Bài giảng Virus prrs và protein N tái tổ hợp ứng dụng trong chẩn đoán

VIRUS PRRS VÀ PROTEIN N TÁI TỔ HỢP ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁNGVHD: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI SVTH: NGUYỄN THỊ LI NAMSSV: 061260811Đặt vấn đềHội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo do virus Nidovirales, họ Arteviridae gây ra. Được phát hiện ở Mỹ vào năm 1987 cho đến nay đã xuất hiện rộng rãi ở Châu Âu và các nước Châu Á.PRRS đặc trưng bởi rối loạn hô hấp, xẩy thai ở heo nái và gây tỉ lệ tử vong cao trên heo con, dẫn đến sự thiệt hại lớn về kinh tế toàn cầuPRRS chiếm 1/3 chi phí cho các bệnh xâm nhiễm trong nghành công nghiệp chăn nuôi heo ở Mỹ. Biến chủng ở Trung Quốc đã giết 400.000 trong 2.120.000 số heo bị xâm nhiễm trong vòng 4 tháng ở 10 tỉnh phía đông TRung Quốc. Tại Việt Nam, từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2007, 44 ổ dịch đã bùng phát. Khoảng 44000 con heo bị nhiễm, trong đó hơn 4000 con bị chết. 2Tổng quan về virus PRRSĐược phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 tại Mỹ.thuộc họ Arteviridae, giống Artevirus,là virus ARN sợi đơn,dương có vỏ envelope bao bọc. Phân tử virion PRRS có dạng hình cầu hoặc trứng đường kính trung bình 58nm.phân tử virus có bề mặt ngoài trơn với chỉ một vài điểm lồi ra. Bên trong phân tử virion là một vòng trống với đường kính trung bình khoảng 39nm.34Cấu trúc geneGenome của virus dài khoảng 15kb và gồm tám khung đọc mở ORF. ORF 1a và 1b nằm ở đầu 5’ của genome, chiếm hơn hai phần ba bộ gene và mã hóa cho RNA polymerase của virus được xem là protein chịu trách nhiệm trong quá trình nhân lên của virus.Sáu ORF nhỏ hơn là ORF 2-7, nằm ở phía sau của ORF 1b, ở đầu 3’ của genome, mã hóa cho các protein cấu trúc liên quan đến việc hình thành virion.56Cấu trúc gene3 protein cấu trúc chính của PRRS: ORF7 quy định protein nhân (N-nucleocapsid) trọng lượng phân tử khoảng 15 kDa .ORF6 quy định protein màng (M-membrane) trọng lượng khoảng 19 kDa. ORF5 quy định protein vỏ glycoprotein (E-envelope, GP5) trọng lượng khoảng 24-25 kDa.7Sự đa dạng trong các chủng virus PRRS lưu hành trên thế giớiPRRS lưu hành trên thế giới với 2 dòng khác nhau: dòng Châu Mỹ (tiêu biểu là chủng VR-2332) và dòng Châu Âu (tiêu biểu là Lelystad-LV). Dòng Châu Mỹ và dòng Châu Âu khác nhau khác nhau về đặc điểm bộ gene và yếu tố kháng nguyên và về đặc tính gây bệnh. Các chủng trong cùng một dòng thì có sự tương đồng về cấu trúc kháng nguyên. Tùy theo ORF sự tương đồng gene của hai dòng v PRRSV Châu Âu và Châu Mỹ dao động từ 52 đến 81%.89Triệu chứng lâm sàngTriệu chứng sinh sản: heo nái sốt 39-40°, bỏ ăn,mệt mỏi, giảm tỉ lệ thụ thai và số con đẻ ra, sảy thai, giảm tiết sữa hoặc mất sữa, thai gỗ, chết thai, đẻ non, chậm động dục hoặc không động dục trở lại. Triệu chứng hô hấp : loạn hô hấp, lợn biểu hiện đau khi thở, hắt hơi, tăng tần số hô hấp, thở khó, thở đứt quãng. Heo con có tỉ lệ chết trước cai sữa cao, gầy yếu, bỏ ăn, phù mắt,các nốt phồng rộp trên da, ỉa chảy, đi không vững và run, đứng choãi chân. Heo lớn có biểu hiện sốt nhẹ, bỏ ăn. Heo đực giống giảm hưng phấn, giảm thể tích và chất lượng tinh dịch 10Bệnh tích Heo nái, heo trưởng thành thường không có các bệnh tích đặc thù.Heo con thường mang các bệnh tích: dịch thẩm thấu trong đường tiêu hóa, đường hô hấp đặc biệt trong các phế quản, phù, thanh dịch trong xoang phúc mạc, xoang ngực, xoang phế mạc và tung các mạc, sưng hạch bạch huyết, da nhiều vùng có màu xanh tím11Phương thức truyền lâyVirus thường xâm nhiễm heo thông qua đường hô hấp, tiếp xúc giữa lợn ốm và lợn khỏe là đường truyền lây chính Vi rút PRRS có trong dịch mũi, nước bọt, tinh dịch, phân và nước tiểu của lợn bị bệnh, vi rút có thể phát tán theo gió, không khí (xa trên 3km), nước, hoặc dụng cụ bảo hộ lao động, dụng cụ chăn nuôi và chim hoang truyền dẫn...Heo mang virus có thể giải phóng virus trong thời gian 3-4 tháng12Tổng quan về protein tái tổ hợp dựa trên ORF7 và ứng dụng trong chẩn đoán N protein quy định bởi ORF 7 hiện diện với số lượng lớn nhất trong phân tử virion của PRRSV. Huyết của heo bị xâm nhiễm bởi PRRS phản ứng mạnh với N protein. Hầu hết kháng thể đơn dòng thu được từ chuột bị cho nhiễm PRRS bán tinh sạch nhận biết đặc hiệu với N-protein. ORF 7 mã hóa cho Protien N có cấu trúc ổn định và được bảo tồn cao. N protein được xem là ứng viên sáng giá trong chẩn đoán heo bị nhiễm PRRS13Tổng quan về protein tth dựa trên ORF7, ứng dụng trong chẩn đoán ELISA phát hiện kháng thể kháng PRRSV thông dụng và tin cậy trong phát hiện chẩn đoán PRRS cần một lượng lớn kháng nguyên là lớn dùng trong các kit chẩn đoán . PRRSV thường khó nuôi trên môi trường tế bào. Sản xuất protein tái tổ hợp cho PRRSV là hướng đi đúng và có nhiều ưu điểm, đặc biệt sản xuất protein tái tổ hợp N mã hóa bởi ORF7 mang tính ứng dụng cao dùng làm vật liệu trong các kit chẩn đoán 14Cấu trúc phân tử của Protein N15Cấu trúc phân tử của Protein NProtein N gồm năm vùng cấu trúc chính và có cấu xoắn α-helix.Vùng I: nằm giữa amino acid thứ 18 và 52. Bao gồm vùng quan trọng quyết định yếu tố kháng nguyên nằm giữa amino acid thứ 30 và 52. Vùng này được nhận diện đặc hiệu bởi kháng thể đơn dòng SDOW17, là kháng thể đơn dòng duy nhất phát hiện, nhận diện một epitope chung (nằm ở vị trí bên trong vùng bảo tồn của N protein, cấu hình xoắn helical, kị nước,) cho hầu hết các chủng virus PRRS Châu Âu và Bắc Mỹ, epitope này, 16Cấu trúc phân tử của Protein NVùng II: từ amino acid 37 đến 52, bao gồm các epitope tuyến tính.Vùng III, từ amino acid 52 đến 69, nằm trong vùng bảo tồn cao của N protein. Các amino acid từ 40 đến 66 nằm trong vùng ưa nước của N-protein, và nằm ở vùng dễ phát hiện trên bề mặt ngoài của capsid. Vùng trội IV, trải dài từ amino acid thứ 69 tới 112, được phát hiện bởi sự gắn kết đặc hiệu của kháng thể đơn dòng SR30. Vùng trội V từ amino acid 112 đến amino acid đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu hình chung của protein.17Quy trình sản xuấtPRRS RNA cDNA đoạn gene quan tâm vector pACAS3baculovirusTế bào Sf20Chọn lọc Tinh sạch protein Ntth18Quy trình sản xuấtChuẩn bị tế bào và virus: virus Autographa California nuclear polyhidrosis (AcNPV) và các virus tái tổ hợp được nuôi cấy trong dòng tế bào Spodoptera frugiperda Sf21. LV và ATCC VR2332 được phát triển trong tế bào đại thực bào túi phổi của heo(PAM) hoặc trong tế bào CL262119Quy trình sản xuấtThiết lập plasmid: tổng hợp hai đoạn oligonucleotide chuyên biệt nằm ở trước và sau của ORF7 LV40 (59-GATTGGATCCTCGTCAAGTATGGCCGG-39) LV41(59-CTAAGGATCCTGTCAAATTAACTTGCA-39), sử dụng làm primer trong PCR để khuyếch đại ORF7 từ cDNA . Vị trí cắt giới hạn BamHI được thêm vào mồi để tạo dòng ORF7 sau promoter p10 của baculovirus chuyển bởi vector pACAS3.20Quy trình sản xuấtChuyển : Chủng AcNPV DNA hoang dại và pACAS3 được đồng chuyển vào tế bào Sf21. Chọn lọc Virus tái tổ hợp biểu hiện ß-galactosidase .Kiểm tra sự biểu hiện của N protein: ly trích DNA từ tế bào Sf21 đã được chuyển gene ở trên. DNA của virus được cắt bởi BamHI và XhoI để khẳng định gene ORF7 được chèn đúng vào locus p10 của baculovirus.21Quy trình sản xuấtThu hoạch protein tái tổ hợp: ly giải tế bào Sf21 và thu hoạch protein N tái tổ hợp được biểu hiện bởi tế bào này22Quy trình sản xuấtKiểm tra hoạt tính của protein N tái tổ hợp vừa thu hoạchSử dụng phương pháp điện di và miễn dịch kết tủa (immunoprecipitation)Kết quả điện di cho thấy kích thước của Protein tth tương đương protein tự nhiênKết quả miễn dịch kết tủa: protein N tái tổ hợp kết hợp được với các protein nhận biết đặc hiệu cho protein N23Quy trình sản xuấtThử nghiệm hoạt tính protein bằng cách chủng protein này cho heo conKết quả tăng lượng kháng thể nhận diện protein N trong cơ thể heo protein N tái tổ hợp có đặc tính giống đặc tính protein N tự nhiên24Kết luậnPRRSV là virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo làm thiệt hại kinh tế lớn với đặc điểm đa dạng di truyền lớn, cùng những biến chủng mới độc lực cao, gây khó khăn trong chẩn đoán và chế tạo vaccine đặc hiệu, nguy cơ gây ra dịch bệnh lớn khó kiểm soát.Cần có nghiên cứu chuyên sâu về đặc điểm di truyền, cấu trúc, các loại kháng nguyênđể có hướng chính xác trong chẩn đoán, sản xuất vaccineNuôi cấy PRRSV trên môi trường tế bào khó khăn nên phát triển phương pháp sản xuất protien tái tổ hợp ứng dụng trong chẩn đoán và sản xuất vaccine.25Tài liệu tham khảoNguyễn Ngọc Hải, Công nghệ sinh học trong thú y, nhà xuất bản Nông Nghiệp, 2007.Sarah k. Wooton, Eric A.Nelson, and Dongwan Yoo, Department of Pathobiology, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, Ontario N1G 2W1, Canada,and Department of Veterinary Science, South Dakota State University, Brookings, South Dakota . Antigenic structure of the Nucleocapsid Protein of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus.J.J.M. Meulenberg, R.J.Bende, J.M.A.Pol, G.Wensvoort, and R.J.M. Moormann, Department of Virology, Institute for Animal Science and Health (ID-DLO), Lelystad, The Netherlands. Nucleocapsid Protein N of Lelystad Virus: Expression by Recombinant Baculorvirus, Immunological Properties, and Suitability for Detection of Serum.Youjun Feng, Tiezhu Zhao, Tung Nguyen, Ken Inui, Ying Ma, Thi Hoa Nguyen, Van Cam Nguyen, Di Liu, Quang Anh Bui, Long Thanh To, Chuanbin Wang, Kegong Tian, and George F. Gao. Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Variants, Viet Nam and China, 2007.Kyoung-Jin Yoon, assistant professor; Chih-Cheng Chang, Graduate assistant; Jeffrey Zimmerman, associated professor; and Karent Harmon, associated scientist, Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal Medicine. Field and Experimental Assessment of PRRSV Evolution.Dee S, Deen J, Rossow K, Weise C, Eliason R, Otake S, Joo HS, Pijoan C. Can J Vet Res. 2003.Mechanical transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus throughout a coordinated sequence of events during warm weather. T Dokland, A Deshpande, Y Fang, E Nelson, Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham; Department of Veterinary Science, South Dakota State University AM Burrell, W Xu, Q Hoang, RC Willis, R Shah, M Bounpheng, X Fang Applied Biosystems, Austin, Texas, Cryo-electron microscopy of PRRSV virions.26