Tiêu chuẩn ngành: Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng zinc bacitracin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TIÊU CHUẨN NGÀNH
10TCN 834:2006
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ZINC BACITRACIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Animal feeding stuffs - Determination of Zinc bacitracin content by high - performance liquid chromatographic method
(Ban hành kèm theo Quyết định số 4099/QĐ/BNN-KHCN ngày 29 tháng 12 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn)
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này áp dụng để phân tích hàm lượng kháng sinh Zinc bacitracin (Zn- bacitracin) trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 5mg/kg. 
2. Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi:
TCVN 4851 (ISO 3696). Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.
ISO 6497:2002 (E). Thức ăn chăn nuôi. Lấy mẫu. (Animal feeding stuffs - Sampling).
3. Nguyên tắc
Zn-bacitracin trong mẫu thức ăn chăn nuôi được chiết bằng dung môi axit hóa. Dịch chiết được ly tâm, lọc và phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV ở bước sóng 254nm. 
4. Thiết bị, dụng cụ
4.1. Máy nghiền mẫu phòng thí nghiệm.
4.2. Sàng phòng thí nghiệm, có kích thước lỗ sàng 1,00 mm và 3,00 mm.
4.3. Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.
4.4. Cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01 g.
4.5. Máy ly tâm lạnh có tốc độ 3000 vòng/phút, sử dụng ống ly tâm dung tích 30 ml.
4.6. ống ly tâm, dung tích 30 ml bằng polypropylen hoặc bằng thuỷ tinh, có nắp đậy.
4.7. Máy lắc tròn hoặc máy lắc ngang có thể đạt tốc độ 250 vòng/phút.
4.8. Máy đo pH có độ chính xác đến 0,05 đơn vị.
4.9. Bình định mức dung tích 10, 100, 1000 ml.
4.10. Pipet tự động điều chỉnh được từ 1ml đến 10 ml.
4.11. Micropipet dung tích từ 10 ml đến 100 ml và 200ml đến 1000ml.
4.12. Hút dung môi tự động 2 ml, 10 ml, 20 ml.
4.13. Máy lắc ống nghiệm (Vortex mixer).
4.14. ống đong 1000ml.
4.15. Bình nón dung tích 125ml.
4.16. Bể siêu âm.
4.17. Bơm hút chân không.
4.18. Màng lọc syranh có kích thước 0,45 mm.
4.19. Lọ nhỏ dựng dịch mẫu chuyên dụng cho HPLC, có nắp vặn PTFE .
4.20. Thiết bị trộn mẫu phòng thí nghiệm loại Hobart Model C 100 T hoặc tương đương.
4.21. Thiết bị chia mẫu:
Thiết bị chia đôi hoặc chia tư mẫu: ví dụ như thiết bị chia tư hình nón, thiết bị chia nhiều ngăn có hệ thống phân hạt hoặc các thiết bị chia khác đảm bảo phân chia mẫu thí nghiệm thành mẫu thử đồng nhất.
4.22. Hộp đựng mẫu có nắp kín.
4.23. Hệ thống HPLC gồm có:
4.23.1. Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao, bình chứa dung môi, hệ thống bơm mẫu, detector UV đặt được ở bước sóng 254nm, máy ghi hoặc bộ tích phân.
4.23.2. Cột phân tích HPLC pha đảo có kèm cột bảo vệ
	Chiều dài 150mm
	Đường kính trong 4,6mm
	Hạt nhồi C 18; 5mm hoặc tương đương
5. Hóa chất và thuốc thử
5.1. Hoá chất
Chỉ sử dụng hoá chất được công nhận đạt chất lượng tinh khiết phân tích và nước cất cấp hạng 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696). Các dung môi phải đạt chất lượng để dùng cho phân tích HPLC.
5.1.1. Acetonitrile.
5.1.2. Metanol.
5.1.3. Kali dihydrophosphat (KH2PO4).
5.1.4. Kali hydrophosphat (K2HPO4).
5.1.5. Dinatri ethylen diamin tetraacetic (Na2EDTA.2H2O).
5.1.6. Axit photphoric (85%).
5.1.7. Chất chuẩn Zn-bacitracin: loại tinh khiết, có kèm theo giấy chứng nhận hàm lượng (theo đơn vị hoạt tính, không ít hơn 42 iu bacitracin/mg) .
5.2. Thuốc thử
5.2.1. Dung dịch đệm phosphat- EDTA- pH 4,5.
Cân 13,6g kali dihydrophosphat và 2,5g dinatri ethylen diamin tetraacetic với độ chính xác 0,01mg cho vào bình định mức 1000ml, hòa tan và định mức đến vạch bằng nước cất. Lắc đều dung dịch.
5.2.2. Dung dịch đệm phosphat- pH 6,0.
Cân 1,5g Kali hydrophosphat và 8,5g kali dihydrophosphat với độ chính xác 0,01mg cho vào bình định mức 1000ml, hòa tan và định mức đến vạch bằng nước cất. Lắc đều dung dịch.
5.2.3. Dung dịch natri hydroxit 0,1mol/l
5.2.4. Các dung môi
5.2.4.1. Chuẩn bị dung môi chiết và các dung môi A, B bằng cách trộn các hóa chất và thuốc thử theo tỉ lệ phần trăm thể tích (v/v) như bảng 1 sau:
Bảng 1: Tỉ lệ pha các hỗn hợp dung môi
Hóa chất, 
thuốc thử
Thể tích (%)
Dung môi chiết
Dung môi A
Dung môi B
Acetonitrile
28
0
40
Metanol
28
0
12
Đệm phosphat- EDTA
0
20
20
Đệm phosphat
3
0
0
Acid phosphoric đặc 
1,2
0
0
5.2.4.2. Cách pha các dung môi
Lấy một lượng các hóa chất, thuốc thử theo tỉ lệ phần trăm thể tích (v/v) như ở bảng 1 cho vào bình định mức 1000ml và thêm nước cất đến vạch mức. Lắc đều dung dịch.
5.2.5. Pha động 
Pha động dùng trong phân tích được chuẩn bị bằng cách trộn 590ml dung môi B (bảng 1) với 410ml dung môi A vào ống đong 1000ml. Trộn đều và điều chỉnh đến pH 6,8 bằng dung dịch natri hydroxit 0,1mol/l. Nếu cần thiết có thể điều chỉnh thể tích dung môi B để thu được sự phân giải pic tốt nhất. Sau đó lọc hỗn hợp dung dịch thu được qua phễu hút chân không với màng lọc có kích thước lỗ 0,45 mm, siêu âm đuổi khí ở nhiệt độ thường trong 30 phút.
5.2.6. Dung dịch chuẩn
5.2.6.1. Dung dịch chuẩn gốc 1000mg/ml
Tùy theo hàm lượng bacitracin ghi trong giấy chứng nhận (5.1.7), cân một lượng nhất định chất chuẩn Zn-bacitracin chính xác đến 0,1mg cho vào bình định mức dung tích 100ml, pha loãng và định mức bằng dung môi chiết (bảng1) để sao cho thu được dung dịch có nồng độ 1000mg/ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản trong lọ sẫm màu ở 40C, có thể sử dụng được trong vòng 1 tuần.
5.2.6.2. Dãy dung dịch chuẩn phân tích sắc ký: 10, 20, 50 và 100 mg/ml
Các dung dịch xây dựng đường chuẩn được chuẩn bị trong ngày bằng cách hút chính xác lần lượt 100, 200, 500 và 1000ml dung dịch chuẩn gốc 1000mg/ml (5.2.6.1) cho vào các bình định mức dung tích 10ml, pha loãng và định mức đến vạch bằng dung môi chiết (bảng 1).
Chú ý: Nếu sau khi pha 3 giờ mà chưa sử dụng, cần bảo quản các dung dịch chuẩn trên ở 4oC. Nhưng tốt nhất là pha các dung dịch chuẩn này, sau đó bảo quản trong tủ lạnh ít nhất 30 phút trước khi phân tích và chỉ đưa ra ngay trước khi chạy sắc kí.
6. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
6.1. Lấy mẫu
Phương pháp lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo ISO 6497: 2002. Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thí nghiệm phải là mẫu trung thực và có tính đại diện, không bị hư hại hoặc bị biến đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Khối lượng mẫu phân tích phải không được ít hơn 500 gam.
6.2. Chuẩn bị mẫu
6.2.1. Mẫu ở dạng bột mịn
Nếu mẫu thí nghiệm ở dạng bột lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm thì trộn thật đều mẫu (500 gam) bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút. Sau đó chia hỗn hợp bằng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam. 
6.2.2. Mẫu có kích thước hạt vừa
6.2.2.1. Nếu mẫu thí nghiệm không lọt hết qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm nhưng lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ 3,00 mm thì trộn thật đều mẫu (không ít hơn 500 gam) bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút.
6.2.2.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫu đã trộn đều (6.2.2.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam. Nghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy nghiền (4.1) cho dến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm.
6.2.3. Mẫu có kích thước hạt to.
6.2.3.1. Nếu mẫu không lọt qua sàng có kích thước lỗ sàng 3,00 mm thì cần nghiền mẫu (không ít hơn 500 gam) trên máy nghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 3,00 mm, sau đó trộn thật đều mẫu bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút.
6.2.3.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫu đã trộn đều (6.2.3.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam. Nghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy nghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm.
Các mẫu thử được bảo quản trong các lọ đựng mẫu (4.19) ở điều kiện nhiệt độ 2 - 250C, nơi khô ráo.
Chú ý: Nên nghiền, trộn mẫu trong các phòng có thông gió, nên đeo kính, khẩu trang và găng tay bảo vệ.
7. Cách tiến hành
7.1. Chiết xuất mẫu
Cân chính xác đến 0,1mg từ 1,0g - 5,0g mẫu thử đã được nghiền mịn theo mục 6 (tuỳ theo hàm lượng kháng sinh có trong mẫu) cho vào bình nón 125ml, thêm 50ml dung môi chiết (bảng 1). Tiến hành chiết Zn-bacitracin bằng cách lắc trên máy lắc trong thời gian 20 phút ở tốc độ 250 vòng/phút. Lấy 10ml phần dịch chiết chuyển vào ống ly tâm (4.6) và ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Thu lấy dịch trong và cho qua màng lọc 0,45mm vào lọ nhỏ chuyên dụng cho HPLC (4.19) để phân tích trên hệ thống sắc kí. 
Chú ý: Nếu sau khi pha 3 giờ mà chưa sử dụng, cần bảo quản dịch trong thu được sau khi lọc ở 4oC. Nhưng tốt nhất nên chiết mẫu và bảo quản trong tủ lạnh ít nhất 30 phút trước khi phân tích và chỉ đưa ra ngay trước khi chạy sắc kí.
7.2. Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu thức ăn chăn nuôi được xác định là không có Zn-bacitracin. Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự như mẫu thử theo mục 7.1.
7.3. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 
Việc xác định độ thu hồi được chuẩn bị bằng cách cho một lượng dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp được pha từ dung dịch gốc vào 5g mẫu trắng (7.2) để đảm bảo mẫu có hàm lượng Zn-bacitracin nằm trong dãy đồ thị chuẩn, mẫu được để yên trong 30 phút trước khi tiến hành chiết xuất. Sau đó tiếp tục quá trình chiết mẫu tương tự như đối với mẫu thử theo mục 7.1.
7.4. Phân tích trên HPLC
7.4.1. Điều kiện sắc ký: 
	Nhiệt độ cột	nhiệt độ phòng
	Detector	detector UV bước sóng 254 nm
Tốc độ dòng	 	1 ml/phút
	Thể tích bơm mẫu 	20 ml
7.4.2. Tiến hành
7.4.2.1. Nên sử dụng bảo vệ cột, việc sử dụng bảo vệ cột không có bất cứ ảnh hưởng nào đến kết quả phân tích. 
7.4.2.2. Cân bằng hệ thống sắc ký bằng pha động (5.2.5) 30 phút trước khi bơm mẫu.
7.4.2.3. Quy trình bơm mẫu theo thứ tự như sau: dịch mẫu trắng, các dung dịch chuẩn, dịch mẫu thu hồi, dịch mẫu thử, các dung dịch chuẩn.
CHÚ Ý: Cần bơm các dịch chuẩn trước và sau mỗi đợt phân tích, không nên để quá 20 lần bơm mẫu cho mỗi đợt phân tích. Nếu quá 20 lần thì phải bơm các dung dịch chuẩn thêm lần nữa vào khoảng giữa đợt bơm mẫu.
7.4.2.4. Xác định chiều cao tổng cộng của 4 pic tương ứng với thành phần zn- bacitracin của dung dịch thang chuẩn và của mẫu thử tương ứng.
7.4.2.5. Sau khi chạy máy phải làm sạch hệ thống HPLC bằng hỗn hợp gồm nước cất : axetonnitril theo tỷ lệ thể tích 40:60 trong 30 phút để loại hết đệm trong hệ thống trước khi tắt máy.
8. Tính toán kết quả
8.1. Đường chuẩn
8.1.1. Phải đảm bảo rằng các chiều cao pic của mẫu thử đều nằm trong phạm vi của đường chuẩn. Nếu mẫu thử nào có chiều cao pic vượt quá chiều cao của đường chuẩn ở nồng độ cao nhất thì sẽ bị loại và phải tiến hành thử lại với sự pha loãng.
8.1.2. Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa chiều cao pic thu được của dung dịch chuẩn với nồng độ của Zn-bacitracin theo quan hệ tuyến tính bậc 1: 
y = ax + b
Trong đó: 
	y là chiều cao pic
	x là nồng độ của kháng sinh
	a là hệ số góc
	b là hằng số
8.2. Tính toán
8.2.1. Hàm lượng Zn-bacitracin có trong mẫu thử được tính toán dựa vào đường chuẩn hồi qui tuyến tính (8.1.2) theo công thức sau:
Trong đó: 	X là hàm lượng Zn-bacitracin có trong mẫu thử, tính bằng mg/kg
Y là hiệu số giữa chiều cao pic của dịch chiết mẫu thử và chiều cao pic của mẫu trắng
	a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b
	V là thể tích dịch chiết mẫu (7.1), tính bằng ml
	m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam
8.2.2. Kết quả cuối cùng là giá trung bình của hai lần phân tích nhắc lại. Trong quá trình tính toán luôn phải lấy hai số sau dấu phẩy. Giá trị trung bình được làm tròn đến một chữ số thập phân.
8.2.3. Xác định độ thu hồi (R) theo công thức sau:
Trong đó: 
C1 là hàm lượng Zn-bacitracin xác định được theo quy trình phân tích (tính bằng mg/kg).
C là hàm lượng Zn-bacitracin được nạp thêm vào mẫu (tính bằng mg/kg).
Độ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu ít nhất phải đạt 80%.
9. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo kết quả phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:
- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu thử.
- Viện dẫn của tiêu chuẩn này hoặc phương pháp thử.
- Kết quả và đơn vị biểu thị kết quả.
- Ngày tháng lấy mẫu và kiểu loại lấy mẫu (nếu có).
- Ngày tháng thử nghiệm.
- Các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm.
- Mọi thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tuỳ chọn, cùng với các chi tiết của sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.