Tiểu luận Các kỹ thuật PCR và ứng dụng

olymerase. Enzyme reverse transcriptase cần cho quá trình tổng hợp sợi cDNA 
từ RNA và enzyme cần cho sự tổng hợp sợi DNA từ cDNA. Do enzyme reverse 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 10 
transcriptase chịu nhiệt kém nên quá trình phiên mã ngược để tạo ra cDNA phải 
được thực hiện ở nhiệt độ thấp (thường khoảng từ 42-450C). Điều này gây ra 
những trở ngại: 
 - Sự tạo thành các sản phẩm khuếch không mong muốn do sự bắt cặp không 
đặc hiệu của các primers. 
 - Giảm hiệu quả kéo dài chuỗi gen do sự hình thành RNA cấu trúc bậc hai. 
Tuy nhiên những trở ngại này có thể được giải quyết nhờ vào việc sử 
dụng enzyme DNA polymerase chịu nhiệt được chiết từ vi khuẩn Thermus 
thermophilus. Enzyme này trong những điều kiện nhất định, có đặc tính sinh học 
đặc biệt là có thể thực hiện cùng lúc 2 chức năng: chức năng của reverse 
transcriptase và chức năng của DNA polymerase. 
 3. Ứng dụng 
Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng ở gia súc: Sử dụng kỹ thuật sinh học 
phân tử RT- PCR 
Lở mồm long móng là một bệnh virus cấp tính lây lan rất nhanh ở động 
vật. Loại dịch bệnh này tại nước ta vẫn chưa tìm ra được phương pháp chẩn 
đoán, điều trị thích hợp. Mới đây, Viện Thú y quốc gia (Bộ NN&PTNT) kết hợp 
cùng Viện Công nghệ sinh học (Trung tâm Khoa học tự nhiên & công nghệ quốc 
gia) đã nghiên cứu thành công phương pháp chẩn đoán bệnh mới bằng kỹ thuật 
sinh học phân tử giúp người chăn nuôi sớm phát hiện và phòng trừ bệnh kịp thời 
cho vật nuôi. 
 Nguyên liệu và phương pháp tiến hành RT- PCR 
TS. Tô Long Thành- Phó Bộ môn Hoá sinh miễn dịch bệnh lý (Viện Thú 
y) cho biết: “Phương pháp chẩn đoán bệnh lở mồm long móng phổ biến hiện nay 
ở nước ta vẫn là nhìn bằng mắt thường hay dùng kít ELISA nhập ngoại. Các 
phương pháp này vừa không chính xác, chi phí lại cao, dùng kỹ thuật RT- PCR 
sẽ có nhiều ưu điểm hơn”. 
Nguyên liệu tạo được RT- PCR gồm: mẫu ARN chiết tách từ bệnh phẩm 
nghi lở mồm long móng của Việt Nam. Mẫu bệnh phẩm ở bò nghi mắc bệnh thu 
thập từ quốc tế gồm 3 mẫu. Các loại hoá chất, vật liệu cần thiết để tiến hành 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 11 
phản ứng, tách dòng và một số cặp mồi. Phương pháp tạo RT- PCR gồm 5 bước 
khác nhau: 
- Tách chiết ARN từ bệnh phẩm biểu mô 
- Tạo ADN bằng phản ứng sao chép ngược 
- Gây phản ứng bằng PCR với các cặp mồi 
- Kiểm tra sản phẩm 
- Tách dòng và giải trình trình tự sản phẩm. 
 RT- PCR cho độ chính xác cao 
Hiện chúng ta đang có 3 phương pháp chẩn đoán định type gây bệnh lở 
mồm long móng thường được áp dụng là phương pháp kết hợp bổ thể, phương 
pháp ELISA và RT- PCR. Hai phương pháp đầu mới chỉ dừng lại ở việc trả lời 
câu hỏi type gây bệnh thuộc loại gì. Phương pháp RT- PCR không dừng lại ở đó, 
chúng còn có thể phân biệt được sự khác biệt biến chủng có trong bệnh phẩm đã 
xác định có cùng một type huyết thanh, thông qua việc định chuỗi các sản phẩm 
PCR và so sánh trình tự đoạn ADN với các trình tự ADN khác của virus lở mồm 
long móng được chứa sẵn trong ngân hàng dữ liệu gen. 
Với những ưu điểm mà RT- PCR mang lại, đến nay Viện Thú y đã tiến 
hành làm chẩn đoán thử nghiệm tại một số địa phương trên một số con vật như 
trâu, bò, lợn, dê, cừu... Thông thường thời gian chẩn đoán bệnh phải mất trên 10 
giờ đồng hồ đối với kỹ thuật soi bằng mắt, 5- 6 giờ đối với kỹ thuật ELISA (kỹ 
thuật này độ nhạy còn kém và chi phí khá cao). Áp dụng kỹ thuật RT- PCR vào 
chẩn đoán thời gian đã được rút ngắn xuống còn 4- 5 giờ với độ chính xác cao, 
an toàn. TS Tô Long Thành cho biết: "Bình thường để biết con vật có mắc bệnh 
hay không, chúng ta phải đợi đến khi chúng phát bệnh ra ngoài với các hiện 
tượng chảy nước bọt ở mồm, mũi hay nứt toác móng chân. Kỹ thuật RT- PCR 
cho phép phát hiện bệnh ngay trong giai đoạn đầu tiên". 
Sở dĩ RT- PCR nhận biết được bệnh nhanh như vậy vì nhờ việc kết hợp 
PCR với cặp mồi 1F/1R khả năng xác định các type O, A, C và ASIA- 1 gây 
bệnh của virus lở mồm long móng diễn ra rất nhanh. Theo TS. Tô Long Thành, 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 12 
khi tiến hành dùng RT- PCR nhất thiết phải làm trên 14 mẫu ARN vào cùng một 
thời điểm. Từ đây, chúng ta tiến hành theo dõi các thay đổi của bệnh lý trên phác 
đồ điều trị. Trong thời gian này chỉ cần một trong số các mẫu có sự thay đổi lên, 
xuống bất thường là chúng ta đã có thể xác định được nguồn bệnh. 
Dùng phương pháp này nhất thiết phải có các cặp mồi vì tính đặc hiệu của 
chúng. Ngoài cặp mồi 1F/1R đã được áp dụng, những cặp mồi khác như 
P33/P38 (type O), P33/P87 (type A), P33/P40 (type C), P33/P74 (type ASIA- 1) 
cũng đóng vai trò rất quan trọng vì mỗi loại có một loại phản ứng đa dạng khác 
nhau. 
Ngoài ra còn có các ứng dụng như: 
 - Chẩn đoán các loai virus ARN như virus dịch tả heo (Hog Cholera – 
Classical Swine Fever), virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PSSR) 
- Sử dụng kỹ thuật RT-PCR bán định lượng (Semi quantitative Reverse 
Transcript – Polymerase Chain Reaction) để đánh giá mức độ sao chép HIP ở 
mô ung thư biểu mô tuyến giáp so sánh với mô giáp lành tính. 
Phan Thị Minh Phương, Đại học Y Dược Huế, 
Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn, Trần Thị Chính, Đại học Y Hà Nội 
 - Phát hiện virus cúm H5N1 bằng RT-PCR (Theo WHO – 2007) 
C. Phương pháp Real time PCR 
 1. Định nghĩa 
Kỹ thuật Real time PCR là một phương pháp khuếch đại gene và đọc kết 
quả được thực hiện đồng thời trong cùng một ống hay một giếng mẫu. Phương 
pháp này đòi hỏi phải có một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo cường độ 
phát huỳnh quang từ giếng mẫu và được trang bị chương trình vi tính cho phép 
xử lý kết quả, xác định sự biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứng 
khuếch đại. 
 2. Nguyên tắc 
Thực chất hệ thống Real time PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy 
quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 13 
→ Real-Time PCR cho biết kết quả lượng DNA hình thành ở từng thời điểm 
trong suốt tiến trình phản ứng 
Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản 
ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo 
thành. 
3. Ưu điểm của Real-time PCR 
- Nhanh 
- Cho phép theo dõi tiến trình phản ứng và biết được lượng DNA đã tạo thành ở 
từng thời điểm. 
- Không cần điện di >>> tiến hành được nhiều mẫu (gần 200 mẫu/ngày). 
- Hạn chế tạp nhiễm. 
- Độ nhạy cao (3pg DNA). 
- Lượng mẫu biến động (10-1010 copies). 
- Độ lặp lại cao (CV < 2,0%). 
Máy luân nhiệt 
Quang phổ huỳnh 
quang 
Huỳnh 
quang 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 14 
4. Vấn đề đối với Real-time PCR 
- Không phân biệt được tác nhân gây bệnh còn sống hay chết 
- Đòi hỏi kỹ năng 
- Thiết bị 
5. Ứng dụng 
Kỹ thuật Real time PCR chẩn đóan sớm HIV trên trẻ em 
Eric Nerrienet 
HIV/Hepatitis Laboratory 
IP Cambodia, Phnom Penh 
Nếu không có sự tầm sóat sớm nhiễm HIV ở trẻ, BS Nhi Khoa phải chờ 
đợi đến tháng thứ 15 để có thể biết tình trạng huyết thanh học thực sự của trẻ 
sinh ra từ bà mẹ HIV(+) 
Nếu trẻ không được phát hiện sớm và điều trị thuốc kháng virus, trẻ có nguy cơ 
tử vong là 50% trong 02 năm đầu tiên của cuộc sống 
Kỹ thuật kinh điển trong chẩn đóan nhiễm HIV ở trẻ 
- RT PCR/b-DNA: Giá thành đắt 
- Nested-DNA PCR (gen: Gag, Pol và/hoặc Env): Đắt, kỹ thuật phức tạp 
- Nuôi cấy và phân lập virus: Đắt, kỹ thuật phức tạp, mất nhiều thời gian,Cần 
labo an tòan mức độ 3 
- Kỹ thuật real time PCR 
Để chẩn đoán sớm, giá thành thấp ở trẻ sinh ra từ mẹ nhiễm HIV 
• Phương pháp: 
• Kỹ thuật real time RT PCR thực hiện trên gene LTR (theo ANRS 
protocol) 
• Mẫu bệnh phẩm: 
• Huyết thanh của nhóm trẻ được chẩn đoán HIV (+) và nhóm trẻ HIV(-) 
ở Campuchia (n=226) và Việt Nam (n=38) 
• 145 trẻ em gái và 119 trẻ trai 
• Độ tuổi từ 1-28 tháng, độ tuổi trung bình 7,2 tháng) 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 15 
• Độ đặc hiệu và độ nhạy tốt so vơí kỹ thuật kinh điển: kỹ thuật nested DNA 
PCR, RT PCR và kỹ thuật bDNA) 
• Nguỡng phát hiện : 400 cp/mL*, kỹ thuật thực hiện trên 200 μl huyết thanh. 
• Không cần giai đoạn sau khuếch đại 
• Độ lặp lại cao : trong cùng lần thử nghiệm, giữa các phòng xét nghiệm khác 
nhau. 
• Đơn giản 
• Nhanh 
• Giá thành rẻ 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 16 
Ngoài ra, Bệnh viện Nhi đồng 1 (TPHCM) đã thực hiện thành công kỹ thuật 
Realtime – PCR để chẩn đoán xác định các tác nhân gây viêm não ở trẻ em. 
Kỹ thuật PCR có ý nghĩa ứng dụng rất quan trọng tỏng chẩn đoán các bệnh 
truyền nhiễm mãn tính, như các bệnh do nhóm retrovirus ( bệnh leukaemia trên 
bò bonvine leukamia virus, bệnh viêm khớp/ viêm não trên dê- caprine arthritis/ 
encephalitis virus) hoặc các bệnh có thời gian phát hiện chậm do nhóm 
herpesvirus ( bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm trên bò-infectious bovine 
rhinotracheitis và bệnh Aujeszky’s) 
D. Multiplex PCR 
1. Giới thiệu 
Phản ứng multiplex PCR là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thông thường, 
ở đó hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng. 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 17 
2. Ứng dụng 
2.1. Multiplex-PCR phát hiện và định type HSV 
Herpes sinh dục là một bệnh do virus Herpes Simplex HSV1 và HSV2 gây 
nên nhưng chủ yếu là HSV2. Là bệnh cấp tính lây truyền qua đường tình duc. 
Bệnh tái phát dai dẳng, người lành mang mầm bệnh và người bệnh kín đáo 
truyền bệnh cho người khác.Bệnh có triệu chứng hoặc không có triệu chứng. 
Khi có triệu chứng: đối với Herpes sinh dục nguyên phát. Mụn nước thành chàm 
ở vị trí tiếp xúc kết hợp đau và viêm hạch bạch huyết. Tuổi mắc bệnh: ở người 
trẻ đang ở độ tuổi hoạt động tình dục. 
- Các xét nghiệm như Tzanck smear có thể thấy Tế bào đa nhân khổng lồ. 
- HSV-Multiplex-PCR: Sử dụng hỗn hợp 3 primers, cho kết quả dương 
tính và có thể phân biệt được type1 hay type 2 qua độ dài sản phẩm PCR: HSV-1 
có độ dài 503bp và HSV-2 có độ dài 435bp. 
- Hoặc HSV - PCR riêng biệt cho mỗi type HSV-1 cho sản phẩm 395bp 
và HSV-2 cho sản phẩm 302bp. 
2.2. Chẩn đoán bệnh rối loạn tiêu hóa ở dê 
Sự phát hiện bằng kháng thể kết hợp kháng nguyên bệnh rối loạn tiêu hóa. 
HLA typing sử dụng multiplex PCR và phát hiện với biosensors. 
E. Nested PCR 
1. Định nghĩa: 
Nested PCR là một dạng thay đổi của PCR thường, trong đó hai cặp mồi 
PCR được dùng để khuếch đại đoạn DNA. 
Phản ứng nested PCR phải được thực hiện hai lần. Lần đầu, phản ứng 
PCR được thực hiện trong 15 đến 30 chu kỳ, với cặp mồi thứ 1, cho phép khuếch 
đại đoạn gen dài hơn đoạn gen cần xác định nằm trong đoạn gen được khuếch 
đại lần 1. Sản phẩm PCR lần 1 sau đó sẽ là mẫu cho PCR lần 2, cặp mồi thứ 2 sẽ 
bắt cặp phía trong của sản phẩm PCR lần 1 và khuếch đại đoạn gen cần xác định. 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 18 
2. Nguyên tắc 
3. Ưu điểm 
- Tăng tính đặc hiệu là do sự bắt cặp của primer thứ hai chỉ xảy ra chủ yếu với 
đoạn gen được nhân lên bởi phản ứng PCR thứ nhất. Nếu ban đầu khuôn DNA 
bị khuếch đại sai thì khả năng khuếch đại ở lần thứ hai sẽ rất thấp 
- Tăng độ nhạy nhờ tổng số chu kỳ được thực hiện nhiều hơn 
Nested PCR áp dụng trong trường hợp có rất ít mẫu gốc 
4. Nhược điểm lớn nhất của nPCR là gia tăng mức độ tạp nhiễm trong 
quá trình chuyển mẫu giữa hai lần chạy PCR. Tuy nhiên có thể khắc phục bằng 
cách cải tiến chạy nPCR trong một ống. 
5. Ứng dụng 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 19 
Sử dụng nested PCR để phát hiện virus lở mồm long móng trên 
amidan của trâu bò bị giết mổ với biểu hiện lâm sàng bình thường xuất hiên 
ở Iran 
Aliasghar Bahari1*, Taghi Taghipour-Bazargani2, Otfried Marquardt3, 
Seyed Ali Ghorashi4, and Saied Bokaie2 
1Junior School of Veterinary Medicine, Bu-Ali Sina University, Hamadan, Iran 
2Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran 
3Federal Research Center for Virus Diseases of Animals, Tűbingen, Germany 
4National Institute for Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran 
Vật liệu và phương pháp 
Mẫu: Amidan được lấy từ 2 bò bản xứ ( giống Bos taurus và giống Bos 
indicus), cũng như từ Holstein-Friesians và con lai của chúng. Các con vật, cả 
hai cùng giới tính và tuổi khác nhau, có lâm sàng bình thường. Mỗi mẫu được 
chuyển vào một tube chứa PBS-glycerol (1:1) và giữ lạnh cho đến khi được kiểm 
tra tại Ferderal Research Center đối với bệnh virus ở động vật, Tubingen, Đức. 
Phân tách RNA: một mảnh nhỏ (30-50mg) của mỗi mẫu amidan được cắt 
nhỏ và ly giải trong buffer RLT được cung cấp bởi RNA extraction kit RNeasy 
(QIAGEN, Germany). RNA được chiết xuất từ 350 μl của mô đồng chất, và tái 
huyền phù trong 20 μl DEPC-H2O. 5 μl của tổng RNA đã chiết được dùng cho 
phản ứng RT-PCR ngay lập tức. Nước cất được dùng như đối chứng âm. 
 Sự chọn lọc oligonucleotide: trình tự primer được chọn từ trình tự bộ gen được 
bảo tồn của gen virus RNA polymerase. MOSS và HASS (1999) miêu tả rằng 
vùng ít biến động trong số kiểu huyết thanh FMDV và lý tưởng để khuếch đại và 
phát hiện tất cả 7 kiểu huyết thanh. Tên và trình tự primer như sau: 
PCR (external)primer: 3C1 antisense 5’-CGC TCT TCC ACA TCT CTG GT-3’ 
(nucleotide position O1 Kaufb.: 6329-6348) và 3A1 sense 5’-CCA CAA GCT 
GAA GGA CCC T-3’ (nucleotide position O1 Kaufb.: 5450-5468). 
Nested-PCR (internal) primers: 3C3 antisense 5’-GGC CTC ACC AGA GAA 
AATCA-3’ (nucleotide position O1 Kaufb.: 6054-6073) và 3C5 sense primer 5’- 
TAG AGC CAT GAC AGA CAG TG-3’ (nucleotide position O1 Kaufb.: 5851-
5871). 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 20 
Mẫu được khuếch đại bằng RT-PCR một bước đến thể tích cuối cùng 25 μl chứa 
5 μl RNA và 1 μl mỗi mồi external sử dụng QIAGEN® OneStep 
RT-PCR kit. Chu trình nhiệt (1) 30 min. at 50 °C, (2) 15 min. at 95 °C, 
(3) 45 s. at 94 °C, (4) 45 s. at 55 °C, (5) 1 min. at 72 °C, (6) 10 min. at 72 °C; 
bước (3)-(5) được lặp lại 40 chu kỳ. Một μl sản phẩm RT-PCR sau đó được 
khuếch đại bằng nested PCR,sử dụng mồi 3C3 và 3C5. Điều kiện chu tringf 
nhiệt tương tự như miêu tả ở trên. Mỗi phản ứng được phân tích bởi điện di trên 
gel và nhuộm ethidium bromide (4μg/ml). Sản phẩm nPCR được tinh sạch như 
đề nghị của Freiberg và ctv (1999) và nhuộm huỳnh quang để củng cố tính đặc 
hiệu của thử nghiệm. 
Phân tích thống kê: Phân tích dữ liệu thống kê được làm dựa trên 
Fischer’s exact test sử dụng phần mềm SPSS 11 . 
Kết quả 
Kết quả band mẫu chạy nPCR có kích thước mong đợi (222bp) thì dương tính. 
( hình 1) 
Fig. 1. Nested-PCR for detection of FMD viral genome in tonsil tissue samples. 
M: DNA molecular marker (Ladder 100). 
Lane 1-5: Amplification of a 222 bp DNA fragment in positive tonsil tissue 
samples. 
Lane 6: Negative control. 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 21 
III. KẾT LUẬN 
Do các ứng dụng cực kỳ to lớn và kỳ diệu trong mọi lĩnh vực, PCR đã 
thật sự làm được một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử trong thời 
điểm hiện nay. Với kỹ thuật và công nghệ ngày càng tiến bộ, các thuốc thử ngày 
càng rẻ hơn và tốt hơn, giá máy chu kỳ nhiệt ngày càng hạ và đặc biệt là việc sử 
dụng hệ thống nội tại chống ngoại nhiễm, thử nghiệm PCR không còn là một thử 
nghiệm quá cao cấp chỉ thực hiện được tại các phòng thí nghiệm hiện đại. Có thể 
nói PCR hiện nay hoàn toàn có thể triển khai tại các phòng thí nghiệm trung bình 
tại các nước đang phát triển như chúng ta. 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 22 
IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Nguyễn Ngọc Hải, 2007, Công Nghệ Sinh Học Trong Thú Y, NXB Nông 
Nghiệp 
2. Sinhhocvietnam.com 
3.  
4. Khóa luận tốt nghiệp, HOÀNG TUẤN DŨNG niên khóa 2003 – 2007, 
ẢNH HƯỞNG CỦA NẤM GLOMUS sp. VÀ BỐN MỨC PHÂN 
LÂN ĐẾN SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN BẮP C919 VÀ XÁC 
ĐỊNH NẤM CỘNG SINH MYCORRHIZA BẰNG KỸ THUẬT 
PCR. 
5.  
6.  
7. 
g_SHPT/Ch%C6%B0%C6%A1ng_18._K%E1%BB%B9_thu%E1%BA
%ADt_PCR_c%C4%83n_b%E1%BA%A3n 
8. www.pcrstation.com/nl/nested-pcr/ 
9. www.etseq.urv.es_cdmedics_vse_q=system_files_Multiplex%20PCR%2
0and%20real%20time%20PCR%20course%2020090220.pdf 
 Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 
 23 
MỤC LỤC 
I. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................ 2 
II. TỔNG QUAN ............................................................................................... 3 
A. Phương pháp PCR ....................................................................................... 3 
1. Định nghĩa...................................................................................................... 3 
2. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR...................................................................... 3 
3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR ................................................ 5 
3.1. DNA mẫu ................................................................................................... 5 
3.2. Enzyme ....................................................................................................... 5 
3.3. Primer và nhiệt độ lai ............................................................................... 5 
3.4. Các thành phần khác ................................................................................. 6 
a. Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat) .................................... 6 
b. Nồng độ MgCl2 .............................................................................................. 6 
c. Dung dịch đệm ............................................................................................... 6 
d. Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR ........................................................... 6 
4. Ứng dụng của PCR ....................................................................................... 7 
B. Phương pháp RT-PCR................................................................................. 9 
1. Phương pháp ................................................................................................. 9 
2. Nguyên tắc ..................................................................................................... 9 
3. Ứng dụng...................................................................................................... 10 
C. Phương pháp Real time PCR ................................................................... 12 
1. Định nghĩa.................................................................................................... 12 
2. Nguyên tắc ................................................................................................... 12 
3. Ưu điểm của Real-time PCR ...................................................................... 13 
4. Vấn đề đối với Real-time PCR ................................................................... 14 
5. Ứng dụng...................................................................................................... 14 
D. Multiplex PCR ............................................................................................ 16 
1. Giới thiệu .................................................................................................... 16 
2. Ứng dụng...................................................................................................... 17 
E. Nested PCR .................................................................................................. 17 
1. Định nghĩa:................................................................................................... 17 
2. Nguyên tắc ................................................................................................... 18 
3. Ưu điểm........................................................................................................ 18 
4. Nhược điểm.................................................................................................. 18 
5. Ứng dụng...................................................................................................... 18 
III. KẾT LUẬN ............................................................................................... 21 
IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................ 22