Bài giảng Kỹ thuật sinh học phân tử và bệnh viêm não xốp ở bò (Bovine spongiform encephalopathy - Bse)

KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ BỆNH VIÊM NÃO XỐP Ở BÒ (Bovine Spongiform Encephalopathy - BSE) GVHD: PGS.TS Nguyễn Ngọc HảiNgười thực hiện: Trịnh Thị Huyền TrangI/ ĐẶT VẤN ĐỀThời gian gần đây bệnh bò điên gây ra những tổn thất rất lớn đối với nền nông nghiệp các nước cũng như gây nên những xáo trộn trong đời sống của con người. Trên hình giải phẫu bệnh não có các lỗ thủng lỗ chỗ ( nên được tả là não thể xốp).Vì thế người ta gọi là bệnh xốp não bò (Bovine Spongiform Encephalopathy - BSE) hay vẫn được gọi là bệnh bò điên (Mad Cow desease). II/TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1. Giới thiệu về bệnh viêm não xốp.2.1.1. Nguồn gốc.Năm 1732, các nhà khoa học thú y ở nước Anh đã quan sát thấy một dạng bệnh bí hiểm này xảy ra với cừu. Tên bệnh – Scrapie.Năm 1920: bệnh CJD (Creutzfeldt – Jakob) được mô tả lần đầu tiên ở Anh, có 2 bệnh nhân chết với triệu chứng tâm thần nên người ta gọi là dạng bệnh bò điên ở người. Năm 1947, phát hiện ra bệnh xốp não ở chồn TME.Năm 1956. phát hiện bệnh Kuru ở người.Năm 1986, Jeffrey và Wells đã phát hiện một loại bệnh mới ở bò hoang ở Anh. Năm 1987, Wells và các cộng sự cũng phát hiện và mô tả một loại bệnh là “ Bệnh viêm não thể xốp ở bò ( Bovine Spongiform Encephalopathy - BSE).2.1.2. Sự lưu hành.Bệnh bò điên bắt nguồn từ nước Anh vào giữa những năm 80 của thế kỷ 20, kéo dài sang những năm 90 với trên 160.000 ca mắc bệnh trong khoảng 30.000 đàn bò. Hầu hết trường hợp bệnh là ở giống bò sữa Holstein/ Friesian.2.1.3. Tác nhân gây bệnh. Stomley Prusimerr dùng chất chiết xuất từ não của cừu bị bệnh, phá huỷ axit nucleic (đồng thời cả AND và ARN) mà vẫn không làm mất khả năng gây bệnh của chất chiết khi tiêm chất chiết này sang não động vật khác. Ngược lại nếu phá huỷ Protein của chất chiết thì khả năng gây bệnh không còn. S.Prusiner cho rằng tác nhân gây bệnh có bản chất là Protein và ông đặt tên nó là Prion (proteinaceous infection particle) . Xác định chuỗi của protein gây bệnh này cho thấy nó giống hệt cấu trúc của protein PrPc, và được đặt tên là PrPsc. Normal and diseased prionsPrPc là protein với cấu trúc khoảng 253 ạcid amin ở người và 250 acid amin ở các loài hữu nhũ khác . Nó được kiểm soát bởi một gene ở nhiễm sắc thể số 2 ở chuột và nhiễm sắc thể số 20 ở người. Gene này chứa 2 exon, trong đó exon thứ 2 mã hóa toàn bộ trình tự protein. Nghiên cứu bằng quang phổ cho thấy PrPc chủ yếu có cấu trúc xoắn alpha trong khi PrPsc có chủ yếu cấu trúc xoắn beta và giảm cấu trúc alpha. Vai trò của PrPc vẫn chưa được hiểu rõ. Cắt bỏ gene mã hóa PrPc ở chuột (gen Prnp) vẫn không ảnh hưởng tăng trưởng của thú.2.2. Các đặc điểm về dịch tễ.2.2.1. Ổ chứa mầm bệnh.Ổ chứa chính là các lò mắc bệnh bò điên và bột thịt bột xương của các lò này. Ngoài ra còn ở thịt và óc cừu mắc bệnh gãi ngứa.2.2.2. Bệnh lý.Thời kì ủ bệnh: BSE có thời kì ủ bệnh khá dài, thường là trên 18 tháng. Tính cảm nhiễm và sức đề kháng. Bê non và bò dưới 3 năm tuổi ít bị cảm thụ với bệnh hơn là bò trưởng thành. Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là bò từ 4 năm tuổi trở lên. Trong một đàn bò thì tỷ lệ mắc bệnh rất thấp. Đó là điều đặc biệt khác với các bệnh truyền nhiễm khác. Bệnh tíchTriệu chứng lâm sàng khác nhau nhưng thuộc 3 loại:Thay đổi về hành vi.Thay đổi về tư thế, dáng đi, và các vận động khác.Tăng nhạy cảm.Các biến đổi bệnh lý học chỉ thấy được dưới kính hiển vi (các thoái hóa đối xứng ở 2 bên não, có thoái hóa không bào ở tế bào chất ở phần chất xám. Khi quan sát dưới kính hiển vi một miếng cắt từ não, có cảm giác như nhìn mặt cắt miếng bọt biển ( đệm mút), vì thế có tên gọi là bệnh viêm não dạng xốp. Vị trí bệnh tích thường gặp nhất là ở hành tủy, chiếm 99% trường hợp. 2.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định bệnh viêm não xốp ở bòNgười ta dùng các acid nucleic hiện diện (Circulating nucleic acids (CNA)) để phát hiện yếu tố SINEs (cell stress-related short interspersed nucleotide elements) trong huyết thanh gia súc liên quan đến bệnh BSE. Thu nhận huyết thanh Lấy máu cho vào tube nhựa 18ml được giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Ly tâm với 1000g trong 15 phút. Huyết thanh nổi trên mặt được chuyển vào trong những cái chén ly tâm nhỏ 1.5 ml vào phân chia đều thành 0.5-ml và bảo quản lạnh ngay lập tức ở 20° C hoặc 80° C.Chuẩn bị những phần nhỏ huyết thanhHuyết thanh đông lạnh được xả ở 4 ° C trong nước đá và 250 μL được chuyển thành những ống ly tâm nhỏ 1,5-ml Ống được ly tâm 4000 vòng trong 25 phút Phần nổi trên mặt được chuyển vào một ống sạch và ly tâm 2000 vòng trong 35 phút.Tách chiết Nucleic acid : Sử dụng 20.000 × g bột viên với một silica chuẩn dựa trên chiết xuất axit nucleic theo hướng dẫn của nhà sản xuất . Các axit nucleic được sử dụng ngay lập tức hoặc đông lạnh ở -80 ° C.Primers:. CHX-1F và CHX-1R Giải trình tự20-μL PCR với 30-35 chu kỳ ở 48 - 55°C bắt cặp (60 seconds), 68°C kéo dài (2 min), and 94°C biến tính (1 min) Mẫu lấy từ các trường hợp bị bệnh BSE , bò khỏe mạnh làm đối chứng được phủ lên polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Band được cắt ra khỏi gel, tách rửa . Kết thúc bằng polymerase T7 DNA và phosphoryl hóa với polynucleotide kinase và ATP. Hỗn hợp phản ứng này đã được sử dụng cho việc thắt đầu bằng vào một enzyme tiêu hóa SmaI, vector pGEM-4Z khử gốc phospho .Ủ qua đêm ở 4 ° C bằng cách sử dụng 1 U T7 DNA ligase, 1 μg của véc tơ, và các sản phẩm PCR . Sản phẩm này được chuyển vào Escherichia coli và phủ trên TAXI LB-agar có chứa tetracyclin, ampicillin, 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside (X-Gal), và isopropylthiogalactopyranoside (IPTG).Sau khi ủ qua đêm ở 37 ° C, những dòng dương tính được chọn và nuôi cấy trong môi trường LB 1,5 ml với ampicillin BLAST phân tích. sử dụng 3 μL của dịch chiết nucleic acid không cần tiền xử lý Dnase trong tổng số 20 μL. Sử dụng mồi CHX-1F và CHX-1R Sau 30 chu kỳ / 95 ° C trong 30 giây, 55 o C trong 45 giây, và 68 ° C trong 1 phút, SybrGreen được ghi lại trong một MX4000 PCR hệ thống.Điện di.Tám μL của hỗn hợp PCR đã được trộn lẫn với đệm và cho vào một gel polyacrylamide đúc sẵn 12-20% trong đệm Tris-borat-EDTA (45 mM Tris, 45 mM acid boric, 1 mM EDTA) (4 đến 20% Tris - borat-EDTA gel. Điện di ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong 45 phút tại 180 V. Các gel được nhuộm màu cho 20 phút trong một giải pháp và chụp ảnh dưới tia UV..Kết quả.Một mồi bắt nguồn từ một vùng sine 3 '(CHX-1R) được đánh giá bởi PCR tách từ huyết thanh gia súc khỏe mạnh và bệnh. Mẫu của bò bị bệnh BSE , những động vật thân cận có nguy cơ mắc BSE , và động vật khỏe được sử dụng Một cặp mồi (CHX-1F/CHX-1R) cho thấy không có phản ứng với nhóm đối chứng là động vật khỏe mạnh, nhưng đã khuếch đại, phù hợp với BSE-tiếp xúc với gia súc. CHX-1F/CHX-1R đã được sử dụng để khuyếch đại CNA từ hai mẫu có bệnh BSE, huyết thanh chứa đối chứng âm của PrPre , những con bò đối chứng khỏe mạnh.Hiện nay người ta sử dụng phương pháp immuno-polymerase chain reaction (IPCR) để phát hiện sự hiện diện của PrPsc. IPCR là một kỹ thuật nhờ đó mà khả năng khuếch đại của PCR là đi đôi với phát hiện của các protein do kháng thể trong một định dạng ELISA. Khả năng phát hiện nhạy cảm gấp 1.000.000 lần so với mức phát hiện bởi western blot hoặc ELISA. Sơ đồ của các kỹ thuật IPCRIII. KẾT LUẬNBệnh viêm não xốp ở bò là một bệnh truyền nhiễm khá đặc biệt mới được phát hiện ở Anh vào nửa cuối thập kỷ 80.Tác nhân gây bệnh còn nhỏ hơn cả virus gọi là prion là các tiểu phần protein có khả năng gây nhiễm. Kỹ thuật PCR được dùng được dùng để phát hiện yếu tố SINEs (cell stress-related short interspersed nucleotide elements) một đoạn ngắn các nucleotide có tính mất ổn định hiện diện ở vùng trung tâm bảo toàn của PrPc Sử dụng một cặp mồi (CHX-1F/CHX-1R) cho thấy không có phản ứng với nhóm đối chứng là động vật khỏe mạnh nhưng có phản ứng với nhóm mang bệnh BSE. Ngoài ra người ta còn sử dụng kỹ thuật IPCR là một kỹ thuật nhờ đó mà khả năng khuếch đại của PCR là đi đôi với phát hiện của các protein bệnh cho kháng thể trong một định dạng ELISA. IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO.Trần Thị Dân, ,2005,công nghệ sinh học trong chăn nuôi gia súc, NXB Nông nghiệp.1.