Bài giảng Một số kỹ thuật chẩn đoán vi khuẩn leptospira - Lý Sơn Tùng

MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LEPTOSPIRAGiáo viên hướng dẫn: 	Nguyễn Ngọc HảiSinh viên thực hiện: 	 Lý Sơn TùngMSSV: 	 06126178NỘI DUNGLỜI MỞ ĐẦULeptospiraCác kỹ thuật chẩn đoán LeptospiraNuôi cấyMATELISAPCRSo sánh các kỹ thuậtKẾT LuẬNLỜI MỞ ĐẦUVi sinh vật là tác nhân gây bệnh nguy hiểm.Vi khuẩn Leptospira gây bệnh xoắn khuẩn cho vật nuôi, từ đó lây bệnh sang người hay gây bệnh trực tiếp cho người gọi là bệnh Leptospirosis.Các kỹ thuật được trình bày dưới đây bao gồm: nuôi cấy, Microscopic agglutination test (MAT), indirect enzyme – linked - immunosorbent Serologic Assay (ELISA gián tiếp), Polymerase Chain Reaction (PCR)LeptospiraGiới: MoneraNgành: SpirochaetesHọ: LeptospiraceaeGiống: LeptospiraHình thể: rất mảnh, đường kính 0,1- 0,2µm, dài 5- 25µm, hai đầu cong như móc câu, di động mạnh.Nuôi cấy được trong điều kiện hiếu khí. Môi trường lỏng có thêm huyết thanh động vật (thỏ) tươi, pH 7.2- 7.5; nhiệt độ 28-300C và giàu oxy. Leptospira mọc chậm, sau 6- 10 ngày mới phát triển tốt.LeptospiraCơ chế sinh bệnh: Sau khi xâm nhiễm, Leptospira trong máu nhân lên mạnh mẽ và gây bại huyết sau đó chúng đến định vị ở những cơ quan ưa thích, nhất là gan, thận. Leptospira trong giai đoạn bại huyết có thể đến cơ quan sinh dục gây xáo trộn sinh sản.LeptospiraCác bệnh lí:1) Bệnh lí ở bò thường do L. pomona và L. grippotyphosa. Đã thấy nhiều con vật có kháng thể đặc hiệu và không phát bệnh lâm sàng.2) Bệnh lí ở chó do L. icterohaemorrhagiae. Chuột là môi giới truyền bệnh; hoặc lây từ chó sang chó.3) Bệnh lí ở lợn do L. pomona, và cũng do L. mitis và L. icterohaemorrhagiae. Bệnh ở lợn thường tiềm ẩn, hoặc phát dưới thể giảm nhẹ.4) Bệnh lí ở ngựa do L. grippotyphosa, L. pomona, L. canicola.5) Bệnh lí ở người do nhiều type như L. icterohaemorrhagiae, L. grippotyphosa, L. canicola, L. pomona gây raCác nguồn lây bệnh cho ngườiChó bị tiêu chảy ra máuCách phòng chống bệnh là tiêu hủy vật mang bệnhKỹ thuật chẩn đoán LeptospiraNuôi cấyMôi trường: môi trường Ellinghausen, McCullough, Johnson, and Harris – EMJH có bổ sung 3% huyết thanh thỏ và 0.1% agarose trong một ống 5ml.Nuôi cấy từ các mẫu: whole blood, surface plasma (huyết tương bề mặt), deposit from spun plasma và clotted blood (máu ngưng đọng lại)Kỹ thuật chẩn đoán LeptospiraNuôi cấyKết quả:Kỹ thuật chẩn đoán LeptospiraNuôi cấyƯu điểm: thường sử dụng trong công tác nghiên cứu bệnh học phòng thí nghiệm.Nhược điểm:Mất thời gian (khoảng 20 – 30 ngày để nhận kết quả dương tính).Độ nhạy thấp, khả năng thành công không cao khi nuôi cấy. Sau ngày nhiễm bệnh thứ 14, hiếm khi thu được khuẩn lạc.Có thể gây nhiễm cho người.Thường không sử dụng trong xét nghiệm bệnh.Kỹ thuật chẩn đoán LeptospiraMATNguyên tắc chung: Sự ngưng kết được đọc trực tiếp dưới kính hiển vi nền tối.Kỹ thuật chẩn đoán LeptospiraMATKháng nguyên là Leptospira sống (chứa 108 Leptospires/ml) được nuôi cấy trong 4 – 8 ngày ở môi trường nuôi cấy thích hợp.Mẫu huyết thanh lấy từ gia súc được cho vào các giếng với độ pha loãng khác nhau.Cho kháng nguyên sống vào các giếng, lắc nhẹ, ủ ở nhiệt độ 32 – 370C.Chuyển lên vật kính kính hiển vi và đọc kết quả dưới nền tối.Kỹ thuật chẩn đoán LeptospiraMATKết quả:Kết quả dương tính khi 50% kháng nguyên hay hơn có phản ứng ngưng kết. Điểm cuối chuẩn độ xác định bởi giếng cuối cùng mà 50% kháng nguyên hay hơn có phản ứng ngưng kết quan sát thấyDarkfield microscopy of leptospiral microscopic agglutination test. Courtesy of the Centers for Disease Control/Mrs. M. Gatton)Kỹ thuật chẩn đoán LeptospiraMATƯu điểm:Đơn giản.Tiết kiệm thời gian hơn so với nuôi cấy tế bào.Thích hợp cho kiểm tra bệnh ở một nhóm hoặc đàn gia súc (ít nhất là 30 con hoặc 10% số con trong một đàn lớn) với nhiều lứa tuổi khác nhau.Nhược điểm:Vẫn mất khá nhiều thời gian.Cần lượng mẫu lớn.Có thể cảy ra các phản ứng chéo giữa các nhóm huyết thanh giống nhau. Kỹ thuật chẩn đoán LeptospiraELISANguyên tắc chung: các kháng nguyên đã biết được gắn lên các giá thể, dung dịch mẫu chuẩn và đối chứng được cho vào các giếng, ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian xác định (tùy theo bộ KIT của nhà sản xuất), sau đó mẫu ủ được rửa và cho tác dụng với kháng kháng thể có gắn enzyme, lại ủ mẫu trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định, rửa mẫu và cuối cùng cơ chất tương ứng với enzyme được cho vào mẫu. Phản ứng giữa enzyme và cơ chất tương ứng nếu xảy ra sẽ tạo màu và cường độ màu tỉ lệ thuận với lượng kháng thể có trong mẫu đặc hiệu với kháng nguyên đã biết.Kỹ thuật chẩn đoán LeptospiraELISAKết quả:Dựa vào tỉ số S/P (Sample value related to Positive Control value) để đọc kết quả:S/P = Âm tính: huyết thanh ≤ 0.05, sữa ≤ 0.03Nghi ngờ: 0.05 0.12, sữa > 0.10Kỹ thuật chẩn đoán LeptospiraELISACác phản ứng xảy ra sẽ tạo màuKỹ thuật chẩn đoán LeptospiraELISAƯu điểm:Phương pháp bán tự động, dễ thực hiện và dễ theo dõi kết quả.Có thể sử dụng bộ KIT để chuẩn đoán nhanh, cùng lúc có thể thực hiện được nhiều test trên mỗi KIT.Có khả năng phát hiện sớm hơn các phương pháp đã nêu trước đó.Độ nhạy, độ đặc hiệu cao, độ chính xác cũng tương đối cao.Sử dụng kháng nguyên đã được giết nên không gây nhiễm cho người trong quá trình thao tác.Nhược điểm:Cần thời gian để kháng thể xuất hiện.Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hay dương tính giả.Kỹ thuật chẩn đoán LeptospiraPCRNguyên tắc chung: được thực hiện dựa trên cơ sở đặc điểm của sự hồi tính, biến tính và kéo dài chuỗi DNA trong điều kiện nhiệt độ và chất xúc tác thích hợp. Giai đoạn 1: biến tính chuỗi DNA ở nhiệt độ 950C trong 5 phút.Giai đoạn 2: nhân bản gene với khoảng 20 – 30 chu kì.Giai đoạn 3: hoàn thành ở 720C trong 5 – 10 phút.Mỗi chu kì gồm 3 bước: biến tính DNA (950C trong 30 giây đến 1 phút), bắt cặp của đoạn mồi với DNA khuôn mẫu (30 – 650C trong 30 – 45 giây), kéo dài chuỗi DNA (65 – 720C trong 1 – 2 phút).Kỹ thuật chẩn đoán LeptospiraPCRKết quả:Kết quả PCR từ mẫu nước tiểu của heo (13): 1. L.pomoma2. L.grippothiphosa 3 . L.ballum4. E.coli5. B. melitensis6. S. aureus7. L. patoc8. S. abortus ovis9. M. bovis10. L. infantumK-no DNA tamplateM-thang 100bpKết quả PCR từ mẫu nước tiểu của người:1. L. interrogans (đối chứng dương)2 và 14. Markers phân tử đánh dấu DIG3 đến 10. Mẫu nước tiểu từ người bệnh.11 đến 13. Mẫu nước tiểu người khỏe mạnh.Kết quả PCR từ các mẫu từ khỉ :1. Thang DNA 100pb2. Nước tiểu3. Thận4. Thận (1:10)5. Đối chứng dương6. Đối chứng âmKết quả PCR từ tinh dịch bò:1. Marker pGem2. Đối chứng từ bò không nhiễm3. Đối chứng từ bò tiền nhiễm4. Nhiễm ngày thứ 75. Nhiễm ngày thứ 106. Nhiễm ngày thứ 147. Nhiễm ngày thứ 218. Nhiễm ngày thứ 289. Nhiễm ngày thứ 3510. Nhiễm ngày thứ 42Kỹ thuật chẩn đoán LeptospiraPCRƯu điểm:Đơn giản, nhanh, nhạy, đặc hiệu.Chi phí thấp.Nhược điểm:Có thể xảy ra hiện tượng dương tính giả.So sánh giữa các kỹ thuậtThí nghiệm công bố năm 1998 của Eliete C. Romero và ctv (mẫu từ dịch não tủy cerebrospinal fluid (CSF) của 103 bệnh nhân) so sánh ba kỹ thuật với nhau, cho kết quả như sau:So sánh giữa các kỹ thuậtNhư vậy độ nhạy của PCR cao hơn hẳn các kỹ thuật khác, tuy nhiên một số mẫu cho kết quả âm tính trong khi chúng có kết quả dương tính ở hai kỹ thuật còn lại.Kỹ thuật ELISA có độ nhạy cao hơn kỹ thuật MAT.PCR và ELISA được đề nghị sử dụng thay thế cho MAT.KẾT LUẬNLeptospira là một loại xoắn khuẩn gây bệnh gọi là Leptospirosis (hay bệnh vàng da). Nguồn lây bệnh cho người và vật nuôi chủ yếu là chuột, ngoài ra thường do tiếp xúc với đất cát hoặc nguồn nước có xoắn khuẩn.Các kỹ thuật chẩn đoán Leptospira đưa ra gồm có nuôi cấy, MAT, ELISA và PCR. Cả bốn kỹ thuật đều có những ưu và nhược điểm của nó. Nhưng nhìn chung, kỹ thuật PCR là có nhiều ưu việt hơn ba kỹ thuật còn lại.TÀI LIỆU THAM KHẢOCông nghệ sinh học trong thú y – Nguyễn Ngọc Hải, nhà xuất bản nông nghiệp.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY về các bài báo có liên quan.www.sciencedirect.com Leptospira Research Laboratorywww.google.com.vn với từ khóa: Leptospira, Leptospirosis, ELISA Leptospira, PCR Leptospira, Microscopic agglutination test, Leptospira blood culture để tìm một số hình ảnh và bài báo có liên quanThe end.