Bài giảng Kỹ thuật gen trong chuẩn đoán vi khuẩn

Kỹ thuật gen trong chuẩnđoán vi khuẩnPasteurella multocida.GVHD: TS. Nguyễn Ngọc HảiSVTH: Nguyễn Trung TuyếnMSSV: 06126179Nội dungMở đầuTổng quan	*Giới thiệu bệnh tụ huyết trùng	*Vài nét sơ lược về lịch sử	*Vi khuẩn Pasteurella multocidaMột số phương pháp chuẩn đoánKết luậnTài liệu tham khảoLời mở đầuSinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức độ phân tử có phạm vi nghiên cứu rông khắp. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này. Sinh học phân tử là một bộ môn khoa học còn rất non trẻ nhưng đã có nhiều bước tiến vượt bậc và tác động toàn diện đến nhiều ngành khoa học, đến sản xuất và đời sống. Ngành kinh tế chăn nuôi hiện nay đang gặp nhiều nguy cơ đe dọa quá trình phát triển. Trong đó, dịch bệnh đã ảnh hưởng rất lớn về lợi nhuận, quá trình sản xuất, tình hình chăn nuôi gia cầm trên thế giới. Vì vậy, việc ứng dụng những kỹ thuật sinh học phân tử vào việc chẩn đoán, điều trị bệnh trên vật nuôi hiện nay là một tất yếu. TỔNG QUANTổng quan về bệnh tụ huyết trùng.Sơ lược vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng.Đặc điểm vi khuẩn Pasteurella multocida.Tổng quan về bệnh tụ huyết trùngTụ huyết trùng là bệnh nhiễm khuẩn có độc lực cao ở gia súc gia cầm, do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra.Bệnh chủ yếu gây nhiễm khuẩn huyết. Vi khuẩn tấn công vào cơ quan tiêu hoá, các hạch và nhất là cơ quan hô hấp.Bệnh lưu hành ở từng địa phương, hoặc thành dịch lớn ở trâu, bò, dê, cừu, thỏ, gia cầm. Bệnh ở gia cầm còn gọi là hoắc loạn gà. Bệnh ở trâu, bò, lợn còn gọi là nhiễm khuẩn huyết xuất huyết. Bệnh ở trâu còn gọi là bacbon (barbone).Bệnh thường xảy ra khi thời tiết thay đổi, thường phát vào mùa nóng ẩm ở những vùng ẩm thấp, cơ thể thú nuôi giảm sức đề kháng, bệnh thường lây qua đường hô hấp, tiêu hoá, vết thương ngoài da hoặc tiếp xúc với nguồn bệnh.Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùngLịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trên thế giới. Năm 1875, Bollinger là người đầu tiên phát hiện ra bệnh tụ huyết trùng ở bò tại Đức.Năm 1879, Tousain phát hiên bệnh tụ huyết trùng ở gà.Năm 1880, Louis Pasteur, nhà vi trùng học người Pháp đã phát hiện được vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng ở gà (Fowl cholera)Năm 1881, Gaffky phát hiện bệnh ở thỏ và đặt tên là bệnh bại huyết (Septicaemia disease).Trevissan đã đề nghị đặt tên chung cho nhóm vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng là Pasteurella để tưởng nhớ đến nhà bác học Louis Pasteur.Năm 1939, Rosenbusch và Merchant đã đề nghị đặt tên chung cho vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng là Pasteurella multocida để thể hiện khả năng gây bệnh cho nhiều loài vật của vi khuẩn này.Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùngGà bị mắc bệnh tụ huyết trùngBò chết do bệnh tụ huyết trùngVài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùngLịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Viêt Nam.Ở Việt Nam, bệnh tụ huyết trùng trâu, bò được phát hiện lần đầu tiên năm 1798. Từ đó, bệnh được thấy ở khắp các vùng trong nước.Năm 1994, Dương Thế Long đánh giá hiệu quả những biện pháp phòng trị bệnh tụ huyết trùng ở Sơn La trong giai đoạn 1990-1993, khảng định: tiêm phòng bệnh tụ huyết trùng là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng hàng đầu.Năm 1995, Nguyễn Ngã nghiên cứu tính kháng nguyên và độc lực vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò ở khu vực miền trung nhằm chọn giống vi khuẩn địa phương thích hợp có khả năng kết hợp với giống vi khuẩn nước ngoài để chế tạo vắc-xin có hiệu lực cao.Năm 1996, Nguyễn Thu Thiên và Nguyễn Ngã đã phân lập và xác định các type huyết thanh Pasteurella multocida ở trâu bò nuôi tại miền trung Việt Nam.Năm 2000, Đinh Duy Kháng và Lê Văn Phan đã ứng dụng kỹ thuật PCR để định type vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập ở miền trung Việt Nam. HB1, HB2 và HS1, HS2 là hai cặp mồi được dung để xác định Pasteurella multocida gây bại huyết, xuất huyết.Tiêm phòng bệnh tụ huyết trùng là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng hàng đầu.Đặc điểm vi khuẩn Pasteurella multocida.Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Pasteurella multocida.Đặc tính hình thái của vi khuẩn Pasteurella multocida. Tính bắt màu của vi khuẩn Pasteurella multocida. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Pasteurella multocida.Đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida. Đặc điểm vi khuẩn Pasteurella multocida.Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Pasteurella multocida.	Vi khuẩn Pasteurella nằm trong bộ Eubacteriales, thuộc họ Parvobacteriaceae, thuộc giống Pasteurella và chia làm ba loài, trong đó có loài gây bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm là: Passteurella multocida và Pasteurella haemolytica. Đặc điểm vi khuẩn Pasteurella multocida.Đặc tính hình thái của vi khuẩn Pasteurella multocida.	Pasteurella multocida là một cầu trực khuẩn nhỏ, có kích thức 0,25 -0,4 × 0,4 -1,5 μm. Vi khuẩn có giáp mô, không sinh nha bào, không lông, không di động.	Trong canh khuẩn thường thấy vi khuẩn hình trứng, hình cầu, đứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Trong canh khuẩn già, vi khuẩn suy yếu, biến dạng, thay đổi hình thái như hình gậy, dùi cui, quả đấm, kích thước lớn hơn bình thường, có khi dài 2-3 μm hay hơn nữa. Vi khuẩn Pasteurella multocidaĐặc điểm vi khuẩn Pasteurella multocida.Đặc điểm vi khuẩn Pasteurella multocida.Tính bắt màu của vi khuẩn Pasteurella multocida.Pasteurella multocida bắt màu Gram âm với thuốc nhuộm gram.dễ bắt màu với thuốc nhuộm aniline, tốt nhất là Methylen blue, đỏ Fucsin, có thể thấy khi dùng phương pháp nhuộm Giemsa và Wright. Các chủng có hình thành giáp mô thì có thể dùng phương pháp nhuộm Hiss và ZilnelsonTrong cơ thể gia súc mắc bệnh (máu và phủ tạng) và trong môi trường mới nuôi cấy, vi khuẩn Pasteurella khi nhuộm màu có hiện tượng bắt màu sẫm ở hai đầu => Pasteurella multocida là vi khuẩn lưỡng cực.Đặc điểm vi khuẩn Pasteurella multocida.	Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Pasteurella multocida được tổng kết lại thông qua bảng sauĐặc điểm vi khuẩn Pasteurella multocida.Đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida. Đặc tính kháng nguyên của Pasteurella multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Kháng nguyên của Pasteurella multocida có 2 loại chính là kháng nguyên vỏ K và kháng nguyên thân O.Pasteurella multocida có tính kháng nguyên giao hỗ (tương đồng kháng nguyên) Đặc điểm vi khuẩn Pasteurella multocida.Đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen).-	Kháng nguyên vỏ K bao xung quanh thân vi khuẩn, che chở cho kháng nguyên O khỏi bị thực bào tác động. Đồng thời kháng nguyên K ngăn cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên O với kháng thể O. Do đó, muốn phát hiện kháng nguyên O phải phá hủy kháng nguyên K. Kháng nguyên K chỉ có ở vi khuẩn P. multocida tạo khuẩn lạc dạng S, không có ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng nhầy (M) và xù xì (R).Có 5 type kháng nguyên thân là A, B, D, E và FĐặc điểm vi khuẩn Pasteurella multocida.Đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida. Kháng nguyên thân O (Somatic antigen).-	Kháng nguyên O có hai nhóm, đặc hiệu và không đặc hiệu. Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ khác nhau về kháng nguyên O. Chỉ có serotype B là hầu như đồng nhất thuộc một nhóm kháng nguyên O.-	Kháng nguyên O có hai hệ thống phân loại:	+ Phân loại của Namioka và Murata (1961) kháng nguyên O có 12 yếu tố.	+ Phân loại của Heddleston (1972) kháng nguyên O có 16 yếu tố, được đánh dấu từ 1-16.Đặc điểm vi khuẩn Pasteurella multocida.Đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida. Xác định type kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida.Vi khuẩn Pasteurella multocida mọc dễ dàng trên các môi trường nhân tạo vì vậy việc chuẩn đoán vi khuẩn không có khó khăn gì đặc biệt. Tuy nhiên để xác định chính xác type kháng nguyên của vi khuẩn đó thì lại khá phức tạp khi sử dụng các kỹ thuật thông thường. 	Việc xác định type kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính, ngưng kết trong ống nghiệm, kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch (agar gel precipitation test, AGP) và bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu.	Ngày nay, việc giám định vi khuẩn có thể được thực hiện nhờ sự trợ giúp của các kỹ thuật phân tử như: kỹ thuật PCR, kỹ thuật RT-PCR, kỹ thuật phân tích thành phần protein của vi khuẩn trên bản gelMột số phương pháp chuẩn đoánGiám định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B bằng kỹ thuật PCR.Xác định serotype vi khuẩn Pasteurella multocida bằng phương pháp nested-PCR.Phân tích thành phần protein của vi khuẩn trên bản gel.Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong việc chuẩn đoán phân biệt Pasteurella multocida serotype A:1, A:3, B:2.Một số phương pháp chuẩn đoánGiám định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B bằng kỹ thuật PCR.Trong quy trình chuẩn đoán này người ta sử dụng 2 cặp mồi.Cặp mồi HSB	KTT72	5’-AGGCTCGTTTGGATTATGAAG-3’	KTSP61	5’-ATCCGCTAACACTCTC-3’	(Townsend và cs., 1998)Cặp mồi B capsule type (CAPB)	CAPB-FWD	5’-CATTTATCCAAGCTCCACC-3’	CAPB-REV	5’-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3’	(Townsend và cs., 2001)Với 2 cặp mồi HSB và CAPB sản phẩm DNA tương ứng được tạo ra có kích thước tương ứng là 620 bp và 720 bp (Townsend và cs., 2001).Một số phương pháp chuẩn đoánXác định serotype vi khuẩn Pasteurella multocida bằng phương pháp nested-PCR.Trong phương pháp này người ta sử dụng 2 cặp mồi:Cặp mồi chung được thiết kế dựa vào vùng bảo tồn của loài Pasteurella multocida, không chuyên biệt cho serotype nào cả.	Sp6 promoter:	5’-TATTTAGGTGAGACTATAG-3’	T7 promoter: 	5’-TAATACGACTCACTAT-3’Cặp mồi riêng cho vùng mã hóa chuyên biệt của một serotype nào đó	KMT1SP61: 	5’-ATCCGCTAACACACTCTC-3’	KMT1T72:	5’-AGGCTCGTTTGGATTATGAAG-3’Đầu tiên với cặp mồi Sp6 promoter và T7 promoter, đoạn gene của vùng bảo tồn sẽ được nhân lên với một số lượng nhất định trong lần chạy PCR thứ nhất. Ở lần chạy PCR thứ hai, với cặp mồi KMT1SP61 và KMT1T72, đoạn gene chuyên biệt của serotype B sẽ được khuếch đại cho phép xác định serotype của vi khuẩn.Một số phương pháp chuẩn đoánXác định serotype vi khuẩn Pasteurella multocida bằng phương pháp nested-PCR.Trong kỹ thuật này người ta có thể sử dụng 2 cặp mồi sau:Cặp mồi thứ nhất là cặp mồi chung được thiết kế áp dụng cho vùng bảo tồn.	PmCapComAni-F: 	5’-TATTTTATGGCTTGTTGTGA-3’	PmCapComAni-R: 	5’-CTTTTTGTTTCATTTGGACTG-3’Cặp mồi thứ hai chuyên biệt cho một serotype Pasteurella multocida.	KMT1T7:	5’-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’	KMT1SP6:	5’-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’Một số phương pháp chuẩn đoánPhân tích thành phần protein của vi khuẩn trên bản gel.Việc phân tích thành phần protein của vi khuẩn được thực hiện trên gel SDS-PAGE. Các chủng vi khuẩn được pha thành dung dịch huyền phù có nồng độ khoảng 5x109 cfu/ml, trộn với dung dịch đệm 15% β-mecapthoethanol.Việc phân tích thành phần protein của vi khuẩn cho phép ta nhận biết các chủng Pasteurella multocida.Những nghiên cứu của Lugtenberg và cộng sự (1984) cho thấy có 3 loại protein màng ngoài khác nhau và kí hiệu chúng là I, II, III. Các protein này thay đổi trọng lượng phân tử từ 28.000 đến 48.000 daltons. Tuy những protein màng ngoài này dường như không có mối liên quan tuyệt đối với các chủng gây bệnh, nhưng theo tác giả thì những chủng Pasteurella multocida có lớp protein màng ngoài thuộc loại I sẽ có thể là chủng gây bệnh. Trong khi đó nếu thuộc loại II thì sẽ có thể là những chủng không gây bệnh.Một số phương pháp chuẩn đoán	Điện di protein vi khuẩn P. multocida trên thạch Polyacrylamide 10%-	Cột 1 và 8: Trọng lượng protein chuẩn-	Cột 1 đến 7: Dịch chiết protein các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida.Một số phương pháp chuẩn đoánSử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong việc chuẩn đoán phân biệt Pasteurella multocida serotype A:1, A:3, B:2.Đây là sự kết hợp giữa kỹ thuật PCR và kỹ thuật cắt phân đoạn đa hình RFLPKỹ thuật PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) là một kỹ thuật mà trong đó trình tự ADN biến thể được xác định bằng cách khuếch đại thông qua kỹ thuật PCR. Tiếp theo đó sản phẩm của quá trình PCR sẽ được phân cắt bởi một endonuclease hạn chế. Các phân đoạn DNA khác nhau về kích thước và sẽ được phân tách trên gel agarose / gel acrylamide.PCR-RFLP là một kỹ thuật PCR-REA (Polymerase chain reaction-restriction enzyme analysis) đã được chuẩn hóa để phân biệt Pasteurella multocida serotype A: 1, A: 3 và B: 2.Một số phương pháp chuẩn đoánSử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong việc chuẩn đoán phân biệt Pasteurella multocida serotype A:1, A:3, B:2.Vật liệu và phương pháp:-	Pasteurella multocida chủng DP1 và FP1 cô lập tại Kerala, Ấn Độ serotyped là A: 1 do Viện Nghiên cứu thú y, Izatnagar, Ấn Độ cung cấp.	Pasteurella multocida chủng LKO serotypes A: 3, B: 2 do Viện Nghiên cứu thú y, Izatnagar, Ấn Độ cung cấp nhằm hình thành các chủng tham khảo cho nghiên cứu này.Hai oligonucleotides dựa theo trình tự của P. multocida X-73 ompH gene, U50907 (Luo et al ., 1997)	Trình tự hai mồi như sau:	OmpH 1:	5'-GCG TTT CAT TCA AAG CAT CTC-3‘	OmpH 2:	5'-ATG ACC GCG TAA CGA CTT TC -3‘	Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi trên để khuếch đại đoạn trình tự OmpH gen của Pasteurella multocida.Một số phương pháp chuẩn đoánSử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong việc chuẩn đoán phân biệt Pasteurella multocida serotype A:1, A:3, B:2.Vật liệu và phương pháp:-	Enzyme giới hạn phân tích sản phẩm OmpH-PCR: Các sản phẩm PCR khuếch đại sẽ được phân cắt bởi các enzym cắt hạn chế Dra I và Hinf I. (ở 370C trong hai giờ, sau đó là bất hoạt các men tiêu hóa ở 800C trong 20 phút). Điện di các kết quả của enzyme cắt giới hạn được tiến hành trên gel acrylamide 8%. Gels được xem trên một transilluminator và chụp ảnh.Một số phương pháp chuẩn đoánSử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong việc chuẩn đoán phân biệt Pasteurella multocida serotype A:1, A:3, B:2.Kết quả:-	Các cặp mồi OmpH 1 và OmpH 2, được thiết kế để khuếch đại gen OmpH của Pasteurella multocida thành công với tất cả các serotypes A:1, A:3 và B: 2. Các sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 1000bp.	Đặc trưng của mồi: Cặp primer OmpH 1 và OmpH 2 đã chỉ chuyên biệt cho đoạn OmpH của vi khuẩn Pasteurella multocida.-	Phân tích hạn chế của các sản phẩm khuếch đại của serotypes A: 1, A: 3 và B: 2 đã được tiến hành bằng cách sử dụng cùng một enzyme cắt giới hạn Dra I và Hinf I. Enzyme Hinf I tạo ra mô hình tương tự như ở A: 3 và B: 2 nhưng khác biệt từ A: 1, trong khi Dra I đã cho các cấu hình khác biệt với nhau cho ba serotypes.Các cặp mồi OmpH 1 và OmpH 2, được thiết kế để khuếch đại gen OmpH của Pasteurella multocida thành công với tất cả các serotypes A:1, A:3 và B: 2. Các sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 1000bp.	Phân tích hạn chế của các sản phẩm khuếch đại của serotypes A: 1, A: 3 và B: 2 được tiến hành bằng cách sử dụng cùng một enzyme cắt giới hạn Dra I và Hinf I. 	Enzyme Hinf I tạo ra mô hình tương tự như ở A: 3 và B: 2 nhưng khác biệt từ A: 1, trong khi Dra I đã cho các cấu hình khác biệt với nhau cho ba serotypes.Một số phương pháp chuẩn đoánSử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong việc chuẩn đoán phân biệt Pasteurella multocida serotype A:1, A:3, B:2.Kết quả:-	REA sản phẩm khuếch đại của OmpH-PCR với Dra I tạo ra các cấu hình riêng biệt cho ba serotypes A: 1, A: 3 và B: 2, trong khi Enzyme Hinf I tạo ra mô hình tương tự ở A: 3 và B: 2 nhưng khác biệt ở A: 1 . Vì vậy, REA sản phẩm khuếch đại của OmpH-PCR với Dra I cung cấp một kỹ thuật lý thuyết cho sự khác biệt giữa các serotype của Pasteurella multocida. Nếu mô hình duy nhất cho tất cả các serotypes có thể được xác định một cách tương tự thì chúng ta có thể có một kỹ thuật serotyping đơn giản, nhanh chóng và có thể được thực hiện trong bất kỳ phòng thí nghiệm có năng lực để thực hiện PCR. KẾT LUẬN Bệnh tụ huyết trùng là một bệnh nhiễm khuẩn có độc lực cao ở gia súc gia cầm, do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra. Bệnh gây thiệt hại lớn cho nền kinh tế chăn nuôi trên toàn thế giới.Ngày nay với kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, đặc biệt là kỹ thuật gene đang rất phát triển thì chuẩn đoán vi khuẩn Pasteurella multocida (tác nhân gây bệnh tụ cầu huyết) đã không còn là khó khăn nữa. Một số kỹ thuật gene điển hình được sử dụng trong chuẩn đoán vi khuẩn Pasteurella multocida:-	PCR (Polymerase Chain Reaction)-	nested-PCR-	RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)-	PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism)TÀI LIỆU THAM KHẢOCông nghệ sinh học trong thú y – Nguyễn Ngọc Hải, nhà xuất bản nông nghiệp.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY về các bài báo có liên quan.Bài báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.06, nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vaccine nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc, gia cầm và kỹ thuật gene xác định type virus lở mồm long móng, chủ nhiệm đề tài: TS. Tô Long Thành. 6102, 19/09/2006. ( các từ khóa Pasteurella multocida, tụ huyết trùng, Fowl cholera, Septicaemia disease, PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism)Rất cảm ơn các bạnvì đã quan tâm theo dõi!