Tiểu luận Kỹ thuật Elisa trong chẩn đoán virus Gumboro - Nguyễn Trần Lâm Thanh

	BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO	TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM	BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC	LỚP: DH06SHGiảng viên hướng dẫn:	 Sinh viên thực hiện:PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải.	 Nguyễn Trần Lâm Thanh.	 	 MSSV: 06126131 SEMINARKỸ THUẬT ELISATRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORONỘI DUNGPhần 1: Đặt vấn đề.Phần 2: Tổng quan	I. Giới thiệu bệnh Gumboro.	1. Bệnh gumboro là gì?	2. Vai trò túi Fabricius.	3. IBDV	4. Đặc biểm bệnh Gumboro.	II. ELISA – Enzym-Linked Immunosorbent Assay 	III. Kỹ thuật ELISA trong chẩn đoán virus Gumboro	1. ELISA phát hiện IBDV ở những tỷ lệ pha loãng 	 khác nhau của huyết thanh.	2. FLOCKSCREEN™ Infectious Bursal Disease 	 Antibody ELISA kitPhần 3: Kết luận.Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀTrong vài thập kỷ qua, công tác chọn giống đã cải thiện một cách đáng kể thành tích sản xuất, chăn nuôi gà:	+ Tăng trưởng nhanh 	+ Hiệu quả sử dụng thức ăn cao	+ Khả năng sản xuất thịt tốt 	+ Tỷ lệ thịt ngực caoNhưng khả năng miễn dịch vẫn không tăng gà bị mắc nhiều bệnh về rối loạn chuyển hóa, bệnh truyền nhiễm.Trong đó, có thể kể đến bệnh Gumboro (suy giảm miễn dịch ở gà ) – do Infectious bursal disease virus (IBDV) gây ra, một lọai virus thuộc họ Birnaviridae, serotype 1, chúng có khả năng phá huỷ túi Fabracius.Do tính chất gây bệnh đặc trưng của virus là lây lan rất nhanh, không thể kiểm soát bằng hóa chất hay bất kỳ phương thuốc nào mà chỉ có thể khắc phục bằng biện pháp phòng trừ thiệt hại do IBDV gây ra là rất đáng kể.Với sự phát triền vượt bậc của CNSH, các kỹ thuật phân tử trong chẩn đóan bệnh có thể giúp chẩn đóan nhanh, chính xác nhiều bệnh do virus. Trong đó có kỹ thuật ELISA.Phần 2: TỔNG QUANI. Giới thiệu bệnh Gumboro:1. Bệnh Gumboro là gì? Bệnh do Cosgrove phát hiện lần đầu tiên vào năm 1962 tại Gumboro ( Delaware Hoa Kỳ )1970, Hitchner đề nghị lấy tên chính thức cho căn bệnh này là Infectious bursal disease (IBD) - bệnh Gumboro và virus gây ra bệnh là Infectious bursal disease virus(IBDV).Bệnh rất dễ lây lan trong đàn gà con. Đặc trưng của bệnh là làm suy giảm hệ thống miễn dịch của gà và tỷ lệ tử vong thường từ 3-6 tuần tuổi. 2. Vai trò của túi Fabricius :a. Cấu tạo:Là tổ chức lympho dạng túi, nằm liền sát lổ huyệt.Cấu tạo từ biểu mô có nếp gấp, gồm khoảng 12.000 nang lympho. Trọng lượng của túi thay đổi tùy theo tuổi. Cấu tạo vi thể, mỗi nang lympho gồm 2 phần:	+ Phần vỏ: chứa một lượng lớn lymphocytes, lymphoblaste đang trong thời kỳ gián phân, các đại thực bào, hệ thống mạch máu 	+ Phần tủy: chứa các lymphocyte, các đại thực bào, bạch cầu và các tế bào mầm. Sau giai đoạn phát triển phôi, khi gà nở, túi tiếp tục phát triển và cho đến tận tháng thứ 4 túi bắt đầu teo lại, tháng 11-12 mất hẳn.Một số dấu hiệu thoái hóa đặc trưng: ( quan sát từ tuần tuổi 24 )	+ Lớp biểu mô teo lại và tróc ra.	+ Các nếp gấp mất dần.	+ Phần tủy thoái hóa và sự xuất hiện các 	 nang.	+ Sự phát triển của các mô liên kết của bộ 	 khung.b. Vai trò:Các tế bào nguồn có bên trong túi, trong giai đọan phát triển phôi (khoảng từ ngày thứ 8 đến 15) chúng sẽ tự dị biệt (dưới tác động của quá trình tiếp xúc với các tế bào lưới biểu mô và sự hiện diện của các chất chiết xuất polypeptide trong túi ) hình thành nên các tế bào có mang kháng thể ( IgM - ngày thứ 12, IgG - ngày thứ 14, IgA - ngày thứ 16)Các tế bào miễn dịch này sẽ di chuyển ra khỏi túi trong suốt thời kỳ phát triển sau phôi và cuối thời gian này để đi đến các cơ quan ngoại vi ( lách, ruột.)3. IBDV :Thuộc loàI Avibimavirus của họ Birnaviridae. Có cấu trúc mạch đôi RNA dạng cuộn tròn, nhiều góc cạnh, kích thước 55-65nm.Virus dạng trần, không có vỏ bọc ngoài.Có 2 dạng serotypes, nhưng chỉ có serotype 1 là nguyên nhân gây ra bệnh cho gia cầm. Bộ gen chứa 2 mạch: A và B, được bao bọc trong một vỏ capsid ( gồm 32 capsomer. Mỗi capsomer được tạo bởi 5 loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral Protein-VP))	+ Mạch B (2.9kb) mã hóa cho VP1 (có hoạt tính enzym RNA- polymerase xúc tác quá trình tổng họp RNA của virus.)	+ Mạch A lớn hơn (3.2kb) gồm 2 cấu trúc gen tổng hợp protein. Cấu trúc thứ nhất là một khung đọc mở đa gen ( poly-cistronic open reading frame) mã hóa cho một “tiền protein”, mà trong quá trình kế tiếp sẽ được phân cắt thành các protein cấu trúc có tên gọi VP2, VP3, VP4. và một cấu trúc mã hóa cho VP5.( có trọng lượng phân tử khá bé (17kDa) mới được phát hiện gần đây, có chức năng trong quá trình điều hòa sao chép và tổng hợp protein.)VP2 là protein kháng nguyên bảo vệ vật chủ vì kích thích tạo kháng thể, đồng thời cũng là yếu tố độc lực của IBDV. VP3 kích thích cơ thể sản sinh kháng thể kết tủa (mà các serotypes 1 và 2 đều kích thích sản sinh được.) VP3 được sử dụng làm kháng nguyên kết tủa để phân biệt IBDV với các virus khác. VP4 có chức năng protease cắt rời tiền protein tạo nên các protein độc lập.VP5 có vai trò điều hòa tổng hợp ARN và tiến triển gây bệnh IBDV có sức đề kháng với Ether, Chloroforn, kém đề kháng với Formalin và Chloramin. Virus có sức chịu nhiệt tốt (có thể sống sót sau khi xử lý nhiệt ở nhiệt độ 56OC trong 5h hoặc ở nhiệt độ 37OC hàng ngày)4. Đặc điểm bệnh Gumboro.Phương thức truyền lây: 	+ Trực tiếp: sự tiếp xúc giữa gà mang mầm bệnh và gà khỏe.	+ Gián tiếp: qua trứng, không khí, hoặc thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi nhiễm mầm bệnh.Cơ chế lây bệnh của IBDV:	+ Virus tấn công vào các tế bào lympho đặc biệt là các tế bào lympho B. 	+ Sau khi xâm nhiễm, chúng phá hủy các nang lympho của túi Fabricius cũng như các tế bào lympho B thứ cấp như GALT, CALT, BALT, tuyến Harderian, Triệu chứng: 	+ Đàn gà uống nhiều nước, sào xạc khi có tiếng động lạ 	+ Cơ vùng hậu môn co bóp nhanh, mạnh, gà có phản xạ như muốn đi ngoài nhưng không thực hiện được	+ Sốt cao, uống nhiều nước  rối loạn tiêu hoá, viêm hoại tử ruột.	+ Phân gà trắng loãng, lúc đầu có màu trắng ngà sau chuyển sang vàng trắng, trắng nhớt đôi khi lẫn máu.	+ Gà bắt đầu chết từ ngày thứ 3 sau khi phát bệnh, tỉ lệ chết tăng nhanh, sau 5 - 7 ngày thì ngưng, những con còn sống sót khỏi bệnh.Hình: Gà bệnh nằm ủ rũ, xù lông Hình: Gà tiêu chảy phân loãng trắng Bệnh tích:+ Xác chết khô, lông xơ xác, chân khô.	+ Túi Fabricius ở giai đầu sưng rất to, xung quanh túi có thủy thũng, túi chuyển từ màu vàng sáng sang trắng đục, các nếp múi khế sưng to không rõ nét,	+ Xung xuất huyết hệ cơ.(nếu xung huyết khi lột da, cơ khô nhanh và có màu thẫm) 	+ Lách sưng nhẹ, thận sưng căng nhưng bệnh tích ở  thận không được coi là điển hình.(Một số trường hợp có huyết ở dạ dày tuyến)	+ Nếu gà nhiễm bệnh đến ngày thứ  5,6,7 thì túi Fabricius nhỏ lại, đến ngày thứ  8 thì chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban đầu.Hình: Túi Fabricius sưng to, đỏ, xuất huyết lấm tấm.Hình: Cơ đùi xuất huyết thành từng vệt.Hình: Xuất huyết trên niêm mạc dạ dày tuyến (chổ tiếp giáp giữa mề và tiền mề).Phòng bệnh:+ Dùng vaccin (tiêm cho gà lúc 1 tuần tuổi, tiêm đàn gà bố mẹ để tạo miễn dịch thụ động cho gà con), 	+ Loại bỏ gà có triệu chứng lâm sàng ngay sau khi chủng vaccin để loại bỏ mầm bệnh.	+ Vệ sinh chuồng trại, thức ăn, nước uống sạch sẽ tránh nhiễm mầm bệnh. 	+ Định kỳ mỗi tuần sát trùng chuồng trại 	+ Cung cấp thêm các sản phẩm bổ sung chất dinh dưỡng, vitamin, chất điện giải nhằm tăng cường sức đề kháng bệnh, chống stress  Điều trị:+ Tăng cường sức đề kháng bằng:	+ Nuôi dưỡng, quản lý, chăm sóc.	+ Cung cấp chất điện giải, vitamin. Điều trị bệnh theo nguyên tắc: hạ sốt + giải độc + trợ lực + chống xuất huyết + loại trừ bội nhiễm các vi khuẩn gây bệnh khác. Vì thấy gà chết chủ yếu do:( Sốt cao, Ngộ độc urat do thận bị tổn thương, Bội nhiễm các loại vi khuẩn khác, Mất nước do tiêu chảy quá nặng.)+ Khi đàn gà mắc bệnh, việc dùng kháng sinh để điều trị càng làm bệnh trở nên trầm trọng, tăng tỉ lệ chết.+ Khi gà bệnh cần cho uống đường glucose và một số loại thuốc hỗ trợ đề kháng như: Vime C Electrolyte, Vimeperos, Vimix Plus, Vimevit Electrolyte, Aminovit, Vitaral.II. Enzym - Linked Immunosorbent Assay ( ELISA):1. Nguyên lý chung của ELISA: Sử dụng 1 enzym để phát hiện sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên ( Antigen-Ag) và kháng thể (Antibody-Ab). Enzym sẽ chuyển cơ chất không màu thành sản phẩm có màu  thấy được sự liên kết giữa Ag-Ab. 2. Các phương pháp ELISA:Có 3 phương pháp chính: ELISA trực tiếp: + Kháng nguyên được pha loãng trong dung dịch đệm (thường là carbonate/bicarbonate ở pH cao 9.6 hay dung dịch PBS trung tính) , cho gắn thụ động vào bề mặt rắn trong quá trình ủ. + Rửa, loại bỏ kháng nguyên không hấp thụ vào bề mặt rắn.+ Kháng thể có gắn enzym được bổ sung vào các vị trí kháng nguyên trên bề mặt rắn. Ủ, kháng thể sẽ gắn kết đặc hiệu với kháng nguyên.+ Rửa lần 2, loại bỏ kháng thể không gắn kết đặc hiệu.+ Bổ sung cơ chất tạo màu + Xác định màu qua máy quang phổ trắc quang, đọc tại một bước sóng phù hợp.+ Ưu điểm : đơn giản nhất.+ Nhược điểm : 	- Độ đặc hiệu bị giới hạn (vì thông thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitop mà trong phương pháp này chỉ sử dụng một kháng thể gắn vào 1 epitop.)	- Tốn công: phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng.ELISA gián tiếp: các bước đầu như ELISA trực tiếp+ Khi kháng nguyên đã hấp phụ trên bề mặt rắn, kháng thể không đánh dấu được bổ sung vào.+ Ủ, rửa bỏ kháng thể không bám vào kháng nguyên.+ Bổ sung kháng thể thứ 2 có gắn enzym + Ủ, rửa bỏ kháng thể không bám.+ Bổ sung cơ chất tạo màu, đọc kết quả.+ Ưu điểm: kháng thể có gắn enzym nên có thể dùng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên tiện lợi, kinh tế, dễ thương mại hóa.+ Nhược điểm: độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm.ELISA sandwich:* ELISA sandwich trực tiếp: + Kháng thể gắn thụ động vào pha rắn.+ Các kháng thể trên sẽ được gắn vào kháng nguyên+ Kháng thể thứ 2 có gắn enzym được thêm vào + Thêm cơ chất tạo màu để tạo màu phản ứng.+ Đọc kết quả bằng máy quang phổ trắc quang * ELISA sandwich gián tiếp: + Tương tự như trực tiếp + Kháng thể thứ 2 thêm vào không gắn với enzym  để phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể ta phải sử dụng một kháng thể khác kháng lại kháng thể thứ 2 có gắn enzym được thêm vào sau đó.III. Kỹ thuật ELISA trong chẩn đoán IBDV:1. ELISA phát hiện IBDV ở những tỷ lệ pha loãng khác nhau của huyết thanh.Kháng nguyên được pha loãng theo tỷ lệ 1:75 với dung dịch đệm,100 µL dịch virus pha loãng được bổ sung cho mỗi giếng.Ủ qua đêm ở 4oCRửa 3 lần với dung dịch PBST. Kháng nguyên bám vào các giếng sẽ được cố định bằng cách sử dụng dung dịch BSA 2%.100µL dung dịch đệm khóa (blocking solution) PBST-BSA được bổ sung vào mỗi giếng, ủ ở 37oC trong 1h,rửa lại ba lần với dung dịch PBST. Mẫu huyết thanh được pha loãng theo tỷ lệ 1:100 với dung dịch PBS và tiếp tục pha loãng hai lần để đạt được các tỷ lệ pha lõang liên tiếp, cho đến khi đạt tỷ lệ 1:12800 thì dừng. Hút 100µL huyết thanh cho vào các giếngỦ ở 37oC trong 1h, rửa 3 lần với dung dịch PBST.Bổ sung 100µL dung dịch pha loãng theo tỷ lệ 1:3000 kháng thể thỏ kháng kháng thể gà pha trong dung dịch PBS. Ủ trong 1h ở 30oC, rửa 3 lần với dung dịch PBST.Thêm 100µL cơ chất tạo màu ( dung dịch ABTS với H2O2)Ủ ở 37oC trong 5 phút. Thêm vào 50µL dung dịch dừng phản ứng SDS 5% Đọc kết quả ở bước sóng 405nm.Tính toán kết quả dựa vào tỷ lệ S/P (tỷ lệ mẫu trên các mẫu dương tính):	Sample OD - Negative ODS/P ratio = 	Positive OD - Negative O Nếu tỷ lệ S/P > 0  mẫu kiểm tra có chứa kháng thể kháng IBDV.Phương trình hồi quy xác định nồng độ kháng thể trong mẫu: 	log 10X= 0.0958 * (log10 S/P ratio) + 3.59362. FLOCKSCREEN™ Infectious Bursal Disease Antibody ELISA kitHình: Sơ đồ hóa tiến trình thí nghiệm.* Các bước tiến hành thí nghiệm:Ðánh dấu vị trí mẫu và đối chứng.Bổ sung 50µl huyết thanh vào mỗi giếng, ủ ở 37oC trong 30ph.Rửa bỏ phần dư thừa, không gắn kết đặc hiệu bằng dung dịch đệm rửa (300µl/giếng).Thêm 50 µl kháng thể thứ cấp có gắn với enzym.Ủ ở 37oCtrong 30phRửa các thành phần dư thừa, không gắn kết đặc hiệu bằng dung dịch đệm rửa(300µl/giếng).Thêm 50µl cơ chất tạo màu phản ứng.Ủ ở 37oC trong 15ph. ( Dung dịch chuyển thành màu hồng nhạt.)Thêm 50µl dung dịch kết thúc phản ứng. Đọc kết quả bằng máy Microtitre Plate Reader ở buớc sóng 550nm trong vòng 15ph sau khi thêm dung dịch dừng phản ứng.Tính toán kết quả dực vào tỷ lệ S/P (tỷ lệ mẫu trên các mẫu dương tính) Công thức hồi quy để tính nồng độ kháng thể trong mẫu như sau:log10X = 0.557 * ( log10 S/P ) + 3.6845 X = 10^[ 0.557 * ( log10 S/P) + 3.6845]Tỷ lệ S/P có thể được lý giải theo như bảng sau:Tỷ lệ S/P Mức IBV Tình trạng tạo kháng thể 0.017 0 – 500> 501 Có thể được chủng ngừaQuá cao để tiêm phòng Phần 3: KẾT LUẬNBệnh Gumboro là bệnh cấp tính của gà do phá huỷ túi Fabracius. giảm khả năng miễn dịch của gà. Lứa tuổi gà mắc bệnh cao nhất là 3 – 6 tuần tuổi, gà nhỏ hơn có thể mắc bệnh ở thể tiềm ẩn, không biểu hiện triệu chứng. là bệnh nguy hiểm, gây thiệt hại rất lớn cho chăn nuôi gà.Do đặc điểm phức tạp của bệnh nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn, đòi hỏi nhiều dụng cụ, trang thiết bị hiện đại. Ngày nay cùng với sự phát triển nhanh chóng và sự hỗ trợ đắc lực của công nghệ sinh học đặc biệt là sinh học phân tử với kỹ thuật chẩn đoán ELISA đã tạo điều kiện thuận lợi cho công tác nghiën cứu, chẩn đoán cũng như phòng trừ bệnh.