Nghiên cứu định lượng đồng thời Ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd trong viên nang Ukata bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 
42 
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI GINSENOSID 
 RG1, RE, RB1 VÀ RD TRONG VIÊN NANG UKATA 
 BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 
Nguyễn Chu Huy*; Trịnh Nam Trung*; Vũ Bình Dương* 
 Nguyễn Văn Bạch*; Đào Văn Đôn* 
TÓM TẮT 
Phương pháp HPLC định lượng đồng thời ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd trong viên nang cứng 
Ukata đã được xây dựng và thẩm định. Pha động gåm acetonitril - nước, cột phân tích Gemini C18 
(250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 203 nm và tốc độ dòng 1,5 ml/phút. Các ginsenosid được tách 
hoàn toàn trong thời gian 50 phút. Giới hạn định lượng của ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd nằm trong 
khoảng 6,0 - 8,0 µg/ml. Diện tích pic và nồng độ các ginsenosid có mối tương quan tuyến tính với hệ 
số tương quan ≈ 1. Phương pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại tốt với RSD < 2%. Tỷ lệ thu hồi 
ginsenosid từ 93 - 100%. Phương pháp này có thể được sử dụng để định lượng ginsenosid Rg1, Re, 
Rb1 và Rd trong viên nang cứng Ukata và các sản phẩm khác có chứa tam thất. 
* Từ khóa: Ginsenosid; Rg1; Re; Rb1; Rd; HPLC. 
SIMULTANEOUS DETERMINATION OF GINSENOSIDE 
RG1, RE, RB1 AND RD IN UKATA CAPSULES BY HPLC 
SUMMARY 
A HPLC method for the simultaneous determination of ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd in Ukata 
capsules was validated. Using acetonitrile and water as the mobile phase, Gemini C18 (250 x 4.6 
nm, 5 µm) column, UV detection at 203 nm and flow at 1.5 ml/min, the ginsenosides were separated 
satisfactorily within 50 minutes. The quantitation limits of ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd were about 
6.0 to 8.0 µg/ml. The calibration curve of each ginsenoside had a correlation coefficient close to 1. 
The precisions were all less than 2%. The recovery rates of extraction were 93 - 100% for all 
ginsenosides. This method should be used to detemine ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd in Ukata 
capsules and other products containing Panax pseudoginseng. 
* Key words: Ginsenoside, Rg1; Re; Rb1; Rd; HPLC. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Ở Việt Nam, thuốc chống ung thư chủ 
yếu có nguồn gốc hóa dược, phải nhập khẩu 
với giá thành cao, không chủ động được 
nguồn nguyên liệu, phụ thuộc nhiều vào các 
hãng dược phẩm nước ngoài, trong khi đó 
nguồn nguyên liệu tự nhiên sẵn có của Việt 
Nam vẫn chưa được tận dụng. Thực trạng này 
cho thấy, cần phải nghiên cứu sản xuất thuốc 
* Học viện Quân y 
Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn (daovandon@gmail.com) 
Ngày nhận bài: 14/10/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/11/2013 
 Ngày bài báo được đăng: 12/12/2013 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 
43 
điều trị ung thư từ nguồn nguyên liệu trong 
nước, tạo ra được sản phẩm chất lượng tốt, 
giá cả hợp lý, phù hợp điều kiện kinh tế Việt 
Nam. Xuất phát từ vấn đề trên, Học viện 
Quân y đã tiến hành nghiên cứu bào chế 
viên nang cứng Ukata với tác dụng hỗ trợ 
điều trị ung thư. Sản phẩm có thành phần 
tam thất với hoạt chất chính là các ginsenosid 
[1]. Đây là những hoạt chất chính góp phần 
tạo ra tác dụng của sản phẩm. Vì vậy, chỉ 
tiêu định lượng này cần được đánh giá để 
đảm bảo sản phẩm đạt chất lượng tốt, góp 
phần bảo vệ và chăm sóc sức khoẻ cộng đồng. 
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
1. Nguyên vật liệu nghiên cứu. 
* Đối tượng nghiên cứu: 
- Viên nang cứng Ukata (lô 0812, NSX 
08.08.2012, HSD 08.08.2014) được sản xuất 
tại Học viện Quân y, đạt TCCS. 
- Thành phần viên nang cứng Ukata: cao 
khô bèo hoa dâu 60 mg; cao khô nghệ 100 
mg; cao khô tam thất 80 mg, tá dược (talc, 
magnesi stearat) vừa đủ 1 viên. 
- Mẫu trắng: là mẫu tự tạo không chứa 
tam thất. 
* Dung môi, hoá chất: 
- Chất chuẩn: ginsenosid Rg1 (98,5%), Rb1 
(99,0%), Re (99,2%), Rd (99,3%) của Sigma- 
Aldrich. 
- Methanol, acetonitril (Merck) đạt tiêu 
chuẩn HPLC. 
- Các hoá chất, dung môi khác: ethanol, 
methanol, ethyl acetat, cloroform, diethyl ether, 
H2SO4 đặc... đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích. 
* Thiết bị và dụng cụ phân tích: 
Tất cả các thiết bị phân tích đều được chuẩn 
hóa theo ISO/IEC 17025 - 2005, bao gồm: 
- Thiết bị phân tích: hệ thống HPLC 
Alliance Waters 2695D, 4 kênh dung môi, 
bơm mẫu tự động, có buồng gia nhiệt cột, 
detector PDA (203 nm), cột sắc ký Gemini 
C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)... Phần mềm xử 
lý số liệu Empower® 2. 
- Thiết bị dụng cụ khác: cân phân tích 
Sartorius độ chính xác ± 0,1 mg, các dụng 
cụ thủy tinh, bình định mức, pipet có độ 
chính xác phù hợp. 
2. Phƣơng pháp nghiên cứu. 
* Khảo sát quy trình định lượng: 
Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu [2, 
3, 4], chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý mẫu 
như sau: 
Lấy 20 viên nang cứng Ukata, bóc bỏ vỏ 
nang, trộn đều. Xác định khối lượng trung 
bình viên. Cân chính xác 1,0 gam bột viên 
nang, thêm 15 ml MeOH, hòa tan bằng máy 
siêu âm. Ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút. 
Hút lấy dịch trong. Cắn tiếp tục hòa tan như 
thế thêm 2 lần nữa (10 ml x 2 lần). Tập 
trung dịch dịch chiết, bốc hơi chân không 
tới cắn, hòa tan cắn bằng 10 ml MeOH. Lọc 
qua màng lọc 0,45 µm, đem dịch lọc phân 
tích HPLC. 
- Điều kiện sắc ký [2, 3, 4]: cột Gemini 
C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector PDA ghi 
phổ 200 - 400 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút, 
thể tích bơm mẫu 10 µl. Tiến hành khảo sát 
pha động ACN:H2O chạy theo chương trình 
gradient. 
* Thẩm định quy trình định lượng: 
Thẩm định quy trình định lượng theo 
ICH gồm các chỉ tiêu: tính tương thích của 
hệ thống sắc ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, 
khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát 
hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác, 
độ đúng. 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 
44 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 
1. Khảo sát quy trình định lƣợng. 
Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và khảo sát điều kiện sắc ký theo phương pháp nghiên cứu, 
ghi sắc ký đồ và phân tích kết quả. Lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời 
4 ginsenosid như sau: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm). Detector PDA 203nm; tốc độ 
dòng 1,5 ml/phút; thể tích bơm mẫu: 10 µl. Pha động ACN:nước chạy theo chương trình sau: 
0 - > 20 phút: 19 - > 20% ACN; 20 - > 30 phút: 20 - > 32% ACN; 30 - > 40 phút: 32 - > 36% 
ACN; 40 - > 50 phút: 36 - > 38% ACN. 
2. Thẩm định quy trình định lƣợng. 
* Tính tương thích hệ thống sắc ký: 
Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp Rg1, Re, Rb1 và Rd có nồng độ 50 µg/ml, tiến hành phân 
tích sắc ký HPLC 5 lần liên tiếp theo điều kiện đã lựa chọn. 
Bảng 1: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống sắc ký. 
TT 
 (m/s) 
Rg1 Re Rb1 Rd Rg1 Re Rb1 Rd 
1 26,91 27,34 39,01 44,03 121094 148579 89957 95763 
2 27,02 27,11 38,05 43,89 120634 147556 90238 94613 
3 26,93 26,45 39,55 44,93 119234 146867 91078 93971 
4 26,94 27,31 38,46 44,02 121154 149668 91555 94722 
5 27,03 27,33 39,12 44,78 119134 147578 91473 93587 
X 26,97 27,11 38,84 44,33 120250 148050 90860 94531 
RSD 0,22 1,4 1,52 1,11 0,8 0,7 0,8 0,9 
Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu thời gian lưu và diện tích pic của các 
ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd đều nhỏ hơn 2%. Như vậy, hệ thống sắc ký hoàn toàn đáp 
ứng yêu cầu để phân tích ginsenosid trên. 
* Độ chọn lọc - đặc hiệu: 
Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn hỗn hợp ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd trong 
MeOH ở nồng độ 50 µg/ml và mẫu thử. 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 
45 
Hình 1: Sắc ký đồ của 4 ginsenosid trong mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thử (c). 
Sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp ginsenosid và mẫu thử Ukata cho thấy: tại thời điểm 
xuất hiện pic của ginsenosid của mẫu chuẩn, không xuất hiện pic tương ứng trên mẫu 
trắng. Đồng thời, tại thời điểm đó trên sắc ký đồ của mẫu thử xuất hiện đáp ứng pic tách 
hoàn toàn khỏi pic tạp, pic của ginsenosid ở mẫu chuẩn và mẫu thử sắc nét, cân đối. Như 
vậy, phương pháp có tính chọn lọc, đặc hiệu cao. 
* Khoảng nồng độ tuyến tính: 
Chuẩn bị một dãy chuẩn ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd với nồng độ trong khoảng từ 20 - 
500 µg/ml. Tiến hành phân tích HPLC theo điều kiện đã lựa chọn. 
Bảng 2: Kết quả xác định mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của ginsenosid. 
C (µg/ml) 20 50 100 200 500 
Spic (Rg1) (μV.s) 51063 118994 227967 475735 1181541 
Spic (Re) (μV.s) 57892 144456 305441 609638 1495955 
Spic (Rb1) (μV.s) 38869 89671 175917 382500 918084 
Spic (Rd) (μV.s) 41201 91709 196457 386913 961521 
Phương trình hồi quy 
tuyến tính 
y(Rg1) = 2363 x - 126; R² = 0,9999 
y(Re) = 2997x + 1203,1; R² = 0,9999 
y(Rb1) = 1842,1x + 479,92; R² = 0,9994 
y(Rd) = 1922,3x + 1086,9; R² = 0,9999 
(a) 
(b) 
(c) 
Rb1 
Rg1 
Re 
Rd 
Rb1 
Rg1 Re 
Rd 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 
46 
Hình 2: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ginsenosid. 
Có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd 
trong khoảng khảo sát với hệ số tương quan R2 ≈ 1. 
* Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới: 
Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn để ngoại suy giới hạn 
phát hiện và giới hạn định lượng ginsenosid. Từ đó, tiến hành pha thử 4 - 5 nồng độ quanh 
điểm dự kiến, kết quả cho thấy: giới hạn phát hiện của Rg1 (2 µg/ml), Re (2 µg/ml), Rb1 (3 
µg/ml), Rd (3 µg/ml); giới hạn định lượng dưới của 4 ginsenosid Rg1 (6 µg/ml), Re (6 µg/ml), 
Rb1 (8 µg/ml), Rd (8 µg/ml). 
* Độ chính xác: 
Pha các mẫu LQC (40 µg/ml), MQC (120 µg/ml) và HQC (400 µg/ml), mỗi nồng độ pha 
5 mẫu độc lập. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn. 
Bảng 3: Diện tích pic và ginsenosid ở nồng độ LQC, MQC và HQC. 
G i n s e n o s i d 
Rg1 Re Rb1 Rd 
DT 
(µV×s) 
RSD 
(%) 
DT (µV×s) 
RSD 
(%) 
DT 
(µV×s) 
RSD 
(%) 
DT 
(µV×s) 
RSD 
(%) 
HQC (400 
µg/ml) 
950833 
0,3 
1214364 
0,5 
734467 
0,2 
770817 
0,3 
949253 1225814 734067 768187 
948694 1225750 732739 767627 
947301 1217309 736812 772956 
953879 1213870 733982 770945 
MQC (120 
µg/ml) 
285441 
0,7 
356824 
0,7 
223100 
0,9 
232148 
0,4 
282874 355099 226715 229407 
284072 356059 221572 230729 
282104 350338 222634 230637 
279924 354366 223487 231432 
b 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 
47 
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) 
LQC (40 µg/ml) 
92138 
1,8 
115736 
1,4 
77738 
1,6 
82402 
1,3 
91954 117294 76468 79468 
89316 117446 78068 80714 
93781 118945 78093 80563 
93089 120034 75245 81249 
Với nồng độ mẫu kiểm soát LQC, MQC, HQC khi tiến hành phân tích trong ngày cho 
kết quả có độ lặp lại cao với RSD < 2%. Như vậy, quy trình phân tích có độ lặp lại cao. 
* Độ đúng: 
Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn (0,4 mg; 1,2 mg; 4 mg). Tiến hành 
xử lý mẫu và phân tích HPLC theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn. 
Bảng 4: Tỷ lệ thu hồi ginsenosid trong viên nang Ukata. 
L ù O n g c h Ê t 
c h u È n t h £ m 
v à o 
L ¦ î n g t ×m t h Ê y (mg) T û l Ö t h u h å i (%) 
Rg1 Re Rb1 Rd Rg1 Re Rb1 Rd 
0,4 mg 
0,401 0,393 0,387 0,388 100,0 98,3 96,8 97,0 
0,388 0,384 0,375 0,377 97,0 96,0 93,8 94,3 
0,397 0,38 0,376 0,373 99,3 95,0 94,0 93,3 
RSD (%) 1,6 1,7 1,8 2,0 1,6 1,8 1,8 2,0 
1,2 mg 
1,191 1,186 1,161 1,161 99,3 98,8 96,8 96,8 
1,161 1,155 1,155 1,171 96,8 96,3 96,3 97,6 
1,177 1,165 1,161 1,177 98,1 97,1 96,8 98,1 
RSD (%) 1,3 1,4 0,3 0,7 1,3 1,3 0,3 0,7 
4 mg 
3,969 3,932 3,955 3,943 99,2 98,3 98,9 98,6 
3,916 3,961 3,978 3,969 97,9 99,0 99,5 99,2 
3,929 3,981 3,920 3,982 98,2 99,5 98,0 99,6 
 RSD (%) 0,7 0,6 0,7 0,5 0,7 0,6 0,7 0,5 
Tỷ lệ thu hồi của ginsensosid Rg1, Re, Rb1 và Rd đạt 93% - 100%. Điều đó cho thấy phương 
pháp chiết đã lựa chọn cho phép chiết gần như hoàn toàn ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd. 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 
48 
3. Định lƣợng ginsenosid trong viên 
nang Ukata. 
Ukata ở lô 0812, NSX 08.08.2012 được 
định lượng ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd 
theo quy trình đã xây dựng và thẩm định ở 
trên. Phân tích 5 mẫu: 
Bảng 5: Hàm lượng ginsenosid trong 
viên nang cứng Ukata. 
H µ m l ¦ î n g 
g i n s e n o s i d 
(mg/viên) 
Rg1 Re Rb1 Rd 
X ± SD (n=5) 
5,914 
± 
0,084 
0,681 
± 
0,012 
5,157 
± 
0,097 
1,318 
± 
0,022 
Hàm lượng hoạt chất trong viên nang 
Ukata như sau: Rg1 = 5,914 ± 0,084 mg/viên; 
Re = 0,681 ± 0,012 mg/viên; Rb1 = 5,157 ± 
0,097 mg/viên; Rd = 1,318 ± 0,022 mg/viên. 
Kết quả định lượng này là cơ sở để đề xuất 
tiêu chuẩn hàm lượng hoạt chất của viên 
nang Ukata trong tiêu chuẩn cơ sở. 
KẾT LUẬN 
Phương pháp HPLC định lượng đồng 
thời ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd trong viên 
nang Ukata được xây dựng và thẩm định. 
Hoạt chất ginsenosid trong mẫu được chiết 
siêu âm bằng dung môi MeOH. Điều kiện 
HPLC: pha động sử dụng acetonitril - nước, 
cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, 
5 mm), detector UV tại 203 nm và tốc độ 
dòng 1,5 ml/phút. Quy trình này được thẩm 
định đầy đủ theo hướng dẫn của FDA. Hàm 
lượng ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd lần lượt 
là 5,9 mg/viên; 0,68 mg/viên; 5,2 mg/viên và 
1,3 mg/viên. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Viện Dược liệu. Cây thuốc và động vật làm 
thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 2002. 
2. Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long, Đào 
Văn Đôn, Hoàng Văn Lương, Trịnh Văn Lẩu. 
Nghiên cứu định lượng một số ginsenosid chính 
trong sinh khối sâm Ngọc Linh bằng phương 
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tạp chí Dược 
học. 2008, số 390, tr.41-43. 
3. Aik-Jiang Lau , Soo-On Woo , Hwee-Ling 
Koh. Analysis of saponins in raw and steamed 
Panax notoginseng using high-performance liquid 
chromatography with diode array detection. Journal 
of Chromatography A. 2003, pp 77-87. 
4. Lie Li, Jin-lan Zhang, Yu-xin Sheng, De-an 
Guo, Qiao Wang, Hong-zhu Guo. Simultaneous 
quantification of six major active saponins of 
Panax notoginseng by high - performance liquid 
chromatography - UV method. Journal of Pharmaceutical 
and Biomedical Analysis. 2005, 38, pp.45-51. 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 
49