Tiểu luận Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật Elisa - Trần Thị Quế

CHẨN ĐOÁN VIRUS CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISAGiáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc HảiSinh viên thực hiện: Trần Thị Quế1Nội dung báo cáoI. Đặt vấn đềII.Giới thiệu chung1. Lịch sử hình thành bệnh2. Căn bệnh3. Bệnh do virus cúm gia cầm gây ra4. Phòng chống bệnh cúm gia cầmIII. Chẩn đóan virus cúm bằng phương pháp ELISA.IV. Kết luận2I. ĐẶT VẤN ĐỀNguy cơ lây lan của dịch cúm gia cầm khắp toàn cầu.Đại dịch cúm cướp đi sinh mạng của hàng trăm triệu người cùng những thiệt hại về kinh tế. Nhiều biện pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm nhằm hạn chế sự lây lan và phát tán của mầm bệnh. việc phát hiện, chẩn đoán virus cúm gia cầm một cách có hiệu quả, nhanh, chính xác, rẻ tiền là một vấn đề bức thiết.3II. GIỚI THIỆU CHUNG41. LỊCH SỬ BỆNH52. CĂN BỆNH Giới thiệu chung về virus cúm gia cầm A. Hình thái và cấu trúcCúm gà hay cúm gia cầm là một loại bệnh cúm do virus gây ra cho các loài gia cầm (hay chim), và có thể xâm nhiễm một số loài động vật có vú. Virus cúm gà: avian influenza (AI), nhóm virus cúm A, họ Orthomyxociridae. Là retrovirus, vật liệu di truyền là RNA, sợi đối mã (sợi âm tính), có dạng đa hình thái, kích thước 80-120nm.Cấu trúc bộ gene của virus gồm 8 phân đoạn, mã hóa cho các protein: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS.6Các phân nhóm (subtype) của virus cúm gia cầm được xác định dựa trên cấu trúc của các protein bề mặt HA và NA. 16 subtype HA 9 subtype NA7Haemagglutinin (HA)Là một protein bề mặt, có khả năng bám trên các thụ thể tế bào chứa sialic acid, giúp virus nhân lên và gây bệnh.Kích thích cơ thể vật chủ sinh kháng thể bảo hộ HI.Hemagglutinin 8Neuraminidase (NA)Là protein bề mặt, có hoạt tính sialidase, giúp virus phân cắt HA ra khỏi màng.Là kháng nguyên bề mặt kích thích cơ thể vật chủ tạo kháng thể NI. Neuraminidase 91011Miễn dịchĐáp ứng miễn dịch cục bộ tại niêm mạc và miễn dịch toàn thân. Mức độ đáp ứng miễn dịch: gà > gà lôi > gà tây > cút > vịt.Sau 5 ngày gây nhiễm, chủ yếu thấy xuất hiện IgM và một ít IgG. Đáp ứng sinh kháng thể từ các protein bề mặt ( HA và NA) là các kháng thể trung hòa có tính đặc hiệu cao.12Chẩn đoán:Chẩn đoán lâm sàngChẩn đoán phòng thí nghiệmPhát hiện virus Phát hiện kháng thểDịch tễ, triệu chứng, bệnh tíchPhát hiện protein hoặc DNA virusPhân lập virus miễn dịch huỳnh quangELISA, RT-PCR real-time PCRELISA, AGID, HI, miễn dịch huỳnh quang.131. Giới thiệu chung về kỹ thuật ELISAELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể. 14 2 loại: 	ELISA trực tiếp nhằm tìm kiếm kháng nguyên (ELISA capture hoặc ELISA sandwich) 	ELISA gián tiếp nhằm tìm kiếm kháng thể (indirect hoặc ELISA cạnh tranh = competitive ELISA). 152. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật ELISALấy mẫu và bảo quản mẫu: 	+Dùng tăm bông lấy mẫu dịch khí quản 	hoặc mẫu phân ở lỗ huyệt gia cầm 	sống hoặc chết => tăm bông được cho 	vào môi trường vận chuyển vô trùng 	chứa kháng sinh. +Mô (gan, lách, thận, tụy, não) đặt vào túi 	plastic vô trùng. Bảo quản riêng các mô 	đường ruột và đường hô hấp.16+ Xét nghiệm mẫu trong vòng 48 giờ sau khi thu thập=> bảo quản ở 4oC, mẫu được giữ lâu hơn => bảo quản ở -70oC. + Mô: nghiền thành huyễn dịch 5-10% trong môi trường vận chuyển và được lắng lọc bằng ly tâm với tốc độ thấp.17a. Phát hiện kháng nguyênBản chất kháng nguyên của cúm gia cầm phụ thuộc chính vào hai yếu tố H và N => phát hiện và phân biệt các subtype kháng nguyên virus cúm cần ít nhất 2 bộ kit và 2 lần xét nghiệm.Lần 1: Xác định yếu tố HA (Hemaglutinin).Lần 2: Xác định yếu tố NA (Neuraminidase).18Phương pháp: dùng ELISA trực tiếpDirect competitive ELISA to detect soluble antigens.Ag = antigen; Ab = antibody;E = enzyme.19Steps of a Sandwich Elisa. (1) A monoclonal or polyclonal antibody  is usually attached  to the plate. (2) Incubation with the unknown sample. (3) Addition of the conjugate. (4) Substrate addition. Every step is preceded by incubations and washings2021Direct ELISA: Nhanh, tránh được phản ứng chéo của kháng thể thứ cấp với các thành phần trong mẫu. Đòi hỏi đánh dấu tất cả các kháng thể được sử dụng=> tốn thời gian, chi phí.Một số kháng thể không phù hợp với việc đánh dấu trực tiếp. Thường thiếu sự khuyếch đại tín tín hiệu thêm vào mà có thể đạt được với việc sử dụng kháng thể thứ cấp.22b. Phát hiện kháng thể: Bản chất kháng nguyên của cúm gia cầm là H và N => virus cúm xâm nhập vào cơ thể nó kích thích cơ thể tạo ra 2 loại kháng thể trung hòa có tính đặc hiệu cao:HA kích thích cơ thể tạo kháng thể HI.NA kích thích cơ thể tạo kháng thể NI. 2 bộ kit ELISA, chẩn đoán 2 lần: Xác định kháng thể kháng HA trước sau đó là kháng thể kháng NA.23Phương pháp chẩn đoán: ELISA gián tiếp.24Indirect ELISA steps: (1) Antigen is bound to the plate. (2) Addition of test serum. (3) Addition of the conjugate. (4) Addition of the substrate2526Indirect ELISA Kháng thể thứ cấp được sử dụng rộng rãi với nhiều kháng thể sơ cấp (vd: all mouse monoclonal antibodies). Kháng thể thứ cấp gia tăng độ nhạy của phản ứng (do khuyếch đại tín hiệu thêm vào). 27KẾT LUẬNViệc chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng phương pháp ELISA giúp cho việc phát hiện và phân loại virus nhanh chóng và dễ dàng hơn. Đơn giản, đặc hiệu, nhạy và nhanh. Xét nghiệm được một số lượng mẫu lớn. Giúp tầm soát nguồn bệnh tốt hơn. được ứng dụng rỗng rãi trong thực tế nhất là khi đại dịch cúm bùng phát trên diện rộng.28TÀI LIỆU THAM KHẢOCông nghệ sinh học trong thú y. 2007. Nguyễn Ngọc Hải