., Vo, N.G., Bui, K.L.., Smooker, P.M. & Spithill, T.W. (1999).The sensitivity and specificity of two methods for detecting Fasciola infections in cattle.Veterinary Parasitology 83:15-24. Castro, J.E., Dumenigo, B.E. & Espino, A.M. (1994).Detection de coproantigenos para evaluar infection activa por Fasciola hepatica en ganado bovino.Parasitology al Dia 8: 33-38. Chauvin, L., Bouvet, G. & Boulard, Ch. (1995). Humoral and cellular immune responses to Fasciola hepatica experimental primary and secondary infection in sheep.International Journal of Parasitology25: 1227-1241. Dumenigo, B.E., Espino, A.M. & Finlay, C.M. (1996). Detection of Fasciola hepatica antigen in cattle faeces by monoclonal-based sandwich immunoassay. Research Veterinary Science 60: 278-279.Dumenigo, B.E., Espino, A.M., Finlay, C.M. & Mezo, M. (2000). Kinetics of antibodybased antigen detection in serum and faeces of sheep experimentally infected with Fasciola hepatica. Veterinary of Parasitology89: 153-161. Espino, A.M., Marcet, R. & Finlay, C.M. (1990). Detection of circulating excretorysecretory antigens in human fascioliasis by sandwich enzyme-linked. immunosorbent assay. Journal of Clinical Microbiology 28: 2637-2640. Espino, A.M. & Finlay, C.M. (1994). Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detection of excretory-secretory antigens in humans with fascioliasis. Journal of Clinical Microbiology 32: 190-193Hillyer, G.V., Soler de Galanaes, M., Buchon, P. & Bjorland, J. (1996). Herd evaluation by enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of Fasciola hepatica infection in sheep and cattle from the Altiplano of Bolivia. Veterinary of Parasitolology 61: 211-220.Itagaki, T., Ohta, N., Hosaka, Y., Iso, H., Konishi, M., Chinone, S. & Itagaki, H. (1989).Diagnosis of Fasciola sp Infections in cattle by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Japanees Journal of Veterinary Science 51: 757-764. Rodrignez-Perez, J. & Hillyer, G.V. (1995). Detection of excretory-secretory circulating antigens in sheep infectd with Fasciola hepatica and with Schistosoma mansoni and F. hepatica. Veterinary of Parasitology 56: 57-66. Santiago, N. & Hillyer, G.V. (1988). Antibody profiles by EITB and ELISA of cattle and sheep infected with Fasciola hepatica. Journal of Parasitology74: 810-818. Wijffels, G.L., Salvator, L., Dosen, M., Waddington, J., Wilson, L., Thompson, C.,Campbell, N., Sexton, J., Wicker, J., B owen, F., Friedel, T. & Spithill, T.W. (1994).Vaccination of sheep with purified cysteine proteinases of Fasciola hepatica decreases worm fecundity. Experimental Parasitology 78: 132-148.Xin chân thành cảm ơn thầy