Bài giảng Chẩn đoán vi khuẩn Listeria bằng kỹ thuật gen

CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LISTERIA BẰNG KỸ THUẬT GENGVHD: Nguyễn Ngọc HảiSinh viên thực hiện: Phạm Ngọc Hà1I. Đặt vấn đề II. Nội dungII.1. Đôi nét về ListeriaII.2. Giới thiệu chung về Listeria motocytogenesII.3. Chuẩn đoán Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật geneIII. Kết luậnIV. Tài liệu tham khảo2I. Đặt vấn đề  	Trong số sáu loại Listeria, chỉ có Listeria monocytogenes gây bệnh Listeriosis rất phổ biến ở cả người và động vật. Đây là một loại bệnh thực sự nguy hiểm vì nó có thể dẫn đến tử vong, đặc biệt là đối với những người có hệ miễn dịch yếu như phụ nữ có thai, trẻ sơ sinh, người già yếu. 	Listeria monocytogenes tồn tại trong thực phẩm nên rất dễ lây nhiễm cho người đòi hỏi phải có công tác kiểm nghiệm thực phẩm khắt khe. 3 	Thông thường trong chuẩn đoán vi khuẩn thường áp dụng kỹ thuật nuôi cấy phân lập trên một số môi trường chuyên biệt và xác định vi khuẩn thông qua các phản ứng sinh hóa Nhưng do đối tượng thao thác là trên thực phẩm nên sử dụng phương pháp truyền thống là rất khó khăn, tốn kém và mất thời gian. Nhờ vậy mà các kỹ thuật gene với những ưu điểm nổi trội như nhanh, nhạy, chính xác đã được sử dụng để chuẩn đoán Listeria monocytogenes.4II. Nội dungII.1.Đôi nét về Listeria Giống vi khuẩn Listeria thuộc tộc Lactobacilleae gồm những trực khuẩn nhỏ, không sinh bào tử, có lông ở một đầu nên có thể di động, gam dương, có phản ứng catalase dương tính, oxydase âm tính. Hiếu khí hoặc yếm khí tùy ý và có khả năng lên men đường. Giống này gồm nhiều loài gây bệnh cho gia súc và người, trong đó có loài Listeria monocytogenes là loài gây bệnh sảy thai truyền nhiễm ở cừu và làm tăng số bạch cầu đơn nhân trong máu của nhiều loài động vật như bò, ngựa, dê, cừu, heo, chuột, kể cả người.5Phân loại: giống Listeria bao gồm 6 loài1. Listeria monocytogenes2. L. innocua3. L. ivanovii4. L. seeligeri5. L. welshimeri6. L. grayi6II.2. Giới thiệu chung về Listeria motocytogenes7Phân bố và cách lây lanL. monocytogenes được phân bố rất rộng rãi, nó có trong đất, nước, phân, dịch tiết đường sinh dục và niêm mạc mũi của động vật khỏeBệnh thể hiện ở nhiều dạng và sự lây truyền của vi khuẩn có khác nhau. Nếu như ở dạng phủ tạng, sự lây nhiễm qua đường ăn uống. Nếu như ở dạng thần kinh chủ yếu lây nhiễm qua đường mắt và mũi.8Hình thái và nhuộm màu L. monocytogenes gồm những trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, Gram dương. Trong môi trường nuôi cấy, khi tế bào còn non L.monocytogenes được tìm thấy ở dạng trực khuẩn. Nhưng trễ hơn dạng hình cầu (0,5×1-2 µm) lại chiếm ưu thế, đôi khi vi khuẩn xếp thành chuỗi ngắn(dễ nhầm với Streptococcus), lúc này chiêm mao dài 6-20 µm. Vi khuẩn không sinh bào tử, không tạo giáp mô, có khả năng di động. Ở 20-250C vi khuẩn di động mạnh nhất. Ở 370C vi khuẩn di động nhờ một chiêm mao ở đầu.9 Khi nhuộm từ mô bệnh hoặc dịch nuôi cấy, đôi khi vi khuẩn có dạng hình cầu xếp chuỗi dễ nhầm với Streptococci. Trong trường hợp này có thể dùng phản ứng Catalase để phân biệt. Trong canh 3-6 giờ ở 370C vi khuẩn có dạng trực, nuôi cấy 3-5 ngày vi khuẩn có dạng dài 6-20 µm hay hơn(đặc biệt chủng R). Sự di động của Listeria dùng để phân biệt với Erysipelothrix.10Đặc tính nuôi cấy và yêu cầu tăng trưởng 11Vi khuẩn có thể phát triển trong điều kiệm yếm khí. Nhiệt độ thích hợp 30-370C, pH 7,2-7,4 phát triển trên môi trường nhưng thường sử dụng môi trường thạch máu trong điều kiện 5-10% CO2 cho khuẩn lạc tròn bóng, màu trắng, đường kính 0,5-1mm và gây dung huyết.Trên môi trường Trytose agar tạo khóm sáng, trắng mờ và có màu xanh lam (màu blue-green) khi quan sát dưới ánh sáng nghiêng.Trên môi trường LSA (Listeria selective agar) tạo vòng đen quanh khóm do sự phân giải Esculin sau 24-48 giờ.Môi trường Gelatin không gây tan chảy.12Đặc tính sinh hóa Lên men chậm các loại đường như glucose, rhamnose, salicin, levulose. Không lên men mannitol, xylose, lactose, saccarose. Phản ứng Catalaza dương tính.13Sức đề khángVi khuẩn bị diệt ở 600C trong 30 phút và 720C trong 15 giây. Vi khuẩn đề kháng với sự khô hạn. Có thể sống sót trong thực phẩm và đất nhưng bị diệt bởi những chất sát trùng thông thường.Nhay cảm với nhiều loại kháng sinh nhưng tetracycline cho kết quả tốt nhất. Người ta có thể kết hợp giữa Trimethoprim với Sulphamethazol trong điều trị, vi khuẩn kháng lại với Quinolones. Erythromycine, ampicillin được dùng trong điều trị bệnh cho người.14Cấu trúc kháng nguyên và độc tố Cấu trúc kháng nguyên của L.monocytogenes phức tạp, được chia thành 16 serotype căn bản dựa trên kháng nguyên O và H. Kháng nguyên O: Bền với nhiệt được chia thành 14 loại, ký hiệu 1-14. Kháng nguyên H: Không bền với nhiệt, chia làm 4 loại:a, b, c, d. Hiện nay có 3 chủng là nguyên nhân gây bệnh chính có cấu trúc kháng nguyên là: 1/2a; 1/2b; 4b15SEROTYPEANTIGENSO(HEAT STABLE)H(HEAT LABILE)1a1bI, II, (III)I, II, (III)A, BA, B, C2I, II, (III)B, D3a3bII, (III), IVII, (III), IVA, BA, B, C4a4b4ab4c4d4e(III), (V), VII, IX(III), V, VI(III), V, VI, VII, IX(III), V, VII(III), VI, VIII(III), V, VI, VIII, IX)A, B, CA, B, CA, B, CA, B, CA, B, CA, B, C16Độc tốVi khuẩn sản sinh ra men hemolysinase có tính kháng nguyên protein. Cytolysin có tác dụng diệt tế bào. Trên bề mặt của tế bào vi khuẩn còn có lipo-polysaccharid độc đối với thỏ.17Cơ chế gây bệnh Từ lâu các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng vi khuẩn Listeria lây lan từ tế bào này sang tế bào khác trong cơ thể con người. Vi khuẩn lớn lên trong một tế bào và di chuyển nhanh chóng tạo thành một cấu trúc theo hình ngón tay nhô ra từ tế bào và đẩy sang tế bào liền kề. Khi đó vi khuẩn sẽ tiếp tục gây bệnh cho tế bào liền kề đó.1819Giáo sư Ireton và nhóm của ông đã phát hiện ra một quá trình thứ hai hỗ trợ việc lây lan của vi khuẩn sang những tế bào khỏe mạnhMàng tế bào, hay lớp ngoài cùng của những tế bào khỏe mạnh thông thường căng ra. Tình trạng căng đó được kỳ vọng là có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn không lây lan sang những tế bào chưa nhiễm bệnh liền kề. Tuy nhiên, phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton phát hiện ra rằng một loại pro-tê-in trong vi khuẩn Listeria gọi là InIC xuất hiện làm giảm đi độ căng của màng tế bào ở những tế bào nhiễm bệnh, điều này sẽ làm cho việc di chuyển của vi khuẩn để xuyên thủng màng tế bào và sau đó lây lan sang các tế bào khỏe mạnh liền kề dễ dàng hơn.2021Chẩn đoán bằng phương pháp truyền thốngNuôi cấy trên môi trường LSABệnh phẩm: gan, lách, não, thai bi sảyNhuộm GramChọn khuẩn lạcTest ANTONTiêm não thỏ(chết sau 2-3 ngày)Kiểm tra máu thỏ(Bạch cầu đơn nhân tăng 420-820/mm3)Thỏ bị nhiễm Listeria22Tình hình dịch bệnh Listeriosis Ca đầu tiên của bệnh Listeriosis đã được nói đến cách nay 70 năm, nhưng phải đợi đến những năm 1980 vi khuẩn L. monocytogenes mới được chính thức xác nhận là tác nhân gây ra bệnh ngộ độc từ thực phẩm. Từ tháng một đến tháng tám năm 1985, tại Mỹ có một đợt bùng phát khác với 142 ca nhiễm bệnh Listeriosis. Vào những năm 1990, Bộ Nông nghiệp Mĩ cho biết có một trận dịch bệnh này từ bánh mì kẹp xúc xích nóng và có thể là các cửa hàng bán thịt ngon dẫn đến ít nhất 101 người bị bệnh khiến 15 người lớn tử vong và 6 thai nhi bị sinh non. 23Năm 1999, loài L. monocytogenes đặc biệt cực độc đã tiến triển báo động các viên chức y tế và họ buộc những nhà sản xuất thực phẩm phải giải quyết vấn đề.Năm 2002, đợt bùng phát dịch bệnh Listeriosis ở nhiều bang ở Mỹ – một căn bệnh nguy hiểm do vi khuẩn Listeria gây ra -đã xác nhận có 46 ca nhiễm bệnh, 7 ca tử vong và 3 ca hỏng bào thai.Mặc dù “quy định tạm thời” đối với các sản phẩm thịt và thịt gia cầm chế biến sẵn phát hành năm 2003 giúp kiểm soát sự bùng phát vi khuẩn, nhưng rõ ràng đã không thể loại bỏ được bệnh hoàn toàn. Theo Trung tâm y tế dự phòng CDC, ước tính 2.500 người bị bệnh Listeriosis nặng mỗi năm, trong số đó có 500 người tử vong. Người có nguy cơ cao có thể mắc bệnh này sau khi ăn thực phẩm thậm chí chỉ nhiễm vài con vi khuẩn.Năm 2008 ổ dịch Listeriosis ở Canada nguyên nhân từ nhà máy Maple Leaf Foods ở Toronto, Ontario làm hai mươi hai người chết và có tổng số 57 trường hợp nhiễm bệnh.24II.3. Chuẩn đoán Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật gene Dựa tên 3 gene: gene DTH-18, gene listeriolysin O (hly A) và iap 25Phân lập L.monocytogenes từ phô mai 25g phô mai đồng nhất với 225ml dung dịch tăng sinh Listeria(LEB)-làm giàu mẫu lần 1 => Lấy 0,1ml chuyển qua 10ml canh Fraser (Oxoid) và ủ 24 giờ ở 300C – làm giàu mẫu lần 2=>thu nhận tế bào bằng IMS => Lấy 10µl để thực hiện phản ứng PCR.26Sử dụng primerPrimer 1: 5’-CTAATCAAGACAATAAAATC-3’ Giữa vị trí 536bp và 555bp.Primer 2: 5’-GTTAGTTCTACATCACCTGA-3’. Giữa vị trí 1037bp và 1056bp.27Hỗn hợp phản ứng PCR 100µl 1.25U Taq polymerase100µM mỗi loại dNTP0.5µM mỗi primer10µl DNA mẫu10nM Tris HCl (pH=8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl, 0.001% (Wt/vol) gelatin.28ADN đích1 Biến tính (94o C-1 phút)2 Bắt cặp (50o C-1 phút)3 Kéo dài (72o C-1 phút)1234nPhản ứng PCR được thực hiện 30 chu kỳ29Sản phẩm tạo thành được điện di trên gel agarose 1% nhuộm ethidium bromide hoặc được lọc bằng Z-probe(Bio-Rad) và lai với DNA probe mã hóa cho gene DTH-18. Probe listeriolysin O được đánh dấu sử dụng trong PCR. Điều kiện tương tự như miêu tả ở trên ngoại trừ 100µl thể tích phản ứng chứa 90µM dNTP và 10µM digoxigenin-dUTP. PCR dựa trên gene listeriolysin O dùng để xác định kiểu huyết thanh 4a. 30Sản phẩm của phản ứng khuếch đại PCR từ mẫu phô mai có chứa Listeria monocytogenes sau khi đã làm giàu mẫu (A). 1µl mẫu (lane 1 đến lane 4), 2µl mẫu (lane 8 đến lane 11) từ dung dịch làm giàu mẫu. (B) kết quả PCR sau khi thực hiện miễn dịch từ phân tách(IMS) của 100µl mẫu Listeria (lane 1 đến lane 4). Trước khi làm giàu mẫu, 25g phô mai phân tích chứa 0 (Bảng A,lane 1 và 8. Bảng B, lane 1), 0.4 (Bảng A, lane 2 và 9. Bảng B, lane 2), 4 (Bảng A, lane 3 và 10. Bảng B, lane 3), 40 ( Bảng A, lane 4 và 11. Bảng B, lane 4) CFU/g phô mai. Lane 6 không chứa L. monocytogenes. Sự kiểm tra khẳng định chứa 0,05µg DNA L.monocytogenes tinh khiết (lane 5). Phage lambda DNA Pst I sử dụng làm chất chỉ thị phân tử (lane7). 31Sản phẩm của phản ứng khuếch đại PCR từ mẫu phô mai được làm giàu lần 1 và 2.1µl mẫu (lane 1 đến lane 4), 2µl mẫu (lane 8 đến lane 11) từ dung dịch làm giàu mẫu lần 2.Kết quả thực hiện PCR sau IMS của 100µl mẫu Listeria (lane 1 đến 4)Trước khi làm giàu mẫu, 25g phô mai phân tích chứa 0 (Bảng A,lane 4 và 11. Bảng B, lane 4), 1 (Bảng A, lane 1 và 10. Bảng B, lane 1), 10 (Bảng A, lane 2 và 9. Bảng B, lane 2), 100 ( Bảng A, lane 3 và 8. Bảng B, lane 3) CFU/g phô mai. Lane 6 không chứa L. monocytogenes. Sự kiểm tra khẳng định chứa 0,05µg DNA L.monocytogenes tinh khiết (lane 5). Phage lambda DNA Pst I sử dụng làm chất chỉ thị phân tử (lane7). 32 Sự định lượng L.monocytogenes với SYBRGreen/Real-Time PCR Assay.Gen listeriolysin(hly A) được chọn làm mục tiêu để xác định L.monocytogenes.Mồi xuôi:5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’Mồi ngược:5’-CACTGCATCTCCGTGGTACTAA-3’Được sử dụng để khuếch đại đoạn 113bp của gene hly A(Nogva et al,2000) 33 Định lượng Real-Time PCR được thực hiện bởi máy luân nhiệt M×3005(Stratagene, La Jolla, CA, USA) trong 25µl thể tích cuối chứa 9,5µl mẫu DNA, 300mM mồi xuôi và mồi ngược(DNA Technology, Arhus, Denmark) và 12,5µl 2×High power SWBR Green PCR Master M(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 34 PCR bao gồm 45 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước biến tính ở 950C/15 giây,bắt cặp/ kéo dài ở 600C-60 giây. Phân tích melt-curve giữa 55-950C để kiểm tra sự đặc hiệu của phản ứng khuếch đại. Đường cong chuẩn được xây dựng từ các nồng độ pha loãng của tế bào vi khuẩn và quan sát chu kỳ ngưỡng Ct.35Xác định và phân tích sự khác nhau của các loài Listeria bằng Multiplex PCR Sử dụng gen iap. Thiết kế 5 mồi khác nhau để xác định các loài Listeria bằng Multiplex Ino 2[5’-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3’] Khuếch đại đoạn gene của L.innocua dài 870bpSiwi 2[5’-TAACTGAGGTAGCGAGCGAA-3’] Khuếch đại đoạn gene của nhóm L.ivanovii, L.seeligeri và L.welshimeri dài 1,2kb.36Mono A[5’-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3’] Khuếch đại đoạn gene của L.monocytogenes dài 660bpPrimer Mugrad Khuếch đại đoạn gene của L.gayi và L.murrayi dài 480bpLis 1B[5’-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3’] Đặc hiệu cho loài Listeria37Xác đinh và phân biệt các loài Listeria dựa trên Multiplex PCR chứa 5 primers MugraI, MonoA, Ino2, and Siwi2, and Lis1B (Lis-Mix). Thực hiện phản ứng trong 30 chu kỳ (biến tính ở 95°C/15 giây, bắt cặp 58°C/30 giây, kéo dài 720C/45 giây) với lane 1 chuẩn 38III: Kết luận Càng ngày có nhiều nguy cơ gây hại cho sức khỏe của con người và vật nuôi, Listeriosis là một trong những nguy cơ nguy hiểm và nó càng đáng quan tâm hơn khi nguyên nhân xảy ra hiện diện ở khắp mọi nơi đặc biệt là trong thức ăn của con người. Sử dụng phương pháp truyền thống để nhận biết sự tồn tại của Listeria đòi hỏi phải thực hiện các phản ứng sinh hóa như lên men đường, CAMPtrong phòng thí nghiệm và tiến trình này cần thời gian tối thiểu là 7 ngày theo International Dairy Federation (IDF) tiêu chuẩn 143:1995 39 Điều này không đáp ứng được yêu cầu trong chẩn đoán bệnh nhất là khi bộc phát dịch bệnh. Với sự ra đời và được cải tiến từng bước kỹ thuật PCR là phương pháp nhanh, nhạy, chính xác để xác định vi khuẩn Listeria nói chung và L.monocytogenes nói riêng. Mặt khác hiệu quả của PCR còn được tăng lên rất nhiều lần khi sử dụng kết hợp với phương pháp IMS. Thêm vào đó cải tiến PCR ta có được Multiplex PCR phương pháp này cho phép ta phân biệt rõ ràng giữa các loài Listeria, vì cho dù chỉ có L.monocytogenes là tác nhân gây bệnh thực sự nguy hiểm nhưng trên thực tế sự tồn tại của loài này không nhiều thì ít cũng có liên quan đến sự hiện diện của các loài Listeria khác.40IV. Tài liệu tham khảo1.  Tô Minh Châu- Trần Thị Bích Liên(2001). Vi khuẩn và nấm gây bệnh trong thú y.3.  4.     William Burrows, Robert Murdoch Lewert, John Willarel Rippon(1968). Fex book of microbiology- The pathogenic Microorganisms.41