Tiêu chuẩn ngành: Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng monensin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TIÊU CHUẨN NGÀNH
10TCN 835 : 2006
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Animal feeding stuffs - Determination of monensin content by 
high - performance liquid chromatographic method
(Ban hành kèm theo Quyết định số 4099/QĐ/BNN-KHCN ngày tháng 12 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn)
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này áp dụng để phân tích hàm lượng kháng sinh monensin trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 40mg/kg. 
2. Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi:
TCVN 4851 (ISO 3696). Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.
ISO 6497:2002 (E). Animal feeding stuffs - Sampling. 
3. Nguyên tắc
Monensin trong mẫu thức ăn chăn nuôi được tách chiết bằng metanol, sau đó tạo dẫn xuất bằng 2,4 dinitrophenylhydrazine (DNP) trong môi trường axit ở 55oC, tách và định lượng trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV ở bước sóng 392nm. 
4. Thiết bị, dụng cụ
4.1. Máy nghiền mẫu phòng thí nghiệm.
4.2. Sàng phòng thí nghiệm, có kích thước lỗ sàng 1,00 mm và 3,00 mm.
4.3. Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.
4.4. Cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01 g.
4.5. Máy ly tâm lạnh có tốc độ 3000 vòng/phút, sử dụng ống ly tâm dung tích 30 ml.
4.6. ống ly tâm, dung tích 30 ml bằng polypropylen hoặc bằng thuỷ tinh, có nắp đậy.
4.7. Tủ ấm, có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định ở 55oC ± 1oC.
4.8. Máy lắc tròn hoặc máy lắc ngang có thể đạt tốc độ 250 vòng/phút.
4.9. ống nghiệm dung tích 10ml có nút xoáy.
4.10. Bình định mức dung tích 10, 100, 1000 ml.
4.11. Pipet tự động điều chỉnh được từ 1ml đến 30 ml.
4.12. Micropipet dung tích từ 10ml đến 100 ml và từ 200ml đến 1000 ml.
4.13. Hút dung môi tự động 2 ml, 10 ml, 20 ml.
4.14. Máy lắc ống nghiệm (Vortex mixer).
4.15. ống đong 1000ml.
4.16. Bể siêu âm.
4.17. Bơm hút chân không.
4.18. Màng lọc syranh có kích thước 0,45 mm.
4.19. Bình nón dung tích 125ml.
4.20. Lọ nhỏ đựng dịch mẫu chuyên dụng cho HPLC, có nắp vặn PTFE .
4.21. Thiết bị trộn mẫu phòng thí nghiệm loại Hobart Model C 100 T hoặc tương đương.
4.22. Thiết bị chia mẫu:
Thiết bị chia đôi hoặc chia tư mẫu: ví dụ như thiết bị chia tư hình nón, thiết bị chia nhiều ngăn có hệ thống phân hạt hoặc các thiết bị chia khác đảm bảo phân chia mẫu thí nghiệm thành mẫu thử đồng nhất.
4.23. Hộp đựng mẫu có nắp kín.
4.24. Hệ thống HPLC gồm có:
4.24.1. Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao, bình chứa dung môi, hệ thống bơm mẫu, detector UV đặt được ở bước sóng 392nm, máy ghi hoặc bộ tích phân.
4.24.2. Cột phân tích HPLC pha đảo có kèm cột bảo vệ
	Chiều dài 150mm
	Đường kính trong 4,6mm
	Hạt nhồi C 18; 5mm hoặc tương đương
5. Hóa chất và thuốc thử
5.1. Hoá chất
Chỉ sử dụng hoá chất được công nhận đạt chất lượng tinh khiết phân tích và nước cất cấp hạng 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696). Các dung môi phải đạt chất lượng để dùng cho phân tích HPLC.
5.1.1. Metanol.
5.1.2. Axit acetic (100%).
5.1.3. Acetonitrile 
5.1.4. Chất chuẩn monensin, dạng muối natri monensin, loại tinh khiết, có kèm theo giấy chứng nhận hàm lượng. 
5.2. Thuốc thử
5.2.1. Tricloacetic axit (TCA), dung dịch 500mg/ml.
Cân 50g TCA chính xác đến 0,01g cho vào bình định mức 100ml, hòa tan và định mức bằng nước cất. Lắc kỹ dung dịch.
5.2.2. Thuốc thử DNP, dung dịch 1mg/ml trong metanol.
Cân 100mg DNP chính xác đến 1mg vào bình định mức 100ml, hòa tan và định mức đến vạch bằng metanol. Lắc kỹ dung dịch.
5.2.3. Pha động cho HPLC.
Hỗn hợp metanol: dung dịch axit acetic 1,5% tỉ lệ 90:10 theo thể tích (v/v).
5.2.3.1. Dung dịch axit acetic 1,5% trong nước, theo tỉ lệ thể tích (v/v).
Cho 15ml axit acetic (5.1.2) vào bình định mức 1000ml. Thêm nước cất đến vạch định mức. Lắc đều dung dịch.
5.2.3.2. Hỗn hợp pha động.
Cho 900ml metanol vào ống đong dung tích 1000ml. Thêm tiếp 100ml dung dịch axit acetic 1,5% (5.2.3.1). Sau đó lọc hỗn hợp dung môi thu được qua phễu hút chân không với màng lọc có kích thước lỗ 0,45 mm, siêu âm đuổi khí ở nhiệt độ thường trong 30 phút.
5.2.4. Dung dịch chuẩn
5.2.4.1. Dung dịch chuẩn gốc 1000mg/ml
Tùy theo hàm lượng monensin ghi trong giấy chứng nhận (5.1.4), cân một lượng nhất định chất chuẩn natri monensin chính xác đến 0,1mg cho vào bình định mức dung tích 100ml, pha loãng và định mức bằng metanol để sao cho thu được dung dịch gốc có nồng độ 1000mg/ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản trong lọ nâu ở 40C, có thể sử dụng được trong vòng 2 tuần.
5.2.4.2. Dung dịch chuẩn làm việc 100mg/ml.
Hút chính xác 10ml dung dịch chuẩn gốc(5.2.4.1) vào bình định mức 100ml, pha loãng và định mức đến vạch bằng metanol. Lắc đều.
6. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
6.1. Lấy mẫu
Phương pháp lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo ISO 6497:2002. Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thí nghiệm phải là mẫu trung thực và có tính đại diện, không bị hư hại hoặc bị biến đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Khối lượng mẫu phân tích phải không được ít hơn 500 gam.
6.2. Chuẩn bị mẫu
6.2.1. Mẫu ở dạng bột mịn
Nếu mẫu thí nghiệm ở dạng bột lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm thì trộn thật đều mẫu (500 gam) bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút. Sau đó chia hỗn hợp bằng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam. 
6.2.2. Mẫu có kích thước hạt vừa
6.2.2.1. Nếu mẫu thí nghiệm không lọt hết qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm nhưng lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ 3,00 mm thì trộn thật đều mẫu (không ít hơn 500 gam) bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút.
6.2.2.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫu đã trộn đều (6.2.2.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam. Nghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy nghiền (4.1) cho dến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm.
6.2.3. Mẫu có kích thước hạt to.
6.2.3.1. Nếu mẫu không lọt qua sàng có kích thước lỗ sàng 3,00 mm thì cần nghiền mẫu (không ít hơn 500 gam) trên máy nghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 3,00 mm, sau đó trộn thật đều mẫu bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút.
6.2.3.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫu đã trộn đều (6.2.3.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam. Nghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy nghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm.
Các mẫu thử được bảo quản trong các lọ đựng mẫu (4.20) ở điều kiện nhiệt độ 2 – 250C, nơi khô ráo.
Chú ý: Nên nghiền, trộn mẫu trong các phòng có thông gió, nên đeo kính, khẩu trang và găng tay bảo vệ.
7. Cách tiến hành
7.1. Đường chuẩn
Hút chính xác lần lượt 10, 20, 50, 100, 200 và 400ml từ dung dịch chuẩn làm việc (100mg/ml) cho vào ống nghiệm (4.9), pha loãng đến 700ml bằng metanol và tạo dẫn xuất như các bước tiến hành ở mục 7.2. Các dung dịch trên sẽ có nồng độ từ 1mg/ml đến 40mg/ml tương ứng trên đồ thị chuẩn. 
7.2. Chiết mẫu và tạo dẫn xuất
Cân chính xác đến 0,1mg từ 5,0g-10,0g mẫu thử đã được nghiền mịn theo mục 6 (tuỳ theo hàm lượng kháng sinh có trong mẫu) cho vào bình nón 125ml, thêm tiếp 50ml metanol. Tiến hành chiết monensin bằng cách lắc trên máy lắc ngang (4.8) trong thời gian 1 giờ với tốc độ 250vòng /phút. Lấy 10ml phần dịch trong ở phía trên cho vào ống ly tâm (4.6) và ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Hút 700ml dịch ở phía trên ống ly tâm cho vào ống nghiệm (4.9). Thêm tiếp 100ml dung dịch TCA (500mg/ml). Lắc ống nghiệm trong 20 giây trên máy lắc (4.8), sau đó để ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Thêm tiếp 200ml thuốc thử DNP (1mg/ml) vào ống nghiệm, và lắc 20 giây trên máy lắc (4.8). Đặt ống nghiệm vào tủ ấm có nhiệt độ ổn định 55oC (4.7) trong 20 phút. Làm nguội ống nghiệm và dùng 10ml dung dịch này để bơm vào hệ thống HPLC.
7.3. Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu thức ăn chăn nuôi được xác định là không có monensin. Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự như mẫu thử theo mục 7.2.
7.4. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 
Việc xác định độ thu hồi được chuẩn bị bằng cách cho một lượng dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp được pha từ dung dịch gốc vào 5g mẫu trắng (7.3) để đảm bảo mẫu có hàm lượng monensin nằm trong dãy đồ thị chuẩn, mẫu được để yên trong 30 phút trước khi tiến hành chiết xuất. Sau đó tiếp tục quá trình chiết mẫu và tạo dẫn xuất tương tự như đối với mẫu thử theo mục 7.2.
7.5. Phân tích trên HPLC
7.5.1. Điều kiện sắc ký: 
	Nhiệt độ cột	30oC
	Detector	detector UV bước sóng 392 nm
Tốc độ dòng	 	1 ml/phút
	Thể tích bơm mẫu 	10 ml
7.5.2. Tiến hành
7.5.2.1. Nên sử dụng bảo vệ cột, việc sử dụng bảo vệ cột không có bất cứ ảnh hưởng nào đến kết quả phân tích. 
7.5.2.2. Cân bằng hệ thống sắc ký bằng pha động (5.2.3) 30 phút trước khi bơm mẫu.
7.5.2.3. Quy trình bơm mẫu theo thứ tự như sau: dịch mẫu trắng, các dung dịch chuẩn, dịch mẫu thu hồi, dịch mẫu thử, các dung dịch chuẩn.
Chú ý: Cần bơm các dịch chuẩn trước và sau mỗi đợt phân tích, không nên để quá 20 lần bơm mẫu cho mỗi đợt phân tích. Nếu quá 20 lần thì phải bơm các dung dịch chuẩn thêm lần nữa vào khoảng giữa đợt bơm mẫu.
7.5.2.4. Xác định diện tích pic đối với các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử tương ứng
7.5.2.5. Sau khi chạy máy phải làm sạch hệ thống HPLC bằng hỗn hợp gồm nước cất : acetonitrile theo tỷ lệ thể tích 40:60 trong 30 phút đến 1 giờ để loại hết đệm trong hệ thống trước khi tắt máy.
8. Tính toán kết quả
8.1. Đường chuẩn
8.1.1. Phải đảm bảo rằng các diện tích pic của mẫu thử đều nằm trong phạm vi của đường chuẩn. Nếu mẫu thử nào có diện tích pic vượt quá chiều cao của đường chuẩn ở nồng độ cao nhất thì sẽ bị loại và phải tiến hành thử lại với sự pha loãng.
8.1.2. Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn với nồng độ của monensin theo quan hệ tuyến tính bậc1:
y= ax + b
Trong đó: 	y là diện tích pic
	x là nồng độ của kháng sinh
	a là hệ số góc
	b là hằng số
8.2. Tính toán
8.2.1. Hàm lượng monensin có trong mẫu thử được tính toán dựa vào đường chuẩn hồi qui tuyến tính (8.1.2) theo công thức sau:
Trong đó: 	X là hàm lượng monensin có trong mẫu thử, tính bằng mg/kg
Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết mẫu thử và diện tích pic của mẫu trắng
	a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b
	V là thể tích dịch chiết mẫu (7.2), tính bằng ml
	m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam
8.2.2. Kết quả cuối cùng là giá trung bình của hai lần phân tích nhắc lại. Trong quá trình tính toán luôn phải lấy hai số sau dấu phẩy. Giá trị trung bình được làm tròn đến một chữ số thập phân.
8.2.3. Xác định độ thu hồi (R) tính theo phần trăm theo công thức sau:
Trong đó: 
C1 là hàm lượng monensin xác định được theo quy trình phân tích (tính bằng mg/kg)
C là hàm lượng monensin được nạp thêm vào mẫu (tính bằng mg/kg).
Độ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu ít nhất phải đạt 80%.
9. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo kết quả phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:
- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu thử.
- Viện dẫn của tiêu chuẩn này hoặc phương pháp thử.
- Kết quả và đơn vị biểu thị kết quả.
- Ngày tháng lấy mẫu và kiểu loại lấy mẫu (nếu có).
- Ngày tháng thử nghiệm.
- Các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm.
- Mọi thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tuỳ chọn, cùng với các chi tiết của sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.